Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Wir beschreiben einen In-vitro- Verfahren zur Kultivierung von Schistosomula der flatworm Parasiten Schistosoma mansoni, Über die Ernte und Umwandlung von infektiösen Cercarien aus der Süßwasserschnecke Zwischenwirt Biomphalaria glabrata.

Schistosome Parasiten sind die Erreger der Bilharziose, eine chronische Invalidität nach Krankheit, die mehr als 200 Millionen Menschen betroffen sind weltweit an zweiter Stelle die Malaria unter parasitäre Krankheiten im Bereich der öffentlichen Gesundheit und sozio-ökonomischen Auswirkungen (1-4). Schistosome Parasiten sind Trematoden Würmer mit einem komplexen Lebenszyklus Austausch zwischen einem parasitären Leben in Mollusken und Säugetieren Gastgeber mit dazwischen frei schwimmenden Bühnen. Kurz gesagt, infizieren freischwimmenden Cercarien einen Säugerwirt durch Eindringen in die Haut mit Hilfe von sekretierten Proteasen, während welcher Zeit die Cercarien ihre Schwänze zu verlieren, die Umwandlung in schistosomules. Die schistosomules muss nun entziehen dem Immunsystem des Wirts, die Entwicklung einer gut für die Verdauung der roten Blutkörperchen, und migrieren wenn die Lunge und Pfortaderkreislauf dem Weg zu ihrem endgültigen Bestimmungsort in der Leberpforte und schließlich die Mesenterialvenen (für S. mansoni) wo männliche und weibliche Würmer Paar und mate, Produktion von Hunderten von Eiern täglich. Einige der Eier sind aus dem Körper in frisches Wasser, wo die Eier schlüpfen freischwimmende Miracidien (5-10) ausgeschieden. Die Miracidien infizieren bestimmte Schneckenarten und verwandeln sich in Mutter und Tochter Sporocysten, die ihrerseits produzieren infektiöse Cercarien, die Vollendung des Lebenszyklus. Leider kann die gesamte schistosome Lebenszyklus nicht in vitro kultiviert werden, sondern infektiöse Zerkarien können in schistosomules umgewandelt werden, und die schistosomules können Wochen für die Analyse von schistosome Entwicklung in vitro oder Mikroarray-Analyse kultiviert werden. In diesem Protokoll, bieten wir eine visuelle Beschreibung der Zerkarien Transformation und In-vitro-Kultivierung von schistosomules. Wir werfen infektiösen Zerkarien aus der Schnecke Host Biomphalaria glabrata und manuell wandeln sie in schistosomules durch Lösen die Schwänze mit einem Emulgator Doppel-Nadel. Die in vitro Zerkarien Transformation und schistosomules Kultur beschriebenen Techniken vermeiden die Verwendung eines Säugetier-Wirt, die Visualisierung von schistosomes vereinfacht und erleichtert die Sammlung des Parasiten für experimentelle Analyse. In-vitro-Transformation und Kultivierung von Techniken der schistosomes schon seit Jahren getan (11, 12), aber keine visuelle Protokolle entwickelt worden, die verfügbar sind, die gesamte Gemeinde.

Schutzmaßnahmen:

Schistosome Cercarien können direkt in die Haut eindringen, ohne die Bedürfnisse eines Schnittes oder Poren, und verursachen die chronische Krankheit Bilharziose. S. mansoni ist eine Sicherheitsstufe 2 Organismus, also richtige persönliche Schutzausrüstung und geeignete Schutzmaßnahmen zu beachten bei der Arbeit mit infektiösen Zerkarien werden. Die meisten der Geräte notwendig, um zu wachsen und verwandeln schistosomes ist Standard, mit ein paar wichtigen Ausnahmen in der Tabelle am Ende des Protokolls zur Kenntnis genommen. Alle Zerkarien Arbeit sollte in einem isolierten Raum durchgeführt werden. Schistosomules sollten in einem sterilen, genehmigt Biosicherheit Haube kultiviert werden. Zwei Schichten von Nitril-oder Latexhandschuhe getragen werden, da sollte ein Kittel, eine wasserdichte Schuhe, Hosen ohne Löcher oder Risse, und wasserdicht Ärmelschoner für Ihre Handgelenke und Arme. Im Falle eines unbeabsichtigten Ausbringens sofort Spray kontaminierten Bereich mit 70% Ethanol oder 10% Bleichmittel, reibt energisch, wenn auf Ihre Person. Dies wird ausreichen, um die Parasiten zu deaktivieren, sondern alle möglichen Infektionen sollten gemeldet und ernst genommen werden. Obwohl schistosomules nicht angeboren infektiöse, variieren institutionelle Vorgaben, und sollte konsultiert werden, um festzustellen, ob BSL2 Vorsichtsmaßnahmen bei infektiösen Lebensphasen erforderlich sind. Desinfizieren Sie alle Flächen, die in Kontakt mit potentiell infektiösen Substanz nach dem Experiment durchgeführt und entsorgen Abfälle in einem genehmigten geltenden Bestimmungen.

