Высвобождение дофамина в пресинаптические терминалы Индивидуальные Визуализированные с FFNs

Новые средства для измерения нейротрансмиссии оптически с помощью флуоресцентного аналоги дофамина.

Нервная система передает сигналы между нейронами с помощью нейромедиатора выпуска во время синаптической слияния пузырьков. Чтобы наблюдать поглощение нейромедиатора и освобождение от отдельных пресинаптических окончаний напрямую, мы создали флуоресцентного ложных нейротрансмиттеров в качестве подложек для синаптических пузырьков моноаминов транспортер. С помощью этих зондов для изображения высвобождение дофамина в полосатом теле, мы сделали несколько замечаний, относящихся к синаптической пластичности. Мы обнаружили, что фракция синаптических пузырьков освобождения медиатора в стимул зависела от частоты стимула. Кинетически различных "резерв" синаптических пузырьков населения не наблюдалось в этих экспериментальных условиях. Частотно-зависимого неоднородность пресинаптические терминалы было выявлено, что было частично зависит D2 дофаминовых рецепторов, что указывает на механизм частотно-зависимого кодирования пресинаптического выделения.

Чжан Хуэй и Нико Г. Губернатор способствовали в равной степени к этой работе.

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Губернатор и соавт., Наука 324 (5933). 1441-1444 (2009) .

1. Подготовка острой полосатой ломтиками

1. Перед приготовлением острой полосатой ломтиками, нужно кислородом искусственной цереброспинальной жидкости (ASCF) и охладите ее со льдом, по крайней мере за 15 минут до мозга добычи. Держите холодной ACSF льда и кислородом во время вскрытия. ACSF (в мМ): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO ₃ 26, CaCl ₂ 2.4, MgSO4 1,3, KH ₂ PO ₄ 0,3, глюкоза 10, HEPES 5; рН 7.3-7.4, 290-295 мОсм.
2. Обезглавьте самца мыши без анестезии.
3. Извлечение весь мозг от мыши, и закрепить его на vibratome лоток сделан на использовании vibratome Krazy ® клея. Извлечение мозга и монтажа должно быть сделано в течение 2 минут. В это время, не забудьте сохранить холодную ACSF льда и кислородом сохранить ткани здоровой.
4. Вырезать корональных полосатой ломтики мозга на 250 мкм толщиной от 1,54 до брегмы 0,62 ^1. Целых три ломтика будет получено, которые затем могут быть сокращены на 6 half ломтики с помощью иглы.
5. Инкубируйте мозга кислородом ломтики в ACSF при комнатной температуре в течение по крайней мере за 1 час до датчика нагрузки. Ломтики проявить добрую FFN511 загрузке и остаются активными для работы с изображениями до 4-х часов после среза подготовки.

2. Загрузка FFN511

1. Подготовка FFN511 загрузки решения (10 мкм FFN511 в ACSF); также подготовить 100 мкм ADVASEP-7 в ACSF. Все решения должны быть подготовлены свежо и кислородом в течение 15 минут до начала погрузки в ломтиками.
2. Индивидуально инкубировать с ломтиком FFN511 загрузки решение в течение 30 минут при комнатной температуре.
3. Затем удалите красителя связаны с внеклеточной ткани путем инкубации срезов в загружены кислородом 100 мкм ADVASEP-7 ACSF в течение 30 минут при комнатной температуре ^2. Ломтики теперь готовы для работы с изображениями.

3. FFN511 изображений в мозге ломтиками

Визуализация FFN511 в ломтиками осуществляется с использованием многофотонного лазерного сканирующего микроскопа. Мы используем Prairie Ultima многофотонной лазерной сканирующей микроскопии (Мы использовали Zeiss LSM 510 NLO многофотонной лазерной сканирующей микроскопии ранее, и некоторые результаты были получены с микроскопом Zeiss).

