Трансформация и церкарий В пробирке Выращивание Schistosoma mansoni Schistosomules

Мы описываем В пробирке Метод культивирования шистосомул из плоских червей паразитов Schistosoma mansoni, С помощью сбора и преобразования инфекционного церкарий из пресной воды улитки промежуточных glabrata хост Biomphalaria.

Шистосом паразиты являются возбудителями шистосомоз, хронически изнурительной болезни, которая затрагивает более 200 миллионов человек во всем мире и занимает второе место с малярией среди паразитарных болезней с точки зрения общественного здравоохранения и социально-экономические последствия (1-4). Шистосом паразиты трематод червей со сложным жизненным циклом перестановки между паразитический образ жизни в моллюсков и млекопитающих хостов с промежуточной свободное плавание этапов. Одним словом, свободно плавающие церкарии заразить млекопитающего путем облучения кожи с помощью выделяемых протеаз, в течение которых церкарии теряют свои хвосты, превращаясь в schistosomules. Schistosomules теперь должны уклоняться от иммунной системы, разрабатывает кишечнике для переваривания красных кровяных клеток, и мигрируют хотя легких и портальной циркуляции в пути к месту назначения в портальной системе печени и в конечном итоге брыжеечной вены (для S. mansoni) где мужские и женские пары червей и мат, производя сотни яиц в день. Некоторые из яиц выводятся из организма в пресную воду, где из яиц вылупляются в свободное плавание мирацидиев (5-10). Мирацидии инвазии конкретных видов улиток и превратить в мать и дочь спороцист, который, в свою очередь, вырабатывают инфекционных церкарии, завершение жизненного цикла. К сожалению, весь жизненный цикл шистосом не может быть культивировали в пробирке, но инфекционный церкарии могут быть преобразованы в schistosomules и schistosomules может быть культивировали в течение недели для анализа шистосом развития в пробирке или микрочипов анализа. В этом протоколе, мы предоставляем визуальное описание церкарий преобразования и в лабораторных условиях культивирования schistosomules. Мы пролили инфекционных церкарий из Biomphalaria glabrata хост улитки и вручную преобразовать их в schistosomules путем отделения хвосты использованием эмульгирующих двусторонняя игла. В пробирке церкарий трансформации и методы schistosomules культуры описано избежать использования млекопитающего, который упрощает визуализацию шистосом и облегчает сбор паразита для экспериментального анализа. Преобразования в пробирке и культивирование техники шистосом было сделать в течение многих лет (11, 12), но никаких визуальных протоколы были разработаны, которые доступны для всего сообщества.

Меры предосторожности:

Шистосом церкарии могут непосредственно проникать в кожу без потребности вырезать или поры, и вызывают хронические заболевания шистосомоз. С. mansoni является уровень биобезопасности 2 организма, поэтому специальные средства защиты и надлежащие меры безопасности необходимо соблюдать при работе с инфекционным церкарии. Большая часть оборудования, необходимого для роста и преобразования шистосом является стандартным, за некоторыми исключениями ключевых отмечено в таблице в конце протокола. Все церкарий работа должна проводиться в изолированном помещении. Schistosomules должна культивироваться в стерильной, утвержденной капот биобезопасности. Два слоя латекса или нитрила перчатки, как и должно халате, водонепроницаемый туфли, брюки без каких-либо отверстий или слезы, и водонепроницаемой защиты рукав для запястья и руки. В случае аварийного разлива, немедленно распыления загрязненной территории с 70% этанола или 10% гипохлоритом натрия, потирая энергично, если на вашем лице. Этого будет достаточно, чтобы отключить паразита, но и все возможные инфекции, следует сообщать и принимать всерьез. Хотя schistosomules не врожденно инфекционный, институциональные руководящие принципы меняются, и следует обратиться, чтобы определить BSL2 меры предосторожности необходимы при неинфекционной этапах жизни. Лечить все поверхности, которые вступают в контакт с любой потенциально инфекционного вещества, после эксперимент проводится и выбросить отходы в контейнер для биологически опасных утвержденным.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка улитки хост бункеров от 1 до 2 дней до пролития и защищенном от света месте

