Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

I primi passi nella visione di vertebrati hanno luogo quando la luce stimola i coni e bastoncelli della retina ^1. Queste informazioni vengono quindi segregati in quello che sono conosciuti come i percorsi di ON e OFF. Il segnale di fotorecettori informazioni luce alle cellule bipolari (BCS), che depolarizza in risposta ad un aumento (On ​​jacket) o diminuisce (Off jacket) di intensità luminosa. Questa separazione di informazioni luce viene mantenuta al livello delle cellule gangliari della retina (RGCs), che hanno dendriti stratificando sia nel sublamina Off dello strato interno plessiformi (IPL), dove ricevono input eccitatorio diretto da Off jacket, o stratificazione in il sublamina Uno degli IPL, dove ricevono input eccitatorio diretto da On jacket. Questa separazione di informazioni riguardanti aumenti o diminuzioni di illuminazione (On e Off percorsi) è conservato e segnalato al cervello in parallelo.

Il RGCs sono le cellule di uscita della retina, e sono quindi una cellula importante studiare per capire come le informazioni luce viene segnalata a nuclei visiva nel cervello. I progressi della genetica dei topi negli ultimi decenni hanno portato ad una serie di linee fluorescenti topo giornalista dove vengono etichettati specifiche popolazioni di RGC con una proteina fluorescente per permettere l'identificazione dei sottotipi RGC ^{2 3 4} e specifici mirati per la registrazione elettrofisiologiche. Qui, vi presentiamo un metodo per registrare le risposte luce da cellule gangliari fluorescente in un intatto, preparazione isolato della retina. Questa preparazione isolato retina permette di registrazioni dal RGCs dove il pergolato dendritiche è intatto e gli ingressi in tutto il pergolato intero dendritiche RGC sono conservati. Questo metodo è applicabile su una varietà di sottotipi di cellule gangliari ed è suscettibile di una vasta gamma di tecniche fisiologiche cella singola.

Animale Uso Dichiarazione: Gli animali sono stati curati in conformità con le linee guida descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, utilizzando i protocolli approvati dalla University of Animal Care Minnesota e del Comitato Istituzionale Usa.

1) Preparazione delle soluzioni

1. Prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica, soluzioni intracellulari, extracellulari, enzimi e devono essere preparati.
2. Extracellulare soluzione: mescolare una bottiglia (8.8g) di media in polvere Ames '(Sigma) con 1 l di H ₂ O e 1,9 g di bicarbonato di sodio (23 mm). In tutti i punti la soluzione extracellulare è saturo di O% 95 ₂ / 5% CO ₂ miscela di gas. Trasferire 200 mL in un recipiente per la conservazione della retina. Posto la soluzione rimanente nel contenitore perfusione sistema per perfusione gravità volta retina è montato.
3. Soluzione intracellulare: soluzione intracellulare avrebbe dovuto essere formulata in precedenza e poi aliquotati in 500-1000 microlitri aliquote e conservati a -20 ° C. Soluzione intracellulare varia a seconda della sperimentazione necessaria, per le registrazioni morsetto corrente mostrato qui usiamo (in mm): 125 K-gluconato, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH a 7,2 con KOH ^5. Un tracciante fluorescente come 10 mM Alexafluor-594 idrazide (Invitrogen) possono essere aggiunte per visualizzare dendriti durante l'esperimento, e neurobiotin (0,3%) può anche essere incluso per l'analisi di anatomia delle cellule a seguito di registrazione. Quando si è pronti a registrare, scongelare soluzione intracellulare.
4. Soluzione enzimatica: Combina 10000 disponibilità Collagenasi (Chimica Worthington) con 83 mg di ialuronidasi (Chimica Worthington) in 4,150 ml di soluzione extracellulare. Conservare in aliquote di 50 microlitri a -20 ° C. Aliquote può essere utilizzato per diverse settimane. Quando si è pronti a trattare la retina, aliquota diluire in 500 ml di soluzione bollito extracellulare.
5. Soluzione tampone fosfato (PBS): in 800 ml di H ₂ O aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,4 g di Na ₂ HPO ₄ e 0,24 g di KH ₂ PO _4. Portare il pH a 7,4 con NaOH. Regolare il volume di 1 L.
6. Tampone fosfato 0,2 M: In 800 ml di H ₂ O aggiungere 21,8 g di Na ₂ HPO ₄ e 6,4 g di NaH ₂ PO _4. Portare al volume di 1 L.
7. Paraformaldeide Soluzione 4%: Heat 50ml H ₂ O a 60 ° C. Aggiungi paraformaldeide 4g, mescolare per alcuni minuti. Aggiungere poche gocce di NaOH 1M (circa 5 gocce), continuando a mescolare fino a quando la soluzione è chiara. Aggiungere 50 ml di tampone fosfato 0,2 M in coppa. Controllare il pH con le strisce pH (~ 7,4). Filtrare e raffreddare.
8. Soluzione bloccante (siero di capra 10%, 0,5% TritonX100): in 1,8 ml di PBS aggiungere 0,2 ml di siero di capra e 10 L Triton X-100. TritonX-100 serve a permeabilise il tessuto.
9. Streptavidina soluzione (siero di capra al 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 streptavidina 594): in 1,9 ml di PBS aggiungere 0,1 ml di siero di capra, 10 microlitri Triton X-100 e 4 ml di streptavidina 594.

