Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки

В данной статье приводится описание того, как анализировать и записывать с изолированной сетчатки препарат в мышь. В частности, мы описываем, как записывать свет ответы от флуоресцентно меченных популяции клеток ганглия, а затем определить и проанализировать его морфологии.

Первые шаги в позвоночных видения происходят, когда свет стимулирует палочек и колбочек, фоторецепторы сетчатки ^1. Эта информация затем разделены на так называемые ВКЛ и ВЫКЛ путей. Фоторецепторов световой сигнал информацию биполярных клеток (БЦ), который деполяризовать в ответ на повышение (на БЦ) или уменьшается (Off БЦ) в интенсивности света. Это разделение света информация хранится на уровне ганглиозных клеток сетчатки (РГК), которые имеют дендриты стратификации в любом Off sublamina внутреннего слоя плексиформные (IPL), где они получают прямые возбуждающие вклад Off БЦ, или стратификации в На sublamina из IPL, где они получают прямые возбуждающие вклад На БЦ. Это разделение информации относительно увеличения или уменьшения освещения (включение и выключение пути) остается неизменной, а сигнал к мозгу параллельно.

РГК являются выход клетки сетчатки, и, таким образом, важные ячейки для изучения, чтобы понять, как свет информация сигналом для визуальной ядер в мозге. Прогресс в генетике мышей в течение последних десятилетий привели различные флуоресцентные репортер мыши линии, где конкретные РГК населения помечены флуоресцентным белком, чтобы для идентификации подтипов RGC ^{2 3 4} и таргетинга на электрофизиологические записи. Здесь мы представляем метод регистрации света ответы от флуоресцентно меченных ганглиозных клеток в неприкосновенности, изолированной сетчатки подготовки. Это изолировало сетчатки подготовка позволяет записей с РГК, где дендритных беседки не поврежден и входы на всей РГК беседка дендритных сохраняются. Этот метод применим в различных подтипов ганглиозных клеток и может принять самые разнообразные одноклеточные физиологических методов.

Животное использования Соглашение о: Животные были уходом в соответствии с указаниями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, используя протоколы утверждаются Университетом Миннесоты Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1) Подготовка решений

1. Перед выполнением электрофизиологические записи, внутриклеточная, внеклеточная и фермента решения должны быть подготовлены.
2. Внеклеточный решение: смешайте одну бутылку (8.8g) среднего порошкового Эймса (Sigma) с 1 л H ₂ O и 1,9 г бикарбоната натрия (23 мМ). Во всех точках внеклеточный раствор насыщают 95% O ₂ / 5% CO ₂ газовой смеси. Передача 200 мл в стакан для сетчатки хранения. Место оставшийся раствор в контейнере перфузии системы тяжести перфузии раз сетчатки устанавливается.
3. Внутриклеточное решение: Внутриклеточное решение должно было быть принято раньше, а затем аликвоты в 500-1000 мкл аликвоты и хранили при температуре -20 ° C. Внутриклеточное решение зависит от эксперимента необходимо, для текущих записей зажим показано здесь мы используем (в мм): 125 К-глюконат, 2 CaCl _2, MgCl ₂ 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-АТФ, 0,5 мМ NaGTP рН до 7,2 с КОН ^5. Флуоресцентные трассирующими, такие как 10 мкМ Alexafluor-594 гидразида (Invitrogen) могут быть добавлены для визуализации дендритов во время эксперимента, и neurobiotin (0,3%) также могут быть включены для анализа клеточных анатомии следующие записи. Когда все будет готово для записи, оттепель внутриклеточных решение.
4. Фермент решение: комбинат 10000 единиц коллагеназы (Уортингтон химических веществ) с 83 мг Гиалуронидаза (Уортингтон по химическим веществам) в 4,150 мл внеклеточный раствор. Хранить в 50 мкл аликвоты при -20 ° C. Порции могут быть использованы в течение нескольких недель. Когда все будет готово для лечения сетчатки, развести аликвоту в 500 мкл пузырилась внеклеточный раствор.
5. Фосфат буферный раствор (PBS): В 800 мл H ₂ O добавить 8 г хлористого натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,4 г Na ₂ HPO ₄ и 0,24 г KH ₂ PO _4. Довести рН до 7,4 с помощью NaOH. Отрегулируйте громкость на 1 л
6. 0,2 М фосфатного буфера: в 800 мл H ₂ O добавить 21,8 г Na ₂ HPO ₄ и 6,4 г NaH ₂ PO _4. Довести объем до 1 л
7. 4% Параформальдегид Решение: Тепло 50 мл H ₂ O до 60 ° C. Добавить 4g параформальдегида, перемешивать в течение нескольких минут. Добавить несколько капель 1М NaOH (около 5 капель), продолжайте помешивать, пока раствор не станет прозрачным. Добавьте 50 мл 0,2 М фосфатного буфера в стакан. Проверьте рН использованием рН полоски (~ 7,4). Фильтр и прохладно.
8. Блокировка решение (10% сыворотки козьего, 0,5% TritonX100): В 1,8 мл PBS добавить 0,2 мл сыворотки козьего и 10 мкл Тритон Х-100. TritonX-100 служит для permeabilise ткани.
9. Стрептавидином решение (5% сыворотки козьего, 0,5% TritonX100, 1:500 стрептавидином 594): в 1,9 мл PBS добавить 0,1 мл сыворотки козьего, 10 мкл Тритон Х-100 и 4 мкл Стрептавидином 594.

