Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules

Ci descrivono un In vitro per schistosomula coltura del parassita verme piatto Schistosoma mansoni, Attraverso la raccolta e la trasformazione di cercarie infettive da acqua dolce glabrata ospite intermedio Biomphalaria lumaca.

Parassiti schistosoma sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia cronica debilitante che colpisce oltre 200 milioni di persone nel mondo e al secondo posto alla malaria tra le malattie parassitarie, in termini di salute pubblica e impatto socio-economico (1-4). Schistosoma sono vermi parassiti trematode con un ciclo di vita complesso interscambio tra una vita parassitaria in ospiti di molluschi e di mammiferi con intervenendo libero nuoto fasi. In breve, nuoto libero cercarie infettare un ospite mammifero penetrando la pelle con l'ausilio di proteasi secrete, durante i quali le cercarie perdono la coda, si trasforma in schistosomules. Il schistosomules deve ora eludere il sistema immunitario ospite, sviluppare un intestino per la digestione dei globuli rossi, e migrano attraverso i polmoni e la circolazione portale in rotta verso la destinazione finale nel sistema portale epatico ed eventualmente le vene mesenteriche (per S. mansoni) dove maschile e femminile coppia vermi e compagno, producendo centinaia di uova ogni giorno. Alcune delle uova sono espulso dal corpo in acqua dolce, dove le uova si schiudono in free-nuoto miracidi (5-10). Il miracidi infettare specie di lumaca specifici e si trasformano in sporocisti madre e figlia, che a loro volta, producono cercarie infettive, completando il ciclo di vita. Purtroppo, l'intero ciclo di vita schistosoma non può essere coltivato in vitro, ma cercarie infettive può essere trasformato in schistosomules, e il schistosomules può essere coltivato per settimane per l'analisi dello sviluppo schistosoma in vitro o l'analisi microarray. In questo protocollo, forniamo una descrizione visiva di trasformazione cercarie e in coltura in vitro di schistosomules. Noi capannone cercarie infettive dal glabrata Biomphalaria lumaca di accoglienza e manualmente li trasformano in schistosomules staccando la coda con un emulsionante doppio attacco ago. In vitro cercarie trasformazione e tecniche di coltura schistosomules descritte evitare l'uso di un ospite mammifero, che semplifica la visualizzazione di schistosomi e facilita la raccolta del parassita per l'analisi sperimentale. Trasformazione in vitro e le tecniche di coltura schistosomi sono state fatte da anni (11, 12), ma non esistono ancora protocolli visivo sono stati sviluppati che sono disponibili per l'intera comunità.

Misure di sicurezza:

Cercarie schistosoma può direttamente penetrare la pelle senza la necessità di un taglio o pori, e causare la schistosomiasi cronica. S. mansoni è un livello di biosicurezza 2 organismo, quindi un equipaggiamento di protezione individuale e le misure di sicurezza adeguate devono essere seguite quando si lavora con Cercaire infettive. La maggior parte delle attrezzature necessarie per crescere e trasformare schistosomi è standard, con poche eccezioni chiave indicato nella tabella alla fine del protocollo. Tutti i lavori cercarie dovrebbe essere fatto in una stanza isolata. Schistosomules dovrebbe essere colta in una sterile, cappuccio approvato biosicurezza. Due strati di nitrile o guanti di lattice dovrebbero essere indossati, così come un camice, un paio di scarpe impermeabili, pantaloni senza buchi o strappi, e protettori manica impermeabile all'acqua per i polsi e le braccia. In caso di sversamento accidentale, spruzzare immediatamente l'area contaminata con etanolo al 70% o 10% di candeggina, strofinando vigorosamente se sulla vostra persona. Questo sarà sufficiente per disabilitare il parassita, ma ogni eventuale infezione devono essere segnalati e presi sul serio. Anche se non sono congenitamente schistosomules infettive, le linee guida istituzionali variano, e dovrebbe essere consultato per determinare se BSL2 precauzioni sono necessarie durante le fasi della vita non infettive. Disinfettare tutte le superfici che vengono a contatto con sostanze potenzialmente infettivi dopo l'esperimento viene eseguito e gettare rifiuti in un contenitore approvato rischio biologico.