2) Isolamento di retina da mouse

Strumenti di dissezione necessari: 1 # 2 pinze, 2 # 5 pinze, forbici oftalmologica

1. Eutanasia del mouse secondo protocolli approvati, in questo caso CO ₂ asfissia e bulbo oculare enucleare delicatamente l'inserimento di un angolo # 2 pinze dietro l'occhio e il sollevamento fuori del bulbo oculare.
2. Posizionare il bulbo oculare in un piatto 35 millimetri di Petri con una soluzione extracellulare. Tagliare il nervo ottico e muscoli extraoculari ogni allegato o del tessuto connettivo con le forbici oftalmologica. Tagliare la cornea con una forbice oftalmologico ed estrarre la lente con # 5 pinze. Strappare la sclera con un paio di pinze # 5 e utilizzare le pinze per tagliare il nervo ottico in cui la retina e sclera riunisce presso la disco ottico. Buccia delicatamente la retina dalla oculare. Suggerimento: ogni passo su entrambe le retine prima di passare alla fase successiva per minimizzare i tempi.
3. Usare pinze per rimuovere vitreo attaccati alla retina. Questa operazione può essere eseguita da "afferrare" il vitreo trasparente sopra la retina con una pinza. Il vitreo, se rimosso correttamente, dovrebbe essere visibile come una chiara, sostanza gelatinosa sulle pinze. Suggerimento: Sfogliatrici retine a metà dopo la rimozione del corpo vitreo ci permetterà di ottimizzare la quantità di tessuto utilizzabile e fare montaggio nella camera più facile.
4. Mantenere la retina in ossigenato soluzione extracellulare a temperatura ambiente in un ambiente buio con il minimo di luce ambiente fino a quando non sono pronti per essere digerito. Retina possono essere memorizzati in questo modo per ~ 6 ore.

3) Il trattamento della retina con miscela di enzimi e di montaggio in camera di registrazione

1. Diluire una parte di collagenasi / ialuronidasi in 500 ul di soluzione extracellulare, soluzione posto in una capsula di Petri 35 millimetri ed il trasferimento della retina.
2. Mantenere la retina-contengonoING piastra di Petri, coperto e al buio, in una O2 95% / 5% CO ₂ ambiente per 15 minuti con agitazione. Questa fase aiuta a digerire qualsiasi residuo vetroso e consente un accesso più facile allo strato delle cellule gangliari. Suggerimento: per le retine da animali giovani con meno vitreo o se gli effetti avversi sono stati osservati, il tempo può essere ridotto a ~ 5 minuti.
3. Rimuovere retina da enzimi contenenti medie e lavare ampiamente in soluzione extracellulare
4. Trasferire la retina in camera di registrazione ⁶ con lo strato dei fotorecettori rivolto verso il basso. Liberano dal liquido rimanente sia con una pipetta o tessuto e stendere i lati della retina per appiattire tessuto facendo attenzione a toccare solo i bordi della retina, in particolare evitando il contatto con lo strato di cellule gangliari. Mettere un anello di platino con più di retina in nylon mesh per ancorare il tessuto e subito riempire la camera con la soluzione extracellulare.
5. Montare la camera di registrazione sul palco microscopio, allegare tubo per perfusione gravità e di aspirazione del vuoto e allegare filo di terra.