1. Сбор церкарий из улитки хост

1. Заполните чистый, 500 мл стакан без моющих средств на полпути полный дистиллированной водой доведены до комнатной температуры. При работе с принимающими улитки инфицированных мирацидии в разные сроки, использовать отдельный стакан для каждой инфекции дату (Это особенно важно, если улитки будут повторно использованы для будущих экспериментов). Размер стакан может быть меньше в зависимости от опыта пользователя.
2. Сбор зараженных хостов улитки вы хотите, чтобы пролить и тщательно сдать их в стакан с использованием стандартного аквариумных рыб сетью и общим щипцы цели по мере необходимости.
3. Место стакан на аварийный разлив лоток примерно от 8 до 12 дюймов под лампы накаливания источником света. Дайте отстояться в течение 1-2 часов при свете. Церкарии выхода улитки хост при воздействии яркого света.
4. Тщательно отфильтровать улитки из церкарии смеси. Принять дополнительные меры предосторожности, так как смесь высоко инфекционной болезнью. Помните, церкарии могут проникать непосредственно человеческой кожи!
5. Замените смеси под источник света в течение приблизительно 15 минут, что позволяет любому твердых частиц отходов, чтобы обосноваться.
6. Передача церкарии в чистую колбу использованием пипетки, избегая мусора на дне стакана. Место колбу примерно под углом 45 ° на льду в темноте в течение 45 - 60 минут, что позволяет церкарии, чтобы обосноваться в одном углу.
7. Используйте 50 мл пипетки, чтобы удалить от 75 до 90% от супернатант и поместить его в стакан, содержащий 10% гипохлоритом натрия или 70% этанола, заботясь, чтобы вода не капли, содержащие церкарии капать из пипетки.
8. Swirl колбу содержащие церкарии аккуратно ресуспендируют церкарии в растворе. Используйте пипетку для передачи образца стерильной 50 мл конические пробирки. Место трубы снова на льду в течение 20 минут в темноте. Церкарии будет располагаться в нижней части трубки в темное время суток.

2. Руководство преобразования церкарии к schistosomules

Прежде чем вы начнете: Сделайте RPMI 1640 полная (RPMI, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1X Pen / Strep) и теплой до 37 ° C. (Очень важно, чтобы эмбриональной телячьей сыворотки использовали выведен путем инкубации 56 ° С в течение 1 часа, как шистосом могут быть чувствительны к дополнение).

1. В биологической капот, удалить супернатант до 5 до 10 мл раствора в каждой 50 мл коническую помощью пипетки или вакуумного устройства.
2. Прикрепить 22 калибра двойного состава, Луер лок эмульгирующей иглу соответствующего размера шприца.
3. Медленно сделать смесь в шприц. Сбор церкарии из всех 50 мл пробирки в шприц. Будьте внимательны капающей.
4. Осторожно поверните шприц над такими, что одинокие конце иглы вверх. Прикрепить еще один шприц на эту сторону эмульгирующей иглы.
5. Пропустите смесь через иглу в общей сложности 40 раз (20 раз туда и обратно) для преобразования церкарий.
6. Позиция шприцы вертикально так, чтобы смесь содержится в нижней шприц и верхней шприц пустой. Снимите верхнюю шприц и дезинфицировать в 70% этанола.
7. Депозит смеси по капле в чистую высокой стеной 100 мм х 50 мм блюдо пирекса или кристаллизатор. Лечить обмена игл и шприцев в 70% этанола.
8. Добавить 37 ° C RPMI 1640 полная СМИ, таких, чтонижней части чашки Петри полностью покрыта, словно проливной пластины Лурия бульон.
9. Swirl аккуратно собирать schistosomules в центре чашки Петри. Избегайте попадания воды.
   Примечание: Это может быть полезно, чтобы выключить свет капот для этого шага, чтобы более адекватно визуализировать schistosomules в центре.
10. Сразу же депозит сосредоточены schistosomules в свежем 12-клеточной культуре также пластины хорошо использование стерильных капельницы.
11. Повторите 2.9 и 2.10 до schistosomules больше не присутствует в центр блюда (примерно в 10 раз). Депозит каждого последующего сбора в свежем хорошо.
12. Заполните каждую лунку на полпути (~ 1,5 мл) с нагретого RPMI полной информации.
13. Визуализация на инвертированный микроскоп для проверки наличия schistosomules и отсутствие церкарий.
14. Расти schistosomules в CO ₂ инкубаторе набор до 37 ° С и 5% СО _2.