HINWEIS: Cover Schnecke Host bins 1 bis 2 Tage vor dem Vergießen und vor Licht schützen

1. Harvesting Cercarien aus der Schnecke Host

1. Füllen Sie ein sauberes, 500ml Becher frei von Waschmittel halbwegs voll mit destilliertem Wasser auf Raumtemperatur gebracht. Bei der Arbeit mit Host-Schnecken mit Miracidien zu verschiedenen Zeitpunkten infiziert, verwenden Sie einen separaten Becher für jede Infektion date (Dies ist besonders wichtig, wenn die Schnecken für zukünftige Experimente wieder verwendet werden). Die Größe der Becher kann auch kleiner sein je nach Erfahrung des Anwenders.
2. Sammeln infizierten Schnecke Hosts, die Sie wollen, Schuppen und sorgfältig hinterlegen sie in das Becherglas mit einem Standard-Aquarienfische net und für allgemeine Zwecke Pinzette nach Bedarf.
3. Legen Sie Becherglas auf einen Notfall Auffangwanne ca. 8 bis 12 cm unterhalb Lichtquelle eine Glühlampe. Lassen Sie Standplatz für 1-2 Stunden unter dem Licht. Cercarien verlassen die Schnecke Host, wenn sie hellem Licht ausgesetzt.
4. Sorgfältig herauszufiltern Schnecken aus der Cercarien Mischung. Nehmen Sie zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen, als Gemisch ist hochgradig ansteckend. Denken Sie daran, Cercarien können direkt durchdringen die menschliche Haut!
5. Ersetzen Mischung unter Lichtquelle für ca. 15 Minuten, so dass keine Partikel Abfallstoffe zu begleichen.
6. Transfer Cercarien in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit einer Pipette, die Vermeidung der Ablagerungen am Boden des Bechers. Der Kolben wird bei ca. 45 °-Winkel auf Eis im Dunkeln für 45 bis 60 Minuten, so dass Cercarien in einer Ecke zu begleichen.
7. Verwenden Sie eine 50-ml-Pipette von 75 bis 90% der Überstand zu entfernen und lagern es in Becherglas mit 10% Bleichmittel oder 70% Ethanol, dabei nicht zu lassen Wassertropfen mit Cercarien Tropfen aus der Pipette.
8. Swirl den Erlenmeyerkolben mit Cercarien sanft auf die Cercarien in Lösung zu resuspendieren. Verwenden einer Pipette auf die Probe zu sterilen 50 ml konische Röhrchen übertragen. Die Röhrchen wieder auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Cercarien wird zum Boden des Röhrchens im Dunkeln zu begleichen.

2. Manuelle Umwandlung von Cercarien zu schistosomules

Bevor Sie beginnen: Stellen Sie RPMI 1640 komplett (RPMI, 5% fötalem Rinderserum, 1X Pen / Strep) und warm bis 37 ° C. (Es ist wichtig, dass die Rinderfötenserum verwendet durch Inkubation inaktiviert wurde ein 56 ° C für 1 Stunde als schistosomes können empfindlich zu ergänzen).

