Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

Ein neues Mittel, um Neurotransmission optisch messen unter Verwendung von fluoreszierenden Dopamin-Analoga.

Das Nervensystem überträgt Signale zwischen den Neuronen über die Freisetzung von Neurotransmittern im synaptischen Vesikel Fusion. Zur Beobachtung Neurotransmitter Aufnahme und Abgabe von einzelnen präsynaptischen direkt, haben wir fluoreszierende falsche Neurotransmitter als Substrate für die synaptische Vesikel Monoamin-Transporter. Mit diesen Sonden Bild Freisetzung von Dopamin im Striatum, machten wir einige Beobachtungen relevant für synaptische Plastizität. Wir fanden, dass der Anteil von synaptischen Vesikeln Freisetzung von Neurotransmittern pro Stimulus abhängig von der Reizfrequenz war. Ein kinetisch unterschiedliche "Reserve" synaptischer Vesikel Bevölkerung war nicht unter diesen experimentellen Bedingungen beobachtet. Eine Frequenz-abhängige Heterogenität der präsynaptischen zeigte sich, dass abhängig war zum Teil auf D2 Dopamin-Rezeptoren, was auf einen Mechanismus für die frequenzabhängige Codierung der präsynaptischen Auswahl.

Hui Zhang und Niko G. Gubernator trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009) .

1. Vorbereitung akuten striatalen Scheiben

1. Vor der Zubereitung akute striatalen Scheiben, muss man mit Sauerstoff die künstliche Liquor (ASCF) und Chill es mit Eis für mindestens 15 Minuten vor dem Gehirn Extraktion. Halten Sie das ACSF eiskalt und Sauerstoff während der Präparation. ACSF (in mM): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO ₃ 26, CaCl ₂ 2,4, MgSO4 1,3, KH ₂ PO ₄ 0,3, Glucose 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm.
2. Enthaupten männliche Maus ohne Narkose.
3. Entpacken Sie das ganze Gehirn der Maus, und montieren Sie ihn auf der Vibratom Tablett auf dem Vibratom mit Krazy ® Kleber platziert. Brain-Extraktion und Montage müssen innerhalb von 2 Minuten durchgeführt werden. Während dieser Zeit müssen Sie die ACSF Eis kalt zu halten und mit Sauerstoff zu halten das Gewebe gesund.
4. Cut koronalen striatalen Hirnschnitten bei 250μm Dicke zwischen Bregma 1,54 bis 0,62 ^1. Drei ganze Scheiben wird erhalten, die dann in 6 halbe Scheiben mit einer Nadel geschnitten werden.
5. Inkubieren Sie die Hirnschnitten in Sauerstoff ACSF bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor Sonde loading. Slices zeigen gute FFN511 Laden und bleiben für die Bildgebung bis zu 4 Stunden nach der Scheibe Vorbereitung aktiv.

2. Loading FFN511

1. Bereiten FFN511 loading-Lösung (10 um FFN511 in ACSF); bereiten auch 100 &mgr; ADVASEP-7 in ACSF. Alle Lösungen sollten frisch zubereitet werden und mit Sauerstoff versorgt, mindestens 15 Minuten vor dem Laden in die Scheiben.
2. Individuell inkubieren Scheibe mit FFN511 loading Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Dann entfernen Sie den Farbstoff gebunden an extrazelluläre Gewebe durch Inkubation der beladenen Scheibe in Sauerstoff 100 &mgr; ADVASEP-7 ACSF für 30 Minuten bei Raumtemperatur ^2. Slices sind nun bereit für die Bildgebung.

3. Imaging FFN511 in den Hirnschnitten

Imaging von FFN511 in den Scheiben wird mit Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop. Wir sind mit einem Prairie Ultima Multiphotonen Laser Scanning Mikroskop (Wir waren mit einem Zeiss LSM 510 NLO Multiphotonen Laser Scanning Mikroskop zuvor und einige Ergebnisse wurden mit dem Zeiss-Mikroskop erhalten).