2) Выделение сетчатку от мыши

Dissection инструменты, необходимые: 1 # 2 щипцы, 2 # 5 щипцы, ножницы, офтальмологической

1. Эвтаназии мыши в соответствии с утвержденными протоколами, в данном случае CO ₂ удушья и выяснять глазное яблоко, осторожно вставки угловой № 2 щипцов позади глаз и подъема из глазного яблока.
2. Место глазного яблока в 35 мм чашки Петри с внеклеточной решение. Вырезать зрительного нерва и все подключенные мышц глазного или соединительной ткани с помощью офтальмологических ножницами. Срежьте роговицы с офтальмологической ножницами и выньте линзу с помощью # 5 щипцами. Слеза склеры с помощью пары # 5 щипцы и использовать щипцы разорвать зрительного нерва, где сетчатки и склеры встречаются в оптических дисков. Аккуратно очистите сетчатку от наглазник. Подсказка: каждый шаг по обе сетчатки, прежде чем перейти к следующему шагу, чтобы минимизировать время.
3. Используйте пинцет для удаления стекловидного прикреплены к сетчатке. Это может быть выполнен "захват" прозрачной стекловидной выше сетчатки щипцами. Стекловидное тело, если успешно удален, должны быть видны в виде прозрачного студенистого вещества на щипцы. Совет: нарезки сетчатки в два раза после удаления стекловидного увеличит количество используемой ткани и сделать монтаж в камере легче.
4. Имейте в сетчатку кислородом внеклеточного раствора при комнатной температуре в темном помещении с минимальной освещенности, пока они не готовы быть переварено. Сетчатки могут храниться таким образом, в течение ~ 6 часов.

3) Лечение сетчатки с ферментом смеси и монтажа в записи камеры

1. Развести аликвоту коллагеназа / гиалуронидазы в 500 мкл внеклеточной решение, место раствора в 35 мм чашки Петри и передачи сетчатки.
2. Держите сетчатки содержатING чашку Петри, крытые и во тьме, в 95% О2 / 5% CO ₂ среды в течение 15 мин при легком помешивании. Этот шаг помогает в переваривании любые оставшиеся стекловидного тела и облегчает доступ к слоем клеток ганглия. Совет: для сетчатки от молодых животных с меньшим количеством стекловидной или если побочные эффекты наблюдаются, время может быть сокращено до ~ 5 минут.
3. Удалить сетчатку от фермента среде, содержащей и мыть широко во внеклеточной решение
4. Передача сетчатки в записи камеры ⁶ с фоторецепторов слой вниз. Вика от оставшейся жидкости или с помощью пипетки или ткани-н-ролл из сторон сетчатки, чтобы сгладить ткани стараясь коснуться только края сетчатки, в частности, избегая контакта с слоем клеток ганглия. Место платиновое кольцо с нейлоновой сетки по сетчатке на якорь ткани и сразу же заполнить камеры с внеклеточной решение.
5. Горы записи камеры на столике микроскопа, приложите трубку для перфузии тяжести и вакуумного всасывания и присоединить провод заземления.

