一个孤立的视网膜制备，记录从基因标记的视网膜神经节细胞的光反应

本文提供了一个描述如何从孤立在小鼠视网膜准备的解剖和记录。特别是，我们介绍了如何从一个荧光标记的神经节细胞的人口记录对光反应和随后查明并分析其形态。

在脊椎动物视觉第一步骤，当光线刺激^视网膜 1杆和锥光感受器。然后将这些信息分割成ON和OFF通路。光感受器信号光信息的双极细胞（BCS），其中光照强度的增加（BCS）的或减少（关BCS）去极化响应。这种光信息的隔离是保持在视网膜神经节细胞（RGC的），其中有分层内网状层（IPL），他们收到来自关闭的BC直接兴奋输入关sublamina的树突的水平，或分层在sublamina的彩光，他们收到直接的兴奋性输入在边界条件。这隔离的关于增加或减少照明（开启和关闭途径）的信息是守恒的，并暗示大脑平行。

RGC的是输出的视网膜细胞，因而是一个重要的细胞，以研究，以了解如何在大脑中的视觉核信号光信息。在过去几十年的小鼠遗传学的进展，导致各种具体的研资局的人群是一种荧光蛋白标记，以便研^资局亚型 2 3 4和电生理记录针对特定的识别荧光记者鼠标线。在这里，我们提出了一种用于记录从一个完整的，孤立的视网膜准备荧光标记的神经节细胞的光反应的方法。这个与世隔绝的视网膜准备允许来自视网膜神经节细胞树突状乔木是否完好，并保留在整个研资局的树突状乔木输入录音。这种方法适用于跨多种神经节细胞亚型，是适合各种各样的单细胞的生理技术。

动物使用声明:动物照顾，在按照指南中描述的实验动物的照顾和使用的指引，使用由明尼苏达机构动物护理和使用委员会大学批准的协议。

1）准备的解决方案

1. 在进行电生理记录之前，细胞内，外，酶的解决方案需要做好准备。
2. 细胞外液:混合一瓶（8.8克）粉状艾姆斯"媒介与H _{2 O}和1升的碳酸氢钠1.9克（23毫米）（Sigma公司）。在所有点的细胞外液与95％O ₂ / 5％CO ₂混合气体饱和。将200毫升烧杯视网膜存储。在重力灌注的灌注系统容器将剩余的解决方案，一旦安装视网膜。
3. 细胞内的解决方案:细胞内的解决方案应该已经以前提出，然后分装成500-1000μL等份，并储存在-20 ° C细胞内的解决方案各不相同，取决于所需要的实验，电流钳这里显示的记录，我们使用（毫米）:125的K -葡萄糖酸钙，EGTA，10 _HEPES，2 2 2 2 _氯化钙 ，氯化镁_2，10 NA 2 + - ATP， 0.5毫米NaGTP pH至7.2，用^KOH 5 。一个荧光示踪剂，如10微米Alexafluor - 594肼（Invitrogen公司）可以加入到可视化实验过程中，和neurobiotin（0.3％）的树突也可包括细胞的解剖分析，以下记录。准备记录时，解冻细胞内的解决方案。
4. 酶液:结合83毫克到4.150毫升的细胞外液的透明质酸酶（沃辛顿化学品）的10000个单位胶原酶（沃辛顿化工）。在50μL分装储存在-20 ° C等分可用于几个星期。准备治疗视网膜时，稀释分装成500μL细胞外液起泡。
5. 磷酸盐缓冲液（PBS）:在800毫升的H _{2 O，}加8克氯化钠，氯化钾0.2克，1.4克的_{Na 2 HPO} 4和0.24克的_KH 2 _PO 4 。把用NaOH的pH至7.4。调整音量至1 L。
6. 0.2 M磷酸缓冲液:在800毫升的H _{2 O}添加21.8克的Na ₂ HPO ₄和6.4克的NaH ₂ PO _4。带量至1 L。
7. 4％多聚甲醛溶液:热50毫升H _{2 O}至60 ° C添加4G多聚甲醛，搅拌几分钟。 1M NaOH溶液中加入几滴（约5滴），不断搅拌，直至解决方案是明确的。添加50毫升到烧杯0.2 M磷酸缓冲液。检查pH值，使用pH值带（〜7.4）。过滤器和冷却。
8. 封闭液（10％山羊血清，0.5％TritonX100）:添加山羊血清和10μL，Triton X - 100的的0.2毫升，1.8毫升的PBS。 TritonX - 100服务permeabilise组织。
9. 链霉亲和素溶液（5％山羊血清，0.5％TritonX100 594链霉，1:500）:添加1.9毫升的PBS山羊血清0.1毫升，10μL，TRITON X - 100和4μL链霉594。