1. Legen Sie die FFN511 belasteten Scheibe in der Aufnahme Kammer (RC-27L, Warner) und superfuse mit sauerstoffreichem ACSF bei einer Flussrate von 1-2 ml pro Minute. Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylon-Saiten auf der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. Zur weiteren Minimierung Bewegung, damit die Scheibe für mindestens 10 Minuten in der Kammer vor der Aufnahme zu stabilisieren.
2. Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10x Wasser Immersionsobjektiv.
3. Ort und Lage der bipolaren twisted Wolframelektroden in dieser Region, wenn die Durchführung einer Stimulation zu experimentieren. Die ideale Imaging-Bereich ist in 300 um zwischen den beiden Spitzen der anregenden bipolaren Elektrode befindet. Platzieren Sie diesen Bereich in der Mitte des Gesichtsfeldes.
4. Bild FFN511-markierten striatalen Klemmen unter einem 63x (0,9 NA) Eintauchen in Wasser UV-Ziel. FFN511 wird bei 760 nm mit einem Mai Tai Laser von Spectral Physik und optimale Fluoreszenz der striatalen Klemmen gespannt wird durch ein Bandpassfilter (480-520 nm) zu sehen. Die Bilder werden in 12-Bit-Format mit 75 x 75 um regions of interest in 512 x 512 Pixel Auflösung erfasst. Für stimuliert Entfärben Experimente ist es, für z-Achse verschieben, ein z-Serie von 5-7 Bildern, von 1 um in der z-Ebene getrennt, Ausgleich für jeden Zeitraum erhalten.

4. FFN511 Entfärbung

Die FFN511 Etikett kann entweder durch eine hohe Konzentration von KCl (wir verwenden 70 mM KCl), (+)-Amphetamin Sulfat (AMPH, 20 uM) oder elektrische Stimulation entfärbt werden. In der KCl Entfärben Experiment, wenn eine hohe Kalium-ACSF Lösung der Hirnschnitt angewendet wird, die FFN511 Label destains innerhalb von 2 Minuten. Rekord xyz-t Bilder FFN511 Entfärbung im Laufe der Zeit zu verfolgen. Im Folgenden werden elektrische Stimulation abhängig Dopamin-Terminal Entfärben:

1. So verfolgen FFN511 Entfärbung im Laufe der Zeit sind xyz-t Bilder aufgezeichnet. Um sicherzustellen, minimale Bewegung der Scheibe (weniger als 4 um in z-Achse) und kein Ausbleichen durch den Laser-, Steuer-Zeitreihen Bilder der z-Stapel sollte für mindestens 5 Minuten vor der Stimulation erreicht werden. Andernfalls ist die Laserleistung.
2. Im Anschluss an diese Kontrolle Bilder, weiterhin die xyz-t Bildgebung während Start der Stimulation bei Frequenzen von 1, 4 oder 20 Hz. Stimuli bei 1, 4 oder 20 Hz (300 us x 1 mA) sind das Striatum vor Ort durch eine Iso-Flex Stimulus Isolator durch einen Master-8 Impulsgeber (AMPI, Jerusalem, Israel) unter Verwendung von bipolaren Elektroden ausgelöst angewendet. Zur Minimierung derdie Variation in der Depolarisation der Freigabe Seiten haben wir eine Stimulation verwendete Protokoll Anwendung 150% der maximalen Intensität der Stimulation durch Cyclovoltammetrie bestimmt.
3. Verwenden Sie geeignete Software für die Bildanalyse. In unserem Labor verwenden wir Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) und speziell geschriebenen Software IDL (Research Systems, Boulder, CO), um die puncta Fluoreszenz und die Änderungen mit Time3 quantifizieren.

Represenative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt FFN511 Laden in striatalen Scheibe ist nun abgeschlossen. Repräsentative Bilder mit 10x und 60x objektiv sind in Abb. 1 dargestellt. Die selektive Markierung von Dopamin-Terminals kann durch 20 uM Amphetamin entfärbt werden.
Abbildung 2 zeigt Entfärbung FFN511 Kennzeichnung durch hohe KCl.
Abbildung 3 zeigt Entfärbung FFN511 Kennzeichnung durch lokale elektrische Stimulation.

Abbildung 1 FFN511 Etiketten Dopamin-Terminals in Live-kortikalen-striatalen akuten Scheiben (A) Markierung von FFN511 in akuten leben kortikalen-striatalen Scheibe:.. Reichlich Kennzeichnung im Striatum (STR), spärlicher Kennzeichnung in Cortex (CTX) und kein Label in Corpus Callosum (CC). Maßstab:. 100 &mgr; m (B) der Entfärbung FFN511 aus dem Striatum von Amphetamin. Left-Panels: vor Amphetamin, rechts-Panels: nach 20 Minuten von 20 uM Amphetamin. Maßstab: 10 pm.