4) локализация EGFP выражения ганглиозных клеток и легкой стимуляции

1. Заливать сетчатки под действием силы тяжести с внеклеточной решение на 1 мл / мин или более быстрыми темпами. Совет: Если перфузии бьется слишком медленно, ткани не будут в достаточной мере кислородом и синаптической сигнализации может быть нарушена.
2. Заполните записи пипетки с внутриклеточным раствором и вставить ее в держатель пипетки. Совет: Пипетки с сопротивлениями в диапазоне от 3 до 5MΩ дать лучшие результаты.
3. Визуализируйте сетчатки под инфракрасными дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики при малом увеличении (10х цель, Н. А. 0.3) для локализации записи пипетки. Инфракрасный свет используется, чтобы минимизировать воздействие на сетчатку видимого света и свести к минимуму световой адаптации. Переход к более высоким увеличением (40х цель, Н. А. 0,8) и довести электрод в поле зрения чуть выше ткани.
4. При большом увеличении (40х цель), освещают сетчатки с epifluorescence (480 нм для EGFP) и выберите флуоресцентные ганглиозных клеток и отметить на мониторе компьютера с помощью липкой ленты (рис. 1А).
5. Под DIC и инфракрасного освещения, положение записи электрода рядом целевых ганглиозных клеток (рис. 1А). Чистая площадь сразу покрытия ячейки, применяя нежное положительного давления к записи электрода через 12cc шприц пластиковый связано с пипеткой держатель с полиэтиленовой трубы. На усилителе, ноль любое напряжение смещения. Место электрода на выбранные ганглиозных клеток, пока ямка появляется на поверхности клетки.
6. С усилителем в режиме напряжения зажим, применять испытательного импульса и контролировать ток, проходящий через пипетку. Применить отрицательное давление для создания уплотнения между электродом и клетки. Выпуск отрицательное давление, когда клетка начинает печать и ждать, пока ток удержания свидетельствует о ГОм электрического уплотнения между мембраной клетки и пипетки. Применить нежная импульсы отрицательного давления до емкостные переходные появляются и затем отпустите любого приложения давления. Совет: если доступ (серии) сопротивление высоких (> 30MΩ), это часто может быть лучше от дополнительных, очень нежная, импульсы отрицательного давления.
7. После стабильного печать была достигнута применять импульс отрицательной давления. После целого режиме клетка получается, позволяют ячейки до темно адаптироваться в течение 5 минут. Запись, в текущем режиме зажим, ответ на полное поле, белый световой стимуляции (рис. 1В).
8. После записи, Alexafluor-594 будет рассеянным, чтобы дендритов. Трассирующими могут быть визуализированы в epifluorescence на 594 нм, и используется для определения того ганглиозных клеток является On-Off-, би-или стратифицированной, переключаясь между epifluorescence и DIC инфракрасная оптика ^5.
9. Если neurobiotin входит в пипетку и сетчатки будет обрабатываться для иммуногистохимии, то пипетки должны быть мягко отказался предоставить минимальные нарушения мембраны.

5) Анализ анатомии записал ганглиозных клеток

Наполнение neurobiotin позволяет более подробную морфологического анализа ганглиозных клеток после регистрации. Совет: Если конкретные корреляции между записал ганглиозных клеток и подробное морфологии желании, это может быть лучше для записи и заполнить только один РГК в подготовке.