4) la localizzazione delle cellule gangliari EGFP esprimere e di stimolazione luminosa

1. Profumato la retina dalla forza di gravità con una soluzione extracellulare a 1 tassi mL / min o più veloce. Suggerimento: se tasso di perfusione è troppo lento, il tessuto non sarà sufficientemente ossigenato e segnalazione sinaptica possono essere disturbati.
2. Riempire una pipetta di registrazione con soluzione intracellulare e inserirla nel supporto pipetta. Suggerimento: Pipette con resistenze nel range da 3 a 5MΩ dare i migliori risultati.
3. Visualizza la retina sotto infrarossi contrasto differenziale di interferenza (DIC) ottiche a basso ingrandimento (obiettivo 10X, NA 0,3) di localizzare la pipetta di registrazione. La luce infrarossa viene utilizzato per minimizzare l'esposizione della retina alla luce visibile e minimizzare l'adattamento alla luce. Sposta in alto ingrandimento (obiettivo 40X, NA 0,8) e porta elettrodo in vista appena sopra il tessuto.
4. A forte ingrandimento (obiettivo 40X), illuminare la retina con epifluorescenza (480 nm per EGFP) e selezionare una cella fluorescente ganglio e segnare su un monitor con del nastro (Figura 1A).
5. Sotto illuminazione DIC e infrarossi, la posizione l'elettrodo di registrazione presso la cellula gangliare mirati (Figura 1A). Pulire l'area immediatamente copertura delle cellule, applicando leggera pressione positiva di elettrodi di registrazione con una siringa di plastica 12cc collegato al titolare pipetta con tubi in polietilene. L'amplificatore, zero eventuali compensazioni di tensione. Elettrodo posto su cellule gangliari selezionato fino a una fossetta appare sulla superficie cellulare.
6. Con l'amplificatore in modalità morsetto tensione, applicare un impulso di testare e monitorare la corrente che passa attraverso la pipetta. Applicare una pressione negativa per creare tenuta tra elettrodi e cellule. Rilascio della pressione negativa quando cellula comincia a sigillare e attendere corrente di mantenimento è indicativo di un sigillo GΩ elettrico tra membrana della cellula e pipetta. Applicare gli impulsi gentile di pressione negativa fino transitori capacitivi apparire e quindi rilasciare qualsiasi applicazione di pressione. Suggerimento: se l'accesso (serie) la resistenza è alta (> 30MΩ), questo può essere migliorata da ulteriori, molto gentile, gli impulsi di pressione negativa.
7. Una volta un sigillo stabile è stato raggiunto applicare un impulso di pressione negativa. Dopo modalità cellula intera si ottiene, permettono cellula di adattarsi buio per 5 minuti. Record, in modalità corrente morsetto, risposta a tutto campo, la stimolazione luce bianca (Figura 1B).
8. Successivamente alla registrazione, Alexafluor-594 sarà diffusa al dendriti. Il tracciante possono essere visualizzate in epifluorescenza a 594 nm e utilizzato per determinare se una cellula gangliare è On-, Off-o bi-stratificato per il passaggio tra ottica e infrarossa epifluorescenza DIC ^5.
9. Se neurobiotin è inclusa nella pipetta e retina sta per essere trattati per immunoistochimica, allora pipetta deve essere delicatamente retratto per fornire minima rottura della membrana.

5) Analisi di anatomia delle cellule gangliari registrati

Riempimento con neurobiotin permette per un'analisi più dettagliata morfologica delle cellule gangliari a seguito della registrazione. Suggerimento: se specifiche correlazioni tra una cellula gangliare registrato e morfologia dettagliata è desiderato, può essere meglio per la registrazione e compilare un solo RGC per la preparazione.

