Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Los primeros pasos en la visión de los vertebrados tienen lugar cuando la luz estimula los fotorreceptores de los bastones y conos de la retina ^1. Esta información es luego separada en lo que se conoce como las vías de ON y OFF. La información fotorreceptores señal de luz a las células bipolares (BC), que despolarizan en respuesta a los aumentos (en BC) o disminuye (Off BCS) en la intensidad de luz. Esta separación de la luz información se mantiene en el nivel de las células ganglionares de la retina (CGR), que tienen dendritas estratificación, ya sea en el sublamina fuera de la capa plexiforme interna (IPL), donde reciben la entrada de excitación directa de Off chalecos, o la estratificación en En el sublamina de la IPL, donde reciben la entrada de excitación directa de El BCS. Esta segregación de información acerca de los aumentos o disminuciones en la iluminación (el encendido y apagado vías) se conserva y señaló que el cerebro de forma paralela.

La CGR son las celdas de salida de la retina, y por lo tanto una importante célula de estudio con el fin de entender cómo la luz información es transmitida al núcleo visual en el cerebro. Los avances en la genética del ratón en las últimas décadas han dado lugar a una variedad de líneas fluorescentes reportero del ratón en poblaciones específicas de RGC están etiquetados con una proteína fluorescente para permitir la identificación de los subtipos de RGC ^{2 3 4} y orientación específica para el registro electrofisiológico. A continuación, presentamos un método para registrar las respuestas de la luz de las células ganglionares de la etiqueta fluorescente en una preparación intacta, la retina aislada. Esta preparación la retina aislada permite grabaciones de CGR en la glorieta dendríticas está intacto y las entradas a través de la glorieta dendríticas RGC todo se conservan. Este método es aplicable en una amplia variedad de subtipos de células ganglionares y se presta a una amplia variedad de una sola célula técnicas fisiológicas.

Animal Uso Declaración: Los animales fueron atendidos de conformidad con las directrices descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Minnesota Care Animal institucional y el empleo.

1) Preparación de las soluciones

1. Antes de realizar registros electrofisiológicos, las soluciones intracelulares, extracelulares, y la enzima que estar preparados.
2. Extracelular solución: mezclar una botella (8,8 g) del medio de polvo de Ames (Sigma) con 1 l de H ₂ O y 1,9 g de bicarbonato de sodio (23 mM). En todos los puntos de la solución extracelular está saturado con 95% O ₂ / 5% CO ₂ mezcla de gases. Transferencia de 200 ml a un vaso de almacenamiento de retina. Ponga la solución queda en el recipiente sistema de perfusión para la perfusión por gravedad una vez la retina se ha montado.
3. Solución intracelular: solución intracelular que se han hecho con anterioridad y luego en partes alícuotas 500-1000 alícuotas y almacenado a -20 ° C. Solución intracelular varía en función de la experiencia necesaria, para las grabaciones de pinza de corriente se muestra aquí usamos (en mm): 125 K-gluconato, 2 CaCl _2, 2 MgCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH a 7,2 con KOH ^5. Un marcador fluorescente como 10 M-594 AlexaFluor hidrazida (Invitrogen) se pueden agregar a visualizar las dendritas durante el experimento, y neurobiotin (0,3%) también pueden ser incluidos para el análisis de la anatomía de la célula después de su registro. Cuando esté listo para grabar, descongelar solución intracelular.
4. Solución de la enzima: Combine 10.000 unidades de colagenasa (Worthington productos químicos) con 83 mg hialuronidasa (productos químicos Worthington) en 4.150 ml de la solución extracelular. Almacenar en alícuotas de 50 l a -20 ° C. Alícuotas se puede utilizar por varias semanas. Cuando esté listo para el tratamiento de la retina, se diluye en 500 l alícuota de la solución de burbujas extracelular.
5. Solución tampón de fosfato (PBS): en 800 ml de H ₂ O añaden 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na ₂ HPO ₄ y 0,24 g de KH ₂ PO _4. Llevar el pH a 7,4 con NaOH. Ajustar el volumen de 1 L.
6. Tampón fosfato 0,2 M: En 800 ml de H ₂ O añadir 21,8 g de Na ₂ HPO ₄ y 6,4 g de NaH ₂ PO _4. Alcanzar un volumen de 1 L.
7. Paraformaldehído al 4% Solución: Heat 50 ml H ₂ O a 60 ° C. Añadir 4 g de paraformaldehído, se agita durante varios minutos. Añadir unas gotas de NaOH 1M (alrededor de 5 gotas), seguir revolviendo hasta que la solución es clara. Añadir 50 ml de tampón fosfato 0,2 M en el vaso. Verifique el pH con tiras de pH (~ 7,4). Filtrar y enfriar.
8. Solución de bloqueo (10% suero de cabra, un 0,5% TritonX100): En 1,8 ml de PBS añadir 0,2 ml de suero de cabra y 10 l de Triton X-100. TritonX-100 sirve para permeabilizar el tejido.
9. Estreptavidina solución (5% suero de cabra, un 0,5% TritonX100, 1:500 estreptavidina 594): En 1,9 ml de PBS, añadir 0,1 ml de suero de cabra, 10 l de Triton X-100 y 4 L de estreptavidina 594.