1. Если neurobiotin был включен в внутриклеточного решение, то место сетчатки в параформальдегида решение и исправить течение ночи при 4 ° C.
2. Промыть в ФСБ, по крайней мере 2 часа, по крайней мере 6 изменений. Передача сетчатки пластины, содержащей блокирующим раствором. Оставьте в блокировании решения в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере.
3. Замените блокирование решения с решением стрептавидином. Инкубировать 2-х дней при температуре 4 ° С на шейкере. Промыть сетчатки в PBS, 6 полосканий, 20 минут каждый.
4. Горы сетчатки с Vectashield в стекле.Сетчатки должны быть размещены среди ганглиозные клетки вверх. Выполните конфокальной микроскопии (рис. 1в).

Представитель Результаты

Если сетчатка здоровая и рассечение было успешным, отдельные клетки ганглия должны быть видны при ДВС-синдром при большом увеличении (рис. 1А). Нездоровый сетчатки будет иметь большой, гранулированный ядер и должен быть уничтожен. Если синаптические реакции данного ганглиозных клеток не повреждена, то клетка должна реагировать на свет приступ или смещение с потенциалов действия и, в случае внутренне-светочувствительных ганглиозных клеток (рис. 1Б), устойчивой деполяризации.

Рисунок 1. Локализация, записи и окрашивание флуоресцентно меченных сетчатки ганглиозных клеток. () GFP положительные РГК визуализированы под epifluorescent освещения при 40-кратном увеличении (слева) и под DIC освещения (справа). (B) Synaptic ответ свете М2 внутренне светочувствительной сетчатки ганглиозных клеток, записанные в цельноклеточной текущем режиме зажим флуоресцентно меченных РГК. (C) M1 неразрывно светочувствительной сетчатки ганглиозных клеток, которая была определена в соответствии epifluorescence, рассчитанные на цельноклеточная записи, наполненные neurobiotin, а затем обрабатываются для иммуногистохимии.

Этот метод применим к любой ганглиозных клеток сетчатки записи с изолированной сетчатки. Хотя у мышей линии, используемой выше внутренне светочувствительная, меланопсин экспрессирующих РГК помечены ^{2 EGFP, 5,} этот протокол можно легко перенести в другие флуоресцентно меченных РГК линии или может быть обобщена на запись из случайно выбранных РГК, а также. Эта техника особенно ценна тем, что дендритные беседка каждой РГК и ее соответствующих входных нейронов остаются полностью нетронутыми. Записи могут быть легко выполнены в ток или напряжение зажим режимы, сотовые подключенные или плохо-патч конфигурации, или даже может быть использована для зарождаются патч, внутри-или вне-патч из конфигураций из клеточных мембран сетчатки ганглия. Эта техника может быть легко адаптированы для записи с флуоресцентно меченных перемещенных amacrine клетки ⁷ или даже не перемещенных amacrine клетки ⁸ Одно из ограничений использования флуоресценции локализовать ганглиозных клеток является то, что сетчатка всегда должны быть под воздействием света для RGC идентификации перед записью . Таким образом, этот препарат не могут быть пригодны для записи стержень-опосредованный ответ, если экзогенных хромофор включен в решение ванной и / или наглазник и пигментный эпителий сетчатки остались прикреплены к сетчатке ^9. Если цель заключается в записи стержень-опосредованный ответ света, то специальные меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать отбеливания фотопигмент родопсина. Вскрытие должно быть выполнено в инфракрасном освещении (например, ^10).

Для успешного вскрытия, важно, что рассечение быть выполнены как можно быстрее. Это особенно важно, что стекловидное быть успешно удалены с щипцами. Если это стекловидное остальные, то следующие ферментативного расщепления сетчатки будут покрыты клейким фильме принятия успешного исправления трудно. Для получения хорошей записи, что особенно важно, что сетчатка хорошо кислородом, а это означает, что внеклеточные решение энергично клокотало и скорость потока достаточно высока через камеру. Важно также, чтобы свести к минимуму воздействие света из ткани сетчатки раз изолируют от наглазник.

Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Мы благодарим Дарвина повесить за его техническую помощь.