1. Место FFN511 загружены ломтик в записи камеры (РК-27L, Warner) и переливать с кислородом ACSF при расходе 1-2 мл в минуту. Затем поместите платины арфы с нейлоновыми струнами сверху ломтик, чтобы минимизировать движение во время эксперимента. Для дальнейшей минимизации движения, позволяют ломтик стабилизироваться в течение как минимум 10 минут в камере до визуализации.
2. Визуализируйте и найдите спинной полосатом теле с яркое свечение поле под 10-кратным цель погружением в воду.
3. Место и положение биполярные электроды витой вольфрама в этом регионе, если выполнение стимуляции эксперимента. Идеальным местом изображений находится в пределах 300 мкм между двумя кончиками стимулирующий электрод биполярный. Поместите этот регион в центре поля зрения.
4. Изображение FFN511 меченных полосатой терминалы, находящиеся под 63x (0,9 NA) воды ультрафиолетовым цель погружения. FFN511 возбуждается при 760 нм с Mai Tai лазера от Спектральный физики и оптимальной флуоресценции полосатой терминалов рассматривается через полосовой фильтр (480-520 нм). Изображения захватываются в 12-битном формате с 75 х 75 мкм регионах, представляющих интерес в 512 х 512 пикселей. Для стимулировали destaining экспериментов, чтобы компенсировать оси смену, Z-серии 5-7 изображений, на расстоянии 1 мкм в г-плоскости, получается для каждого периода времени.

4. FFN511 Destaining

FFN511 метка может быть либо обесцвечивают высокой концентрацией KCl (мы используем 70 мМ KCl), (+)-амфетамина сульфат (Amph, 20 мкМ) или электрическая стимуляция. В KCl эксперимент destaining, когда решение высокой ACSF калия применяется для мозга ломтик, FFN511 этикетке destains в течение 2 минут. Запись XYZ-т изображений для отслеживания FFN511 destaining с течением времени. Ниже описаны электрической стимуляции зависит от допамина терминал destaining:

1. Для отслеживания FFN511 destaining с течением времени, XYZ-т изображения записываются. Чтобы обеспечить минимальное движение среза (менее 4 мкм оси) и не фотообесцвечивания лазером, контроль временных рядов изображений Z-Stack должно быть получено не менее 5 минут до начала стимуляции. В противном случае, отрегулируйте мощности лазера.
2. После этих контрольных изображений, продолжают XYZ-т визуализации в то время как начать стимуляцию на частотах 1, 4 или 20 Гц. Стимулы на 1, 4 или 20 Гц (300 мкс х 1 мА) применяются к стриатума локально Iso-Flex стимул изолятор вызвана мастер-8 генератор импульсов (Ampi, Иерусалим, Израиль) с использованием биполярных электродов. Чтобы свести к минимумуИзменение деполяризации релиз сайты, мы использовали стимуляцию протокол применения 150% от максимальной интенсивности стимуляции определяется циклической вольтамперометрии.
3. Используйте соответствующее программное обеспечение для работы с изображениями анализа. В нашей лаборатории мы используем изображение J (Wayne Rosband, Национальные институты здравоохранения, Роквилл, штат Мэриленд) и специально написанный программного обеспечения в IDL (Research Systems, Boulder, CO) количественно puncta флуоресценции и изменяется с time3.

Результаты Represenative

На рисунке 1 показана FFN511 загрузки в полосатой часть завершена. Представитель изображения с помощью 10x и 60x цели показаны на рис.1. Селективной маркировки допамин терминалы могут быть обесцвечивали на 20 мкМ амфетамин.
На рисунке 2 показан destaining из FFN511 маркировки высокой KCl.
На рисунке 3 показана destaining из FFN511 маркировки местными электрической стимуляции.

