GC на основе обнаружения Aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой для определения микробной остатков в почве

Мы описываем метод протокола для GC на основе анализа aldonitrile ацетат производных глюкозамина и мурамовой кислота извлекается из почвы. Для выяснения химического механизма, мы также представляем стратегию, чтобы подтвердить структуру производной и ионов фрагментов, образующихся при ионизации электрона.

Количественный подход к описанию микроорганизмов имеют решающее значение для более глубокого понимания микробной статус и функции в экосистемах. Современные стратегии для микробной анализа включают в себя как традиционные лаборатории культуры зависит от техники и те, которые основаны на прямых добычи и определение определенных биомаркеров ^{1, 2.} Немногие среди разнообразия микробных видов, обитающих в почве может быть культурным, так культура зависит от метода внедрения значительных смещений, ограничение отсутствует в биомаркеров анализа.

Глюкозамин, mannosamine, галактозамина и мурамовой кислоты, хорошо служили в качестве меры живых и мертвых масса микробов, из них глюкозамин (наиболее распространенный) и мурамовой кислоты (единственным из бактериальной клетки) являются наиболее важными составляющими в почве системы ^{3 , 4.} Тем не менее, отсутствие знаний по анализу ограничивает широкой популяризации среди научных коллег. Среди всех Exiжалить аналитических методов, производных для aldononitrile ацетаты затем GC-анализа стала хорошим выбором в отношении оптимального баланса точность, чувствительность, простоту, хороший хроматографического разделения и стабильности на хранение образец ^5.

Здесь мы представляем подробный протокол для надежной и сравнительно простой анализ глюкозамин и мурамовой кислоту из почвы после их преобразования в aldononitrile ацетаты. Протокол в основном состоит из четырех этапов: кислотного разложения, образец очистки, производных и GC определения. Шаг за шагом процедуры изменение в соответствии с бывшими публикаций ^{6, 7.} Кроме того, мы представляем стратегию структурной проверки молекулярного иона производная и ее фрагментов ион образуется при ионизации электрона. Мы обратились GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS и изотопно-меченых реагентов для определения молекулярной массы aldononitrile ацетат производные глюкозамина и мурАМИК кислоты, мы использовали массовый переход изотопно-меченых производных в ионных спектра для исследования ионных фрагментов каждого производные ^8. В дополнение к теоретическому выяснению, проверка молекулярного иона производного и его фрагменты иона будет полезной для исследователей, использующих δ ¹³ С или ионно фрагменты этих биомаркеров в биогеохимических исследований ^{9, 10.}

1. Подготовка проб и извлечения кислоты

1. Freeze-сухих образцов почвы после коллекцию полей.
2. Измельчить и гомогенизации проб почвы помощью шаровой мельницы, дробилки почвы, или ступки и пестика.
3. Взвешивание образцов почвы (содержащие> 0,3 мг N) в 25 мл колбу гидролиза.
4. Добавить 10 мл 6М HCl в каждую колбу гидролиза, заполните N ₂ газа в колбах, а крышка плотно.
5. Гидролизу при 105 ° C в инкубаторе в течение 8 часов с использованием переключателя автоматического таймера.