2) El aislamiento de la retina de ratón

Herramientas de disección es necesario: 1 # 2 pinzas, 2 º 5 pinzas, tijeras oftalmológicas

1. Eutanasia ratón de acuerdo a los protocolos aprobados, en este caso asfixia de CO ₂ y el globo ocular enucleación, insertando suavemente un ángulo # 2 pinzas detrás del ojo y levantando el globo ocular.
2. Lugar del globo ocular en un 35 mm placa de Petri con solución extracelular. Cortar el nervio óptico y los músculos extraoculares adjunto o del tejido conectivo con unas tijeras oftalmológicas. Cortar la córnea con una tijera de oftalmología y tire de la lente usando # 5 fórceps. Romper la esclerótica con un par de pinzas # 5 y el uso de las pinzas para cortar el nervio óptico en la retina y la esclerótica se encuentran en el disco óptico. Con cuidado, vaya de la retina se desprenda de la ojera. Sugerencia: cada paso en ambas retinas antes de pasar al siguiente paso para minimizar el tiempo.
3. El uso de fórceps para extraer humor vítreo adherido a la retina. Esto puede ser realizado por "agarrar" el humor vítreo transparente por encima de la retina con una pinza. El humor vítreo, si elimina correctamente, debe ser visible como una sustancia transparente y gelatinosa en las pinzas. Sugerencia: Cortar la retina en la mitad tras la retirada del vítreo maximizará la cantidad de tejido útil y hacer el montaje en la cámara sea más fácil.
4. Mantener la retina en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente en un ambiente oscuro con la luz ambiental mínimo hasta que estén listos para ser digeridos. Retinas se pueden almacenar en esta forma de a 6 horas.

3) Tratamiento de la retina con la mezcla de enzimas y de montaje en la cámara de grabación

1. Diluir una alícuota de la colagenasa / hialuronidasa en 500 l solución extracelular, la solución en lugar de 35 mm placa de Petri y la transferencia de la retina.
2. Mantener la retina contienenING placa de Petri, cubiertas y en la oscuridad, en un 95% O2 / 5% CO ₂ ambiente durante 15 minutos con agitación suave. Este paso ayuda a digerir cualquier vítreo restante y permite un acceso más fácil a la capa de células ganglionares. Sugerencia: para las retinas de los animales más jóvenes con menos humor vítreo o si se observan efectos adversos, el tiempo se puede acortar a ~ 5 minutos.
3. Retire la retina de enzimas que contienen medio y lavar ampliamente en la solución extracelular
4. La transferencia de la retina en la grabación de la cámara ⁶ con la capa de fotorreceptores hacia abajo. Evacuación de la resto de fluido, ya sea con una pipeta o el tejido y el despliegue lados de la retina para aplanar el tejido con cuidado de tocar sólo los bordes de la retina, en particular, evitando el contacto con la capa de células ganglionares. Colocar un anillo de platino con una malla de nylon en la retina para anclar el tejido e inmediatamente llenar la cámara con una solución extracelular.
5. Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio, meter un tubo de perfusión por gravedad y succión al vacío y conectar el cable de tierra.