NOTA: Copertina cassonetti ospitare lumaca 1 a 2 giorni prima del distacco e proteggere dalla luce

1. La raccolta cercarie dall'host lumaca

1. Riempire un ambiente pulito, coppa 500mL circolazione dei detergenti a metà pieno di acqua distillata equilibrati a temperatura ambiente. Se si lavora con le lumache host infetto con miracidi in date diverse, utilizzare un bicchiere separato per ogni data di infezione (Questo è particolarmente importante se le lumache saranno riutilizzati per futuri esperimenti). La dimensione del bicchiere può anche essere più piccolo a seconda della esperienza dell'utente.
2. Raccogliere gli host infetti lumaca che si desidera versare e accuratamente depositarli nel bicchiere con un pesce d'acquario standard di rete e pinze uso generale, se necessario.
3. Bicchiere posto su un vassoio d'emergenza versare circa 8 a 12 pollici sotto una lampada a incandescenza. Lasciate riposare per 1-2 ore sotto la luce. Cercarie uscire l'host lumaca quando esposto alla luce.
4. Con attenzione filtrare lumache dalla miscela cercarie. Prendere misure di sicurezza supplementari, come miscela altamente contagiosa. Ricorda, cercarie possono direttamente penetrare la pelle umana!
5. Sostituire mischia fonte di luce per circa 15 minuti, consentendo ad ogni questione rifiuti particelle di stabilirsi.
6. Trasferimento cercarie in un beuta pulita utilizzando una pipetta, evitando i detriti sul fondo del bicchiere. Porre il pallone a circa 45 ° su ghiaccio al buio per 45 - 60 minuti, permettendo cercarie di stabilirsi in un angolo.
7. Utilizzare una pipetta 50 ml di togliere 75 al 90% del supernatante e depositarlo in un bicchiere contenente candeggina al 10% o 70% di etanolo, facendo attenzione a non lasciare che le gocce d'acqua che contiene a goccia cercarie dalla pipetta.
8. Agitare la beuta contenente cercarie delicatamente per risospendere le cercarie in soluzione. Utilizzare una pipetta per trasferire il campione al sterile 50 ml provette coniche. Posizionare i tubi di nuovo sul ghiaccio per 20 minuti al buio. Cercarie si depositerà verso il fondo della provetta al buio.

2. Trasformazione manuale di cercarie di schistosomules

Prima di iniziare: Fare RPMI 1640 completo (RPMI, 5% siero fetale bovino, 1X Pen / Strep) e calda a 37 ° C. (E 'fondamentale che il siero fetale bovino utilizzato è stato inattivato tramite incubazione a 56 ° C per 1 ora come schistosomi possono essere sensibili a complemento).

1. In una cappa di rischio biologico, rimuovere il surnatante fino a 5 a 10 ml di soluzione in ogni 50 ml con una pipetta o un dispositivo vuoto.
2. Collegare un AWG 22 double-ended, luer lok emulsionare l'ago di una siringa di dimensioni appropriate.
3. Lentamente disegnare impasto nella siringa. Raccogliere cercarie da tutte le provette da 50 ml in una siringa. Essere attenti di gocciolamento.
4. Con attenzione volta siringa sopra tale che l'estremità ago separato è in alto. Allegare un altro siringa a questa parte dell'ago emulsionante.
5. Passare la miscela attraverso l'ago per un totale di 40 volte (20 volte avanti e indietro) per trasformare le cercarie.
6. Posizionare le siringhe verticalmente in modo tale che la miscela è contenuta nella siringa in basso e in alto la siringa è vuota. Rimuovere la siringa superiore e disinfettare in etanolo al 70%.
7. Deposito goccia a goccia miscela in un ambiente pulito ad alta parete 100 millimetri x 50 millimetri piatto pirex o un piatto cristallizzazione. Disinfettare di aghi e siringhe in etanolo al 70%.
8. Aggiungi 37 ° C RPMI 1640 completo dei media in modo che ilparte inferiore della scatola di Petri è completamente coperto, come se versando un piatto di brodo Luria.
9. Agitare delicatamente per raccogliere schistosomules al centro della scatola di Petri. Evitare gli schizzi.
   Nota: Può essere utile per spegnere la luce cappa per questa fase di visualizzare in modo più adeguato la schistosomules al centro.
10. Immediatamente deposito schistosomules concentrata in un nuovo 12-pozzetti di coltura cellulare e con un contagocce sterile.
11. Ripetere 2.9 e 2.10 fino schistosomules non sono più presenti nel centro del piatto (circa 10 volte). Deposito ogni successiva raccolta in un pozzo fresco.
12. Riempire ogni bene fino a metà corsa (~ 1,5 ml) con i media preriscaldata RPMI completo.
13. Visualizzare su un microscopio invertito per verificare la presenza di schistosomules e assenza di cercarie.
14. Crescere il schistosomules in un incubatore CO ₂ set a 37 ° C e 5% di CO _2.