2. Пример очистки

1. Удалить колбы из инкубатора, охладить до комнатной температуры.
2. Добавить 100 мкл внутреннего стандарта мио-инозит (1 мг мл ^-1 в воде) в каждую колбу, микс закрученной.
3. Установить пластиковые воронки слива в 200 мл грушевидной формы колбы с ST / NS 24/40 суставов, устанавливается на пластиковые стаканчики для стабильности.
4. Fold Ватман № 2 Качественные кругов (11 см в диаметре) в помещениях и набор в воронки.
5. Swirl каждый гидролиза колбу, и залить раствор в воронку фильтра (можно дальше промывать каждую колбу с ~ 3 мл воды).
6. Высушите фильтрата с помощью роторного испарителя при температуре ~ 45 ° C, применяя вакуум.
7. Ресуспендируют сухой остаток от каждой груши колбу с 3 ~ 5 мл воды (использовать ультразвуковую ванну по желанию), и залить в трубу 40 мл тефлон, промыть колбу со второй аликвоты воды.
8. Скорректировать значение рН до 6,6 - 6,8 использованием 1М КОН решение осадок ионов металлов и других органических молекул.
9. Удаление осадка путем центрифугирования при 2000 RCF в течение 10 минут.
10. Вылить надосадочную в 40 мл стеклянная трубка, покрытия труб с открытием парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, то тыкать отверстий в парафильмом.
11. Морозильнике замороженный супернатант, чтобы удалить всю жидкость.
12. Растворить остаток с 3 мл сухого метанола, встряхивая тщательно (используется ультразвуковой ванне при желании); крышка трубки, а затем центрифуги в 2000 RCF в течение 10 минут, чтобы решитьиз соли.
13. Перенести супернатант в 3 мл флакон конической реакции, выпаривают досуха на RapidVap машине при 45 ° C (или под струю сухого азота при желании).
14. В каждый флакон, добавить 100 мкл восстановления стандартных N-метилглюкамин (1 мг мл ^-1 в воде) и 1 мл H ₂ O, охватывают флакон рот парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, а затем заморозить сухой .
15. Сделать стандартов: добавить 100 мкл мурамовой кислоты (0,5 мг мл ^-1 в метанол), 100 мкл глюкозамин (1 мг мл ^-1 в воде), 100 мкл мио-инозит (1 мг мл ^-1 в воде), 100 мкл N- метилглюкамин (1 мг мл ^-1 в воде), и 1 мл H ₂ O, парафильмом каждого флакона, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, то в морозильнике.

3. Дериватизации

1. Подготовить производных реагентов содержащих 32 мг мл ^-1 гидроксиламин гидрохлорида и 40 мг мл ^-1 4-диметиламино-руridine в пиридин-метанол (4:1 об / об).
2. Добавить 300 мкл производных реагентов для каждого из reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью.
3. Положите флаконов в 75-80 ° С на водяной бане 35 минут (хорошо запечатаны флаконы, чтобы избежать попадания воды позволяет войти в ампулах).
4. Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.
5. Добавить 1 мл ангидрида уксусной кислоты в каждом из 3 мл reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью, то разогревать в 75-80 ° С на водяной бане 25 минут.
6. Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.

4. Разделение и измерение

1. Добавить 1,5 мл дихлорметана в каждом флаконе, крышка плотно, и вихрь полностью.
2. Добавить 1 мл 1М HCl в каждом флаконе, крышка плотно и вихре тщательно, чтобы решения, чтобы сидеть спокойно, пока два отдельных фраз, аспирации и отказаться от верхней (водной) фазы с помощью пипетки 1000 мкл.
3. В том же Fashion, извлечения органической фазы в 3 раза, а с 1 мл H ₂ O (с последней промывки, проявлять особую осторожность, чтобы все водные верхней фазе была удалена).
4. Высушите окончательного решения с использованием RapidVap при 45 ° C (или сухой использования азота при желании).
5. Растворите в 300 мкл этилацетата и гексана (1:1 об / об) и трансфер в 2 мл янтаря завинчивающейся крышкой флакона с небольшим объемом вставки и крышку.
6. Для количественного анализа методом ГХ-ПИД использовании плавленого кварца неполярной капиллярной колонкой 30 м в длину, 0,25 мм ID, 0,25 мкм толщина пленки; стационарной фазы 5% фенил-, 95% метил-полисилоксан (DB-5 или эквивалент) с водородом или гелия в качестве газа-носителя, в 0,5 мл мин ^-1 постоянным потоком. Хроматографии лучше на премию "инертный" фазы и водорода перевозчика, но приемлемо на наиболее распространенные сорта и с гелием. Детектор настройки 300 ° C, 400 мл мин ^-1 воздуха и 30 мл мин ^-1 для азота игазы водород макияж. Впрыска и печь параметры следующим образом: 1 мкл инъекции раскола (30:1) с GC входе установлен в 250 ° C, начальная температура духовки 120 ° С; держать 1 мин, повысить температуру в духовке при температуре 10 ° C мин. ^-1 до 250 ° C, удерживайте 2,5 мин;. рампы до 270 ° C при 20 ° С мин ^-1; провести 2 минуты, рампы до 290 ° C при 20 ° С мин ^-1, держать 5 минут. Отрегулируйте поток газа-носителя, скорость, так что инозит, глюкозамин и производные мурамовой кислоты элюируются при 250 ° С, а N-метилглюкамин элюируется при 270 ° C.