Abbildung 2. Entfärbung von FFN511 Kennzeichnung durch hohe KCl. FFN511 Kennzeichnung ist innerhalb von 2 min Anwendung von 70 mM KCl in ACSF entfärbt. Maßstab: 10 um.

Abbildung 3. Frequenzabhängige Entfärbung FFN511 Kennzeichnung im Striatum. (A) Lokale Stimulation bei 4 Hz ergab Entfärbung von den Terminals entfernt. Stimulation begann bei t = 0 ist. Maßstabsbalken: 5 m (B) Entfärbung von FFN511 bei 4 Hz ist Ca ^{2 +} - und frequenzabhängig.. Kontrollen erhielten keine Stimulation (153 puncta von 3 Scheiben). Entfärbung mit Cadmiumchlorid (200 uM) war identisch mit unstimulierten Kontrollen (475 puncta von 5 Scheiben). Die Entfärbung Kurven für jede Stimulationsfrequenz wurden von einem einzigen exponentiellen Funktion und die Halbwertszeit (t _{1 / 2)} fit Werte berechnet τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta von 9 Scheiben, 4 Hz: 410 puncta von 7 Scheiben, 20 Hz: 416 puncta von 6 Scheiben). Bitte beachten Sie die Video-Aufnahme von 2-Photonen-Mikroskopie von FFN511 Entfärbung während Exozytose in einem striatalen Hirnschnitten Vorbereitung.

In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Neurotransmission optisch sichtbar unter Verwendung von fluoreszierenden Dopamin-Analoga. FFN511 ist die erste Generation der FFNs wir entwickelt haben. Es war zwar indem sie auf die neuronale vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT2), die Monoamin-Neurotransmittern führt aus dem Zytoplasma in synaptische Vesikel, insbesondere Etiketten Dopamin im Striatum und vermutet, Katecholamin-und / oder Serotonin-Terminals in der Hirnrinde (wie in der Wissenschaft gezeigt ausgelegt Papier), wird eine entsprechende Belastungsdauer entscheidend für die Spezifität, da FFN511 ist relativ hydrophob. Wir fanden, dass die Inkubation länger als 40 Minuten wird in umfangreichen spezifische Färbung in striatalen Scheiben führen. Die Spezifität kann unkompliziert durch Entfärbung mit einer hohen Konzentration von KCl, die die Freisetzung von FFN innerhalb funktionaler synaptischen Vesikeln sollte Ursache ermittelt werden. Die Exposition der Scheibe zu FFN511 für weniger als 15 Minuten wird in schwachen Fluoreszenzsignal aufgrund unzureichender Belastung der Farbstoff in den Terminals führen. In diesem Protokoll, verwenden wir 100 &mgr; ADVASEP-7, um den Farbstoff gebunden an extrazelluläre Gewebe zu entfernen. Dieser Schritt ist nicht notwendig, aber wenn es weggelassen wird, muss die Auswaschzeit in ACSF verlängert werden. Zusammenfassend, abhängig von der Vorbereitung Sie gewählt haben, werden Sie brauchen, um die Konzentration und Belastungsdauer zu modifizieren, um eine optimale Kennzeichnung zu bestimmen.

The authors have nothing to disclose.

D. Sames dank der G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation und der Columbia University Initiativen in Science and Engineering.
D. Sames und D. Sulzer danken der McKnight Foundation for The McKnight Technologische Innovationen in Neuroscience-Preis
D. Sulzer dank NIDA, NIMH, und die Picower und Morbus Parkinson Foundations.
H. Zhang dank NARSAD.
RH Edwards dank der Michael J. Fox Foundation, der National Parkinson Foundation, NIDA und NIMH.
Wir danken Robert Burke für 6-OHDA-Injektionen und Beratung, Mark Sonders für nützliche Diskussion, Merek Siu für Bildanalyse-Programmierung, und Jan Schmoranzer für technische Unterstützung bei der TIRF-Mikroskopie-Setup.