3. Rappresentante dei risultati:

In attesa di trasferimento schistosomules trasformato in terreni di coltura, la visualizzazione sotto una rovesciata luminoso microscopio a campo (vedere la tabella attrezzature per un esempio) dovrebbe produrre una immagine simile alla figura 1, in cui solo schistosomules trasformato sono presenti nel pozzo. Potenziali contaminanti potrebbero includere cercarie intatta, code mozzate cercarie, o altri residui. Se non microscopio invertito è disponibile, un microscopio standard e persino un campo di applicazione dissezione sarà sufficiente visualizzare la schistosomules. Si noti che questa procedura non sempre trasformare il 100% delle cercarie.

Figura 1: Schistosomulum Trasformato

Figura 2: Cercariae e Tails Severed

Diversi potenziali problemi potrebbero insorgere durante la procedura di trasformazione, tuttavia, questo protocollo è stato progettato per evitare la maggior parte di questi problemi. Un potenziale pericolo è l'intasamento dell'ago emulsionante, che nasce di solito a causa di detriti lasciati dalla raccolta al punto 1.3. Assicuratevi di lasciare tutto il particolato di stabilirsi a passo 1,5 e di trasferire le cercarie attenzione al punto da 1,6 a evitare questo problema. Inoltre, come descritto in precedenza, lavorando all'interno di una cappa di sicurezza biologica, l'uso di dispositivi di protezione individuale (anche visiere) e di evitare una pressione eccessiva sulla siringhe è consigliabile.

Staccata code cercarie possono essere visualizzati nei media, che è indicativo della scarsa separazione durante la fase 2.9. Le code mostra uno spasmo, come movimento e hanno una forma distinta (vedi Figura 2), e questa convenzione sono facilmente distinguibili dal schistosomules. La coda può essere rimosso lavando il schistosomules in eccesso di RPMI completo che permette la schistosomules di stabilirsi. Le code rimarranno galleggianti e possono essere aspirate fuori.

Se cercarie intatti sono presenti nei media, la trasformazione in fase 2.5 non è stato eseguito correttamente. L'immagine di un cercarie intatto è raffigurato in Figura 3b di riferimento. Se si verifica questo problema, assicurarsi che l'ago emulsionante utilizzato è delle dimensioni appropriate. Inoltre, il numero di volte in cui viene passato il composto cercarie attraverso l'ago può essere aumentata, anche se 40 volte è in genere molto più che sufficiente per raggiungere il 100% di taglio delle code cercarie.

Trasformazione di cercarie in schistosomules è stato descritto nel 1974 da Colley e Wikel (13). Da allora, la preparazione di schistosomules è stato fatto utilizzando la strategia di taglio con un ago e la siringa come descritto in questo protocollo, o utilizzando un approccio vortex e separati con gradienti di Percoll (14, 15) o vorticoso, come dimostrato in questo documento. Queste due tecniche per la preparazione schistosomules sono ben descritti da Fred Lewis (16) e ulteriori informazioni per la coltura di ulteriori schistosomules per la crescita a lungo termine si possono trovare presso il Centro Risorse NIAID schistosoma ( www.schisto-resource.org ).

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo progetto è stato finanziato dalla Case Western Reserve fondi di avvio Università fornite E. Jolly. Lumache infette sono stati forniti dal Centro Risorse schistosoma, NIAID-NIH (NIAID Contratto N. HHSN272201000009I). Ringraziamo anche Chris King e Ronald Blanton per il supporto nel garantire infetti lumache schistosoma e per utili discussioni.