5. Производные проверка

1. Используйте мягкую ионизацию LC-ESI-TOF-MS для идентификации молекулярных ионов и определения молекулярного веса производной.
2. Используйте GC-EI-MS-SIM или GC-EI-MSMS для повышения чувствительности к расследованию целевых ионов производных.
3. Использование нескольких изотопно меченых реагентов для подготовки производных, а затем использовать массовый переходтех, изотопно меченых производных в MS исследовать молекулярный ион и ион фрагментов.

6. Представитель Результаты

Протокол метода состоит в основном из четырех этапов: кислотного разложения, примеры очищения, производных и GC определения (рис. 1). Пример анализа глюкозамин и мурамовой кислоты из стандартной акции и из образца почвы показано на рисунке 2. Кроме того глюкозамин и мурамовой кислоты, mannosamine и галактозамина (два изомера глюкозамин) также могут быть определены одновременно, используя этот метод. На основе ответов факторов стандартов по отношению к внутреннему стандарту мио-инозит, мы можем количественно этих биомаркеров в образцах почвы. Восстановление стандартной была использована для качественно контролировать процесс производных. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой показано на рисунке 3 .

Предлагаемая структура производных определяется GC-EIMS-SIM для повышения чувствительности, или мягкой ионизации LC-ESI-TOF-MS ^8, предлагаемая структура ионных осколков, образующихся при ионизации электронным изучали путем сравнения ионных спектров образцов, полученных с различных инкорпорации изотопов ^11. Рисунок 4 показывает массовый переход доминирующей ион м / з 187 aldononitrile ацетат производные глюкозамина в трех сценариях, подготовленных с не-меченых агентов, D-уксусный ангидрит, и ^U-13 C-глюкозамин. Другие подробную информацию и разъяснения можно отнести к нашей недавней публикации ^{8, 11.} Эта стратегия могла бы служить моделью для изучения химии производных.

Рисунок 1. Измерение схема протокола для анализа глюкозамин и мурамовой кислоты в почвеобразцов. Протокол основном состоит из 4 шагов: Acid пищеварения, очистки, дериватизации и GC определения.

Рисунок 2. GC-FID хроматограммы aldononitrile ацетатов инозит, глюкозамин, мурамовой кислоты, mannosamine, галактозамина и метилглюкамин стандартов и почвы.

Рисунок 3. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой. № 1 представляет нитрил реакции. № 2 представляет ацетилирования.

Рисунок 4. Масс-спектры aldononitrile ацетат производные глюкозамина связанные с доминирующим структурно ионх годов в режиме Е.И. подготовлен с (А) без меток агентов, (B) D-уксусной ангидрит, (C) ^U-13 C-глюкозамин. Звезда представляет тяжелого изотопа атома изотопа или группы.

Представленные GC-метод, основанный на анализе aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой обеспечивает относительно быстрый метод количественной оценки этих аминосахаров, извлеченных из почвы. Производных химически стабильны, и могут быть определены в одном анализе. Этот метод не только для образцов почвы и может быть упрощена для образцов без почвы матрицы.