3. Представитель Результаты:

До передачи преобразованных schistosomules в культуру средств массовой информации, визуализации под перевернутой светлого поля микроскопа (см. таблицу оборудования для примера) должны давать изображение, похожее на рисунок 1, в которой только трансформируется schistosomules присутствуют в скважине. Потенциальные загрязнители могут включать в себя нетронутым церкарии, разорвала церкарий хвосты, или другой мусор. Если не инвертированного микроскопа доступно, стандартный микроскоп или даже рассечение объем будет достаточным для визуализации schistosomules. Заметим, что эта процедура не всегда трансформировать 100% церкарий.

Рисунок 1: Преобразованный шистосомулы

Рисунок 2: Церкарии и Severed Хвосты

Некоторые потенциальные проблемы могут возникнуть во время преобразования процедура, однако этот протокол разработан, чтобы избежать большинства этих проблем. Одним из потенциальных опасностей является засорение эмульгирующей иглы, которая обычно возникает из-за мусора, оставшиеся от уборки в шаге 1.3. Будьте уверены, чтобы все твердые частицы, чтобы обосноваться в шаге 1.5 и перенести церкарии тщательно в шаге от 1,6 до избежать этой проблемы. Кроме того, как было описано выше, работающих внутри кабинета биологической безопасности, использования средств индивидуальной защиты (даже щиты лицо) и чрезмерного давления на шприцы является целесообразным.

Частный церкарий хвосты могут быть визуализированы в средствах массовой информации, что свидетельствует о плохой разделения на шаге 2.9. Хвосты выставку спазм-подобные движения и имеют различные формы (см. рисунок 2), и константы выглядит так легко отличить от schistosomules. Хвосты могут быть удалены промывкой schistosomules более полной RPMI позволяет schistosomules, чтобы обосноваться. Хвосты будут оставаться на плаву и может быть пылесосом прочь.

Если нетронутыми церкарии присутствуют в средствах массовой информации, преобразования в шаге 2,5 не был исполнен надлежащим образом. Образ нетронутой церкарии изображен на рисунке 3b для справки. Если эта проблема возникает, убедиться, что игла эмульгирующей используется имеет подходящий размер. Кроме того, несколько раз церкарий смесь пропускают через иглу может быть увеличена, хотя и в 40 раз, как правило, гораздо больше, чем достаточно, чтобы приближаться к 100% стрижка церкарий хвосты.

Преобразование церкарии в schistosomules была впервые описана в 1974 году Колли и Wikel (13). С тех пор, подготовка schistosomules было сделано либо с помощью стрижки стратегии с помощью иглы и шприца, как описано в данном протоколе, или с использованием вортексе подход и разделенных градиенты Перколла (14, 15) или вращая, как показано в данной работе. Эти две технологии для подготовки schistosomules прекрасно описывается Фред Льюис (16) и дополнительной информации для дальнейшего культивирования schistosomules для долгосрочного роста можно найти на NIAID шистосом ресурсный центр ( www.schisto-resource.org ).

Нет конфликта интересов объявлены.

Этот проект был профинансирован Case Western Reserve University запуска средства, предоставленные Е. Веселый. Зараженные улитки были предоставлены шистосом ресурсный центр, NIH-NIAID (NIAID контракт № HHSN272201000009I). Мы также благодарим Крис Кинг и Рональд Блэнтон за поддержку в обеспечении инфицированных шистосом улиток и за полезные обсуждения.