2）从小鼠视网膜的分离

解剖工具:1＃2钳，2＃5镊子，眼科剪刀

1. 安乐死鼠标按照批准的协议，在这种情况下_，CO 2窒息和enucleate眼球，轻轻插入眼睛的角度＃2落后钳和起重眼球。
2. 菜放入35毫米的细胞外液的Petri的眼球。剪断视神经和任何附加的眼外肌或结缔组织，用眼科剪刀。用眼科剪剪去角膜和使用＃5镊子拉出镜头。撕裂巩膜使用一对＃5镊子和使用产钳切断视神经，视网膜和巩膜满足视盘。轻轻地揭下眼罩远离视网膜。提示:不要在两个视网膜之前，每一步移动到下一个步骤，以尽量减少时间。
3. 使用镊子去除附着在视网膜玻璃体。这可以由上述透明的玻璃体视网膜与钳"抢夺"。玻璃体，如果顺利取出，应作为一个明确的凝胶状物质，镊子可见。提示:切一半以下的玻璃体切除视网膜将最大限度地提高可用组织的数量，并在会议厅内安装容易。
4. 保持室温在黑暗的环境下以最小的环境光线的含氧细胞外液的视网膜，直到他们准备被消化。视网膜可以存储在这种方式〜6小时。

3）治疗视网膜与酶的混合物，并安装在录音室

1. 胶原酶/透明质酸等份稀释500μL，细胞外液，在一个35毫米的培养皿的地方解决方案和转移的视网膜。
2. 保持视网膜包含ING培养皿中，覆盖在黑暗中，在95％O2 / 5％的CO ₂环境中轻轻摇动15分钟。这一步艾滋病在消化任何剩余的玻璃体，并允许更容易进入神经节细胞层。提示:减少玻璃体或不利影响，如果是观察年轻的动物视网膜，时间可缩短至〜5分钟。
3. 视网膜含酶的培养基中删除，并在细胞外液洗广泛
4. 转移到视网膜的感光层朝下录音室^6。威克走剩余的液体，用吸管或组织，并推出视网膜两侧扁平化组织正在仔细只接触边缘的视网膜，特别是避免接触与神经节细胞层。铂金戒指放在视网膜尼龙网，锚的组织，并立即填写与细胞外液室。
5. 山显微镜舞台上的录音室，重视管灌注重力和真空吸力和附加接地线。

4）本地化的EGFP表达神经节细胞光刺激

1. 重力在细胞外液1毫升/分或更快的速率灌注视网膜。提示:如果灌注速度太慢，该组织将不会有足够的含氧和突触的信号可能会中断。
2. 与细胞内的解决方案填充录音吸管插入吸管持有人。提示:在3至5MΩ电阻移液器提供最好的结果。
3. 根据红外微分干涉对比（DIC）在低倍率（10倍的目标，NA 0.3）本地化录音吸管的光学可视化视网膜。红外灯是用来减少视网膜暴露在可见光和减少光适应。移动到更高的放大倍率（40X客观的，不适用0.8），并把电极只是上述组织。
4. 在高放大倍率（40X目标），照亮epifluorescence（480纳米EGFP的）的视网膜，并选择使用磁带（图1A）一个荧光的神经节细胞和电脑显示器上的标志。
5. DIC和红外线照射下，记录电极位置的附近有针对性的神经节细胞（图1A）。立即清理面积覆盖应用轻柔的正压记录电极通过一个12cc的塑料注射器用聚乙烯管材连接吸管持有人的细胞。放大器上，任何电压偏移为零。选定的神经节细胞，直到上放置电极酒窝出现在细胞表面。
6. 随着在电压钳模式放大器，适用于测试脉冲和监控通过吸液管的电流通过。应用负压创建电极和细胞之间的密封。释放负面的压力时，细胞开始密封和等待，直到电流是一个GΩ的细胞的细胞膜和吸管之间的电气密封。应用负压温柔脉冲，直到电容瞬态出现，然后释放任何压力的应用。提示:如果访问（系列）电阻高（>30MΩ），这往往可以通过额外的，很温柔，负压脉冲减轻。
7. 一旦已达到一个稳定的密封采用负压脉冲。获得全细胞模式后，使细胞暗适应5分钟。纪录，在电流钳模式，响应全领域，白色的光刺激（图1B）。
8. Alexafluor - 594录音之后，将有扩散的树突。示踪剂可根据epifluorescence显示，在594纳米，用于确定是否神经节细胞上，断，或epifluorescence和DIC红外^光学 5之间切换双向分层。
9. 如果neurobiotin移液器和视网膜，免疫组织化学处理，然后必须将吸管轻轻地缩回，以提供最小的膜破坏。