Вакуумный насос, используемые в этом методе построена, чтобы быть устойчивыми к кислоте. Кроме того, мы предлагаем создание базы ловушка для защиты насосов при испарении 6М HCl решений. Необходимо соблюдать осторожность при производных меры для поддержания строго безводных условиях, как для реагентов и посуды. Эта работа должна быть проведена безотлагательно. Стекло должно быть скрупулезно чистым, либо глушения при 550 ° С или промывка растворителем. Меры предосторожности должны быть приняты для обработки кислотами и сильных паров кислоты в процессе испарения. Аминогликозидов,Серия антибиотик, произведенный почвенных организмов, были определены в качестве возможного вмешательства, как со-элюируется с глюкозамином или мурамовой кислоты на DB-5 ^12, так что вторая колонка с различными стационарными химии фазы рекомендуется, если GC-FID является основным методом, используемым для количественной эти аминосахаров. Мы рекомендуем подтверждающего детектор после СУ элюируется для последующего анализа. Для однозначной идентификации следов биомаркеров в сложных матрицах, мы предлагаем с помощью сложных приборов, например, GC-MSMS с несколькими мониторинг реакции, для точного количественного биомаркеров в присутствии мешающих, мы рекомендуем делать калибровку на основе некоторых доминирующих ионов масса уникальных для биомаркеров производных.

Подтверждение идентичности сахар структура была заменив ¹⁵ N-гидроксиламин гидрохлорида, дейтерированного уксусного ангидрида и ¹³ С и / или ¹⁵ N помечены биомаркеров для немеченого гидроксильныхамина гидрохлорид, ангидрид уксусной кислоты и биомаркеров в подготовке производных и дальнейшего мониторинга предсказал м / з смещения характерных ионов меченых против немеченого производных. В отдельных, так как каждый из ацетата группа состоит из 3 deuteriums и каждая группа содержит нитрил 1 ¹⁵ N атомов, то можно прогнозировать, что ион м / з массовый переход решает, сколько ацетатных групп и нитрильной группы будут представлены в структурах ион фрагментов. Кроме того, ¹³ C и / или ¹⁵ N-маркировки бактериальных клеток может быть использована как определить, сколько атомов углерода в структуре фрагмент ионов возник из глюкозамина или мурамовой кислота, или глюкозамин-N или мурамовой кислота-N существует Фрагмент структуры.

GC-EI-MS-SIM-газовой хроматографии следует ударной ионизации электронов и масс-спектрометрии использованием разделения квадрупольные масс и отдельных мониторинга ионов, LC-ESI-TOF-MS является жидкостной хроматографии следует электроновионизации trospray и масс-спектрометрии использованием время-пролетным масс-сепарации. Мы здесь, указывают на различия между этими методами, которые используются для определения молекулярного веса и ионного фрагмента. ESI-TOF-MS является «мягкой ионизации» техники в ионизации энергия, переданная молекул аналита, что является достаточно низким, так что не происходит фрагментация и сигнал, является очень точной мерой молекулярной массы вещества. В GC-EI-MS, больше энергии передается аналита, и молекула распадается уступая количество заряженных фрагментов. Квадрупольные действует как фильтр масс так, что только те фрагменты удельная масса / заряд соотношение достигает детектора. Распределения осколков, что характерно для аналита, показано на графике называется спектра ионов, в которых интенсивность и обилие построена на т / г. Для повышения чувствительности, мы используем выбран ион мониторинга (SIM), в котором мы программируем MS собрать лишь несколько конкретных м / з значения ратермо, чем весь спектр масс.

Нам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантами Министерства энергетики Великих озер биоэнергетики научно-исследовательский центр (DOE BER офис науки DE-FC02-07ER64494). Мы благодарны доктору Сюйдун Чжан и его членов группы за полезные обсуждения технических вопросов и бесценные комментарии по доработке протокола.