1. In einem biohazard Kapuze, entfernen Überstand bis auf 5 bis 10 ml Lösung in je 50 ml konische mit einer Pipette oder Vakuum-Gerät.
2. Bringen Sie einen 22-Gauge-double-ended, Luer-lok Emulgieren Nadel zu einem entsprechend dimensionierten Spritze.
3. Langsam ziehen Mischung in die Spritze. Sammeln Cercarien aus allen 50 ml-Tuben in einer Spritze. Seien Sie aufmerksam der tropfen.
4. Drehen Sie vorsichtig Spritze über eine solche mit dem freien Nadel am Ende ist. Bringen Sie eine weitere Spritze aus auf diese Seite des emulgierenden Nadel.
5. Pass die Mischung durch die Nadel insgesamt 40-mal (20 mal hin und her), um die Cercarien verwandeln.
6. Positionieren Sie die Kartusche so dass die Mischung in der unteren Spritze enthalten ist und die obere Spritze leer ist. Entfernen Sie die obere Spritze und desinfizieren in 70% Ethanol.
7. Kaution Mischung tropfenweise in ein sauberes hoch ummauerten 100mm x 50mm Pyrex Schüssel oder Kristallisierschale. Desinfizieren Sie Nadel und Spritze in 70% Ethanol.
8. Fügen Sie 37 ° C RPMI 1640 komplette Medien, so dass dieBoden der Petrischale ist komplett abgedeckt, als ob Gießen einer Luria Broth Platte.
9. Vorsichtig, um schistosomules in der Mitte der Petrischale zu sammeln. Vermeiden Sie Spritzer.
   Hinweis: Es kann sinnvoll sein, schalten Sie die Haube Licht für diesen Schritt, um weitere angemessene Visualisierung des schistosomules in der Mitte.
10. Unmittelbar Kaution konzentriert schistosomules in ein frisches 12-well Zellkulturplatte auch mit einer sterilen Pipette.
11. Wiederholen 2.9 und 2.10 bis schistosomules nicht mehr vorhanden sind in der Mitte der Schale (etwa 10 mal). Kaution jeweils anschließende Sammlung in ein frisches gut.
12. Füllen Sie jede Vertiefung bis zur Hälfte (~ 1,5 ml) mit vorgewärmtem RPMI komplette Medien.
13. Visualisieren Sie auf einem inversen Mikroskop auf Anwesenheit von schistosomules und Abwesenheit von Cercarien zu überprüfen.
14. Wachsen die schistosomules in einer CO _2-Inkubator eingestellt auf 37 ° C und 5% CO _2.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Bis Transfer von transformierten schistosomules in Kulturmedien, Visualisierung unter einem inversen Hellfeld-Mikroskop (siehe Geräte-Tisch für ein Beispiel) sollte Ausbeute ein Bild ähnlich 1, in denen nur umgewandelt schistosomules sind in der Abbildung gut. Mögliche Verunreinigungen könnten intakt Cercarien, durchtrennt Zerkarien Schwänze, oder andere Fremdkörper. Wenn keine inverse Mikroskop zur Verfügung steht, wird eine Standard-Mikroskop oder sogar eine Dissektion Umfang ausreichen, um die schistosomules visualisieren. Beachten Sie, dass dieses Verfahren nicht immer zu verwandeln 100% der Cercarien.

Abbildung 1: Transformierte schistosomulum

Abbildung 2: Cercarien und Severed Tails

Mehrere potenzielle Probleme könnten bei der Transformation Verfahren entstehen, aber dieses Protokoll wurde entwickelt, um die meisten dieser Probleme zu vermeiden. Eine mögliche Gefahr ist die Verstopfung der emulgierenden Nadel, die in der Regel entsteht durch Ablagerungen in der Ernte in Schritt 1.3 links. Achten Sie darauf, damit alle Partikel bis in Schritt 1.5 zu lösen und den Cercarien sorgfältig Transfer in Schritt 1.6, um dieses Problem zu vermeiden. Auch, wie zuvor beschrieben, arbeitet in einem biologischen Sicherheitsschrank, der persönlichen Schutzausrüstung verwenden (auch Gesichtsschutz) und Vermeidung von übermäßigen Druck auf die Spritzen ist ratsam.

Freistehendes Zerkarien Schwänzen kann in den Medien, was auf schlechte Trennung in Schritt 2,9 visualisiert. Die Schwänze weisen einen Krampf-wie Bewegung und haben einen ausgeprägten Form (siehe Abbildung 2), und auf diese Weise erkennt man leicht die schistosomules. Die Schwänze können durch Waschen der schistosomules über RPMI komplett so dass die schistosomules absetzen entfernt werden. Die Schwänze bleiben schwebend und kann abgesaugt werden.

Wenn intakt Cercarien in den Medien präsent sind, war die Umwandlung in Schritt 2.5 nicht ordnungsgemäß ausgeführt. Ein Bild von einer intakten Cercarie ist in Abbildung 3b als Referenz dargestellt. Wenn dieses Problem auftritt, sicherzustellen, dass die emulgierende Nadel verwendet der richtigen Größe ist. Auch kann die Anzahl, wie oft die Zerkarien Mischung durch die Nadel geführt wird erhöht werden, obwohl 40 Mal wird in der Regel viel mehr als genug, um 100% Scherung der Zerkarien Schwänze Ansatz.

Transformation von Cercarien in schistosomules wurde erstmals 1974 von Colley und Wikel (13) beschrieben. Seitdem hat Vorbereitung schistosomules getan entweder mit der Scher-Strategie mit einer Nadel und Spritze, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, oder mit Hilfe eines Vortex-Ansatz und getrennt mit Steigungen von Percoll (14, 15) oder wirbelnden wie in diesem Papier gezeigt. Diese beiden Techniken zur Herstellung schistosomules sind wunderschön von Fred Lewis (16) und weitere Informationen für die weitere Züchtung von schistosomules für langfristiges Wachstum kann am NIAID schistosome Resource Center (gefunden werden beschrieben www.schisto-resource.org ).

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Projekt wurde von der Case Western Reserve University Start Mittel bereitgestellt, um E. Jolly finanziert. Infizierte Schnecken wurden von der Bilharziose Resource Center, NIH-NIAID (NIAID Contract No HHSN272201000009I) zur Verfügung gestellt. Wir danken auch Chris King und Ronald Blanton für die Unterstützung bei der Sicherung infiziert schistosome Schnecken und für hilfreiche Diskussionen.