4) La localización de las células ganglionares de la EGFP expresión y la estimulación de luz

1. Perfusión de la retina por la gravedad con solución extracelular en las tasas de 1 mL / min o más rápido. Consejo: Si la tasa de perfusión es demasiado lento, el tejido no será lo suficientemente oxigenada y la señalización sináptica puede ser interrumpido.
2. Llenar una pipeta de grabación con la solución intracelular y la inserta en el soporte de la pipeta. Sugerencia: Las pipetas con resistencias en el rango de 3 a 5MΩ dar los mejores resultados.
3. Visualizar la retina bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica a bajo aumento (objetivo de 10X, NA 0,3) para localizar la pipeta de grabación. La luz infrarroja se utiliza para minimizar la exposición de la retina a la luz visible y minimizar la adaptación a la luz. Mover a un mayor aumento (objetivo de 40X, NA 0.8) y llevar el electrodo en vista justo por encima de los tejidos.
4. A mayor aumento (objetivo 40X), iluminar la retina con epifluorescencia (480 nm para EGFP) y seleccione una de las células ganglionares fluorescente y marca de monitor de ordenador con cinta (fig. 1A).
5. Bajo iluminación DIC y de infrarrojos, la posición del electrodo de registro cerca de las células ganglionares específicas (Figura 1). Limpie el área que cubre inmediatamente la célula mediante la aplicación de presión positiva suave para electrodo de registro a través de una jeringa de plástico de 12cc conectada a la titular de la pipeta con tubería de polietileno. En el amplificador, las compensaciones a cero de tensión. Electrodo en lugar de las células ganglionares seleccionado hasta que aparece un hoyuelo en la superficie celular.
6. Con el amplificador en el modo de fijación de voltaje, aplicar un pulso de prueba y controlar la corriente que pasa a través de la pipeta. Aplicar presión negativa para crear el sello entre el electrodo y celular. De liberación de presión negativa cuando la célula empieza a sellar y esperar a que la celebración actual es indicativo de un sello GΩ eléctrico entre la membrana celular y la pipeta. Aplicar suaves pulsos de presión negativa hasta que aparecen los transitorios capacitivos y luego suelte cualquier aplicación de presión. Consejo: si el acceso (la serie) la resistencia es alta (> 30MΩ), esto a menudo puede ser mejorado por otros, muy suave, los pulsos de presión negativa.
7. Una vez que un sello estable se ha llegado a aplicar un pulso de presión negativa. Después del modo de célula completa se obtiene, permitirá la célula para adaptarse oscuridad durante 5 minutos. Registro, en el modo de corriente con la pinza, la respuesta a campo completo, la estimulación de luz blanca (fig. 1B).
8. Después de su registro, AlexaFluor-594 se han difundido a las dendritas. El marcador puede ser visualizado en epifluorescencia a 594 nm y se utiliza para determinar si una célula ganglionar es-On, Off-o bi-estratificado por cambiar de óptica infrarroja epifluorescencia y DIC ^5.
9. Si neurobiotin está incluido en la pipeta y la retina va a ser procesadas para inmunohistoquímica, entonces pipeta suavemente retraído para proporcionar una mínima interrupción de la membrana.

5) Análisis de la anatomía de las células ganglionares registrado

Llenado con neurobiotin permite un análisis más detallado morfológicas de las células ganglionares después de su registro. Consejo: Si las correlaciones específicas entre las células ganglionares registrado y la morfología detallada que se desea, puede ser mejor para grabar y completar una sola RGC por la preparación.