5）记录神经节细胞的解剖分析

neurobiotin灌装，允许更详细的神经节细胞的形态分析，下面的记录。提示:如果一个记录的神经节细胞和详细的形态之间的具体相关的需要，它可能是最好的记录和填写只有每一个研资局的准备。

1. 然后放置在多聚甲醛溶液，如果neurobiotin是在细胞内的解决方案包括视网膜和修复一夜之间在4 ° C。
2. 在PBS冲洗，至少2个小时，至少有6变化。视网膜转移到板含有封闭液。留在阻断2个小时的解决方案，对室温​​摇床。
3. 更换与链霉亲和解决方案的封闭液。孵育2天，于4℃。上摇床彗星。在PBS冲洗的视网膜，6漂洗，每次20分钟。
4. 安装在玻片上的视网膜与Vectashield。必须放在视网膜神经节细胞。执行共聚焦显微镜（图1C）。

代表性的成果

如果视网膜是健​​康的，夹层是成功的，个别的神经节细胞，应根据DIC的可见，在高放大倍率（图1A）。不健康的视网膜将有大粒细胞核，并应被丢弃。如果一个给定的神经节细胞突触的反应是完好的，那么细胞反应轻发病或抵消动作电位，一个内在的感光神经节细胞（图1B），持续的去极化的情况下。

图1。本地化，录制，和一种荧光标记的视网膜神经节细胞染色（A）GFP阳性研资局的可视化啶照明下40X放大倍率（左图）和DIC的照明下（右图）。 （二）M2的本质荧光标记的研资局在全细胞电流钳模式记录的感光视网膜神经节细胞突触的光响应。 （三）货币供应量M1内在感光视网膜神经节细胞的鉴定下epifluorescence，有针对性的全细胞记录，充满neurobiotin，然后进行免疫组化处理。

这种技术适用于任何一个孤立的视网膜视网膜神经节细胞的录音。虽然在本质上感光上面使用鼠标线，黑视素的表达RGC的标记与EGFP ^2，5，这个协议很容易转移到其他荧光标记的研资局线或可广义纪录，以及从随机选取的视网膜神经节细胞。这种技术是特别有价值的，因为每个研资局和其各自的输入神经元的树突状乔木留下完全完好无损。录音可以很容易地在电流或电压钳模式下，细胞贴附或松散的补丁配置，甚至可以用于核补丁，内或视网膜神经节细胞的细胞膜外补丁配置。这种技术可以很容易适应， ^记录 8限制利用荧光荧光标记的流离失所的无长^突细胞7甚至无移位无长突细胞本地化神经节细胞，视网膜必须始终暴露在光线录音前研资局鉴定。因此，这种准备可能不适合录音棒介导的反应，除非外源性生色液和/或眼罩和视网膜色素上皮^细胞是视网膜9。如果我们的目标是记录杆介导的光反应，然后特别的预防措施，必须采取避免漂白的感光色素视紫红质。清扫必须在红外光照条件下（即^10）。

要执行一个成功剥离，重要的是尽可能迅速地进行解剖。尤其重要的是，玻璃体与钳成功删除。如果玻璃体剩余，视网膜内切酶消化后将会覆盖与糊糊的电影成功​​修补困难。为了取得良好的录音，这是尤为关键，视网膜氧化，这意味着细胞外液正在大力起泡和流速足够高通过商会。同样重要的是，尽量减少光线照射的组织，一旦视网膜隔离眼罩。

这项工作是支持部分由美国国立卫生研究院R01EY012949，R21EY018885，T32 EY0707133赠款。我们感谢他的技术援助达尔文坑。