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本文提供了一个描述如何从孤立在小鼠视网膜准备的解剖和记录。特别是,我们介绍了如何从一个荧光标记的神经节细胞的人口记录对光反应和随后查明并分析其形态。
在脊椎动物视觉第一步骤,当光线刺激视网膜 1杆和锥光感受器。然后将这些信息分割成ON和OFF通路。光感受器信号光信息的双极细胞(BCS),其中光照强度的增加(BCS)的或减少(关BCS)去极化响应。这种光信息的隔离是保持在视网膜神经节细胞(RGC的),其中有分层内网状层(IPL),他们收到来自关闭的BC直接兴奋输入关sublamina的树突的水平,或分层在sublamina的彩光,他们收到直接的兴奋性输入在边界条件。这隔离的关于增加或减少照明(开启和关闭途径)的信息是守恒的,并暗示大脑平行。
RGC的是输出的视网膜细胞,因而是一个重要的细胞,以研究,以了解如何在大脑中的视觉核信号光信息。在过去几十年的小鼠遗传学的进展,导致各种具体的研资局的人群是一种荧光蛋白标记,以便研资局亚型 2 3 4和电生理记录针对特定的识别荧光记者鼠标线。在这里,我们提出了一种用于记录从一个完整的,孤立的视网膜准备荧光标记的神经节细胞的光反应的方法。这个与世隔绝的视网膜准备允许来自视网膜神经节细胞树突状乔木是否完好,并保留在整个研资局的树突状乔木输入录音。这种方法适用于跨多种神经节细胞亚型,是适合各种各样的单细胞的生理技术。
动物使用声明:动物照顾,在按照指南中描述的实验动物的照顾和使用的指引,使用由明尼苏达机构动物护理和使用委员会大学批准的协议。
1)准备的解决方案
2)从小鼠视网膜的分离
解剖工具:1#2钳,2#5镊子,眼科剪刀
3)治疗视网膜与酶的混合物,并安装在录音室
4)本地化的EGFP表达神经节细胞光刺激
5)记录神经节细胞的解剖分析
neurobiotin灌装,允许更详细的神经节细胞的形态分析,下面的记录。提示:如果一个记录的神经节细胞和详细的形态之间的具体相关的需要,它可能是最好的记录和填写只有每一个研资局的准备。
代表性的成果
如果视网膜是健康的,夹层是成功的,个别的神经节细胞,应根据DIC的可见,在高放大倍率(图1A)。不健康的视网膜将有大粒细胞核,并应被丢弃。如果一个给定的神经节细胞突触的反应是完好的,那么细胞反应轻发病或抵消动作电位,一个内在的感光神经节细胞(图1B),持续的去极化的情况下。
图1。本地化,录制,和一种荧光标记的视网膜神经节细胞染色(A)GFP阳性研资局的可视化啶照明下40X放大倍率(左图)和DIC的照明下(右图)。 (二)M2的本质荧光标记的研资局在全细胞电流钳模式记录的感光视网膜神经节细胞突触的光响应。 (三)货币供应量M1内在感光视网膜神经节细胞的鉴定下epifluorescence,有针对性的全细胞记录,充满neurobiotin,然后进行免疫组化处理。
这种技术适用于任何一个孤立的视网膜视网膜神经节细胞的录音。虽然在本质上感光上面使用鼠标线,黑视素的表达RGC的标记与EGFP 2,5,这个协议很容易转移到其他荧光标记的研资局线或可广义纪录,以及从随机选取的视网膜神经节细胞。这种技术是特别有价值的,因为每个研资局和其各自的输入神经元的树突状乔木留下完全完好无损。录音可以很容易地在电流或电压钳模式下,细胞贴附或松散的补丁配置,甚至可以用于核补丁,内或视网膜神经节细胞的细胞膜外补丁配置。这种技术可以很容易适应, 记录 8限制利用荧光荧光标记的流离失所的无长突细胞7甚至无移位无长突细胞本地化神经节细胞,视网膜必须始终暴露在光线录音前研资局鉴定。因此,这种准备可能不适合录音棒介导的反应,除非外源性生色液和/或眼罩和视网膜色素上皮细胞是视网膜9。如果我们的目标是记录杆介导的光反应,然后特别的预防措施,必须采取避免漂白的感光色素视紫红质。清扫必须在红外光照条件下(即10)。
要执行一个成功剥离,重要的是尽可能迅速地进行解剖。尤其重要的是,玻璃体与钳成功删除。如果玻璃体剩余,视网膜内切酶消化后将会覆盖与糊糊的电影成功修补困难。为了取得良好的录音,这是尤为关键,视网膜氧化,这意味着细胞外液正在大力起泡和流速足够高通过商会。同样重要的是,尽量减少光线照射的组织,一旦视网膜隔离眼罩。
这项工作是支持部分由美国国立卫生研究院R01EY012949,R21EY018885,T32 EY0707133赠款。我们感谢他的技术援助达尔文坑。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ames’ Medium | Sigma-Aldrich | A1420 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | |
Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | |
Electrodes | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
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