1. Si neurobiotin fue incluido en la solución intracelular luego colocar la retina en la solución de paraformaldehído y fijar la noche a 4 ° C.
2. Enjuague en PBS, por lo menos 2 horas, por lo menos 6 cambios. La transferencia de la retina a una placa que contiene la solución de bloqueo. Deja en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente en la coctelera.
3. Reemplace la solución de bloqueo con la solución de estreptavidina. Incubar 2 días a 4 ° C en el agitador. Enjuague la retina en PBS, 6 enjuagues, 20 min cada uno.
4. Monte la retina con Vectashield en un portaobjetos de vidrio.La retina se debe colocar con las células ganglionares de arriba. Realizar microscopia confocal (fig. 1C).

Resultados representante

Si la retina está sana y la disección se ha realizado correctamente, las células ganglionares de la persona deben ser visibles en la CID a gran aumento (fig. 1A). Retinas no saludables se tienen grandes núcleos, granulado y debe ser desechado. Si la respuesta sináptica de las células ganglionares dado está intacta, la célula debe responder al inicio de la luz o el desplazamiento de los potenciales de acción y, en el caso de una de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles-(fig. 1B), una despolarización sostenida.

Figura 1. Localización, registro y tinción de las células ganglionares de la retina marcados con fluorescencia. (A) RGC GFP positivos visualizado bajo iluminación epifluorescencia con un aumento de 40X (izquierda) y con iluminación DIC (panel derecho). (B) respuesta a la luz de una Synaptic células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles M2 registró en su conjunto de células modo de pinza de corriente de la CGR, marcados con fluorescencia. (C) M1 células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles que se identificó bajo epifluorescencia, blanco de células enteras de grabación, llenos de neurobiotin, y luego procesadas para inmunohistoquímica.

Esta técnica es aplicable a todas las grabaciones de células ganglionares de la retina de una retina aislada. Aunque en la línea de ratón utilizado anteriormente intrínsecamente fotosensibles, melanopsina expresar CGR se etiquetan con EGFP ^{2, 5,} este protocolo es fácilmente transferible a otras líneas de marcado con fluorescencia RGC o puede ser generalizada para grabar desde CGR seleccionados al azar también. Esta técnica es particularmente útil debido a que el cenador dendríticas de cada CGR y sus respectivas neuronas de entrada se deja completamente intacta. Las grabaciones pueden ser fácilmente realizadas en los modos de pinza de corriente o voltaje, celular conectado o suelto parches de configuración, o incluso puede ser utilizado para el parche nucleadas, dentro o fuera de las configuraciones, parches de membranas de las células ganglionares retinianas. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para grabar de marcado con fluorescencia células amacrinas desplazadas ⁷ o incluso a los no-desplazados amacrinas ⁸ Una de las limitaciones de la utilización de la fluorescencia para localizar las células ganglionares de la retina es que siempre debe ser expuesto a la luz para la identificación de RGC antes de la grabación . Por lo tanto, esta preparación puede no ser adecuado para la grabación de la barra las respuestas mediadas por menos cromóforo exógeno se incluye en la solución del baño y / o la ojera y el epitelio pigmentario retiniano se deja unida a la retina ^9. Si el objetivo es registrar la barra respuestas mediadas por la luz, entonces deben tomar precauciones especiales para evitar el blanqueo de la rodopsina fotopigmento. La disección debe realizarse bajo condiciones de luz infrarroja (es decir, ^10).

Para llevar a cabo una disección de éxito, es importante que la disección se realiza lo más rápidamente posible. Es especialmente importante que el vítreo se elimina correctamente con las pinzas. Si el vítreo está restantes, a continuación, después de la digestión enzimática de la retina se cubre con una película pegajosa hacer parches éxito difícil. Para obtener buenas grabaciones, es particularmente importante que la retina está bien oxigenada, lo que significa que la solución extracelular se burbujea con fuerza y ​​la velocidad de flujo es lo suficientemente alta a través de la cámara. También es importante para minimizar la exposición a la luz de los tejidos una vez que la retina está aislada de la ojera.

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Damos las gracias a Darwin la horca por su asistencia técnica.