1. Se neurobiotin è stato incluso nella soluzione intracellulare poi posto la retina in soluzione paraformaldeide e fissare una notte a 4 ° C.
2. Sciacquare in PBS, almeno 2 ore, almeno 6 ricambi. Trasferire la retina di un piatto contenente soluzione di blocco. Lasciare in blocco soluzione per 2 ore, temperatura ambiente su agitatore.
3. Sostituire la soluzione di saturazione con la soluzione Streptavidina. Incubare 2 giorni a 4 ° C su agitatore. Sciacquare la retina in PBS, 6 risciacqui, 20 min ciascuna.
4. Montare la retina con Vectashield in un vetrino.La retina deve essere posto con le cellule gangliari in su. Eseguire la microscopia confocale (Figura 1C).

Rappresentante Risultati

Se la retina è sana e la dissezione ha avuto successo, le cellule gangliari individuo dovrebbe essere visibile sotto DIC a forte ingrandimento (Figura 1A). Retine malsano avrà grandi, nuclei granulato e dovrebbe essere scartato. Se la risposta sinaptica di una cellula gangliare dato è intatto, allora la cellula deve rispondere di esordio luce o offset con potenziali d'azione e, nel caso di cellule gangliari intrinseca fotosensibile (Figura 1B), una depolarizzazione prolungata.

Figura 1. Localizzazione, registrazione e colorazione di una cella fluorescente gangliari della retina. (A) RGC GFP positive visualizzati sotto illuminazione epifluorescente con ingrandimento 40X (pannello a sinistra) e sotto illuminazione DIC (pannello di destra). (B) risposta Synaptic luce di un M2 cellule gangliari della retina fotosensibile intrinsecamente registrato per intero a cellule modalità morsetto corrente da RGC fluorescente. (C) M1 delle cellule gangliari della retina intrinsecamente fotosensibile che è stato identificato in epifluorescenza, mirati per intero a cellule di registrazione, pieno di neurobiotin, e poi trattati per immunoistochimica.

Questa tecnica è applicabile a qualsiasi registrazioni delle cellule gangliari della retina da una retina isolata. Anche se in linea di mouse usato soprattutto intrinsecamente fotosensibili, melanopsina che esprimono RGCs sono etichettati con EGFP ^{2, 5,} questo protocollo è facilmente trasferibile anche ad altre linee fluorescente RGC o può essere generalizzata a registrare da RGCs selezionati casualmente pure. Questa tecnica è particolarmente prezioso perché il pergolato dendritiche di ogni RGC e dei suoi neuroni di input rispettivi vengono lasciati completamente intatti. Le registrazioni possono essere facilmente eseguito in modalità morsetto corrente o tensione, cellule-attached o loose-patch di configurazione, o può anche essere utilizzato per cerotto nucleate, all'interno o all'esterno-out configurazioni di patch da membrane delle cellule gangliari retiniche. Questa tecnica può essere facilmente adattato a registrare da fluorescente cellule amacrine sfollati ⁷ o anche cellule amacrine non sfollate ⁸ Una limitazione dell'utilizzo di fluorescenza a localizzare le cellule gangliari della retina è che deve sempre essere esposto alla luce per l'identificazione RGC prima della registrazione . Così, questa preparazione può non essere adatto per la registrazione asta-mediata risposte meno cromoforo esogeno è incluso nella soluzione vasca e / o l'oculare e dell'epitelio pigmentato retinico sono rimasti attaccati alla retina ^9. Se l'obiettivo è di registrare asta-mediata risposte luce, particolari precauzioni devono essere prese per evitare lo sbiancamento della rodopsina fotopigmento. La dissezione deve essere effettuata in condizioni di luce infrarossa (cioè ^10).

Per eseguire una dissezione di successo, è importante che la dissezione essere eseguita il più rapidamente possibile. È particolarmente importante che il vitreo essere rimosso con successo con le pinze. Se il vitreo è ancora, seguendo poi la digestione enzimatica della retina sarà ricoperta da una pellicola appiccicosa rende difficile l'applicazione di patch di successo. Per ottenere buone registrazioni, è particolarmente importante che la retina è ben ossigenato, il che significa che la soluzione extracellulare viene vigorosamente bolliti e la portata è sufficientemente elevato attraverso la camera. E 'anche importante ridurre al minimo l'esposizione alla luce del tessuto una volta che la retina è isolato dal oculare.

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Ringraziamo Darwin Hang per la sua assistenza tecnica.