Рисунок 1 FFN511 этикетки допамин терминалы в живых корково-полосатой острых срезов () маркировке FFN511 при острых жить корково-полосатой срез:.. Обильные маркировки в полосатом теле (СТО), редкой маркировки в коре головного мозга (CTX), а не метку в мозолистого тела (CC). Шкала по сайту:. 100 мкм (б) Destaining из FFN511 от стриатума на амфетамин. Левая панель: прежде, чем амфетамин, справа панели: после 20 минут 20 мкМ амфетамин. Шкала бар: 10 мкм.

Рисунок 2. Destaining из FFN511 маркировки высокой KCl. FFN511 маркировки обесцвечивают в течение 2 мин применением 70 мМ KCl в ACSF. Шкала бар: 10 мкм.

Рисунок 3. Частотно-зависимые destaining из FFN511 маркировки в полосатом теле. () Местное стимуляции с частотой 4 Гц привело к destaining из терминалов. Стимуляция началась в т = 0. Шкала бар: 5 мкм (б) Destaining из FFN511 с частотой 4 Гц является Са ^{2 +} - и зависит от частоты.. Управление не получил стимуляции (153 puncta от 3 ломтика). Destaining с хлорида кадмия (200 мкМ) была идентична нестимулированных управления (475 puncta от 5 ломтиков). Destaining кривые для каждого стимуляции частоты были пригодны одной экспоненциальной функцией распада и полураспада (T _{1 / 2)} значения, рассчитанные как τ х 0,693 (1 Гц: 765 puncta с 9 ломтиками, 4 Гц: 410 puncta от 7 ломтиками, 20 Гц: 416 puncta из 6 частей). Пожалуйста, обратитесь к видео микрофотография из 2-фотонной микроскопии FFN511 destaining во время экзоцитоза в полосатой подготовки срез мозга.

В этом видео мы продемонстрируем метод для визуализации нейротрансмиссии оптически с помощью флуоресцентного аналоги дофамина. FFN511 это первое поколение FFNs мы разработали. Хотя он был разработан ориентации нейронов везикулярного транспортера моноаминов (VMAT2), который несет моноаминов нейротрансмиттеров из цитоплазмы в синаптические пузырьки, и, в частности этикетки допамин терминалы в полосатом теле и предполагаемой катехоламинов и / или серотонина терминалов в коре головного мозга (как показано в науке бумаги), соответствующий период загрузки имеет решающее значение для специфичности с FFN511 относительно гидрофобными. Мы обнаружили, что инкубации в течение более 40 минут приведет к обширным неспецифическим окрашивания в полосатой ломтиками. Специфичность может быть прямо определены destaining использованием высокой концентрации хлорида калия, который должен вызвать высвобождение FFN пределах функциональной синаптических пузырьков. Воздействие на квант FFN511 менее чем за 15 минут может привести к слабым флуоресцентный сигнал из-за недостаточной загрузки красителя в терминалах. В этом протоколе, мы используем 100 мкм ADVASEP-7 для удаления красителей связаны с внеклеточной ткани. Этот шаг не является необходимым, но если это не указано, смыв время в ACSF должна быть продлена. Таким образом, в зависимости от подготовки вы выбрали, вам необходимо изменить концентрацию и период загрузки, чтобы определить оптимальную маркировки.

The authors have nothing to disclose.

Д. Сеймс благодаря Г. Гарольд и Лейла Ю. Mathers благотворительный фонд и инициативы Колумбийского университета в области науки и техники.
Д. Сеймс и Д. Sulzer поблагодарить McKnight Фонд McKnight Технологические инновации в премии Neuroscience
Д. Sulzer благодаря NIDA, NIMH, и Picower и фонды Болезнь Паркинсона.
Х. Чжан благодаря NARSAD.
RH Эдвардс благодаря Майкл Дж. Фокс Фонд, Национальный Фонд Паркинсона, NIDA и NIMH.
Мы благодарим Роберта Берка для 6-OHDA инъекции, а также советы, Марк Сондерс за полезные обсуждения, Мерек Сиу для программирования анализа изображений, и Ян Schmoranzer на техническую поддержку с установкой микроскопии TIRF.