Este protocolo permite o cultivo in vitro e a visualização microscópica direta dos tecidos isolados das vias aéreas durante diferentes procedimentos de manipulação tecidual, como deselitelite e regeneração tecidual das vias aéreas. A imagem in situ proposta neste estudo permite o monitoramento rápido e não destrutivo do lúmen traqueal durante a remoção controlada guiada por imagens do epitélio endógeno e a entrega das células exógenas. A plataforma bioreativa guiada por imagem e os protocolos de manipulação de tecidos podem ser usados para gerar tecido bioengenheiro das vias aéreas para modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos.
A construção e o uso do bioreator de tecido das vias aéreas habilitado para imagem serão demonstrados por dois estudantes de doutorado do nosso grupo de pesquisa, Mohammad Mir, e Jiawen Chen. Para começar a criar um dispositivo de imagem in situ, insira uma lente de tubo em um tubo de lente empilhável e fixe-a usando um anel de retenção. Em seguida, monte o conjunto da mesa da lente em uma câmera CMOS científica através de um adaptador de montagem C.
Use o software Micromanager para operar a câmera e adquirir fotos e vídeos. Ao mirar em um objeto localizado a 10 metros da câmera, ajuste a distância entre a lente do tubo e o sensor de imagem da câmera até que uma imagem focalizada do objeto seja formada na tela do computador. Em seguida, use componentes do sistema de gaiola óptica, como haste de montagem, placa de gaiola roscada e cubo de gaiola para montar uma lente de filtro em um espelho de borda dupla, super resolução, retrodicromica e um laser para o dispositivo.
Conecte uma lente objetiva de 20X ao dispositivo. Em seguida, monte uma lente verde com um diâmetro de 500 micrômetros na extremidade distal do tubo da lente através do tradutor X-Y. Ajuste a distância entre as lentes verdes e objetivas para formar as imagens microscópicas focadas.
Para visualizar o lúmen de traqueia de rato isolado em campo brilhante ou fluorescente, coloque o bioreator no estágio de imagem. Em seguida, infundir 500 microliters da carboxyfluoresceina recém-preparada éster succinimidyl, ou solução CFSE, a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto através da traqueia através da bomba de seringa conectada ao tubo da cânula traqueia. Uma vez que a solução CFSE encha a traqueia, pare a bomba.
Após 10 minutos, lave o lúmen de traqueia infundindo 10 mililitros de PBS usando a bomba de seringa para remover os reagentes CFSE não incorporados residuais. Após a lavagem, insira a extremidade de imagem distal da lente verde na traqueia através do conector luer ligado a uma extremidade da traqueia. Em seguida, mova suavemente a lente verde dentro da traqueia até que a superfície da traqueia esteja focada.
Para capturar as imagens de campo brilhante no software de microgerente, ilumine o lúmen traqueia com luz branca através do cubo da gaiola. Em seguida, clique no ícone Live para mostrar a superfície lúmenal da traqueia em tempo real. Use a configuração de imagem e as guias Exposição para alterar o tempo de exposição ao valor desejado.
Para ajustar o contraste e o brilho das imagens, use o histograma e a janela de escala de intensidade para mover setas pretas e brancas no ponto final do display de histograma interativo. Clique em Parar ao vivo para ativar o ícone 'Snap' e clique no ícone 'Snap' para congelar a imagem. Em seguida, use a configuração Exportar e então Imagens como guias deslocadas para salvar as imagens no formato desejado.
Para obter fotos e vídeos em um modo fluorescente, ilumine o lúmen da traqueia com luz laser específica cfse através do cubo da gaiola e adquira as imagens em tempo real movendo a sonda de imagem para frente e para trás. Uma vez que as fotos e vídeos são obtidos, remova suavemente a lente verde da traqueia. Para a desepilação da traqueia, incutir 50 microlitradores do sulfato de dodecil de 2%de sódio recém-preparado através da cânula da traqueia para gerar um filme fino da solução detergente sobre o lúmen traqueia.
Após a instilação, feche as conexões de tubo do bioreator usando plugues de luer masculino ou feminino e transfira o bioreator para uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 minutos para permitir que o SDS habite dentro da traqueia. Repita a instilação uma vez. Após a segunda instilação, remova o epitélio e a SDS irrigando o lúmen traqueia três vezes com 500 microliters de PBS através de bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.
Em seguida, coloque o bioreator em um agitador para vibrar mecanicamente em uma frequência de 20 Hertz e uma amplitude de deslocamento de 0,3 milímetros para promover fisicamente o descolamento das células epiteliais tratadas com SDS do lúmen traqueia. Enquanto a traqueia é mecanicamente vibrada, instila 500 microliters de PBS duas vezes através do lúmen traqueia para remover o SDS residual e detritos celulares. Após a remoção do epitélio, avalie a liberação da camada epitelial medindo a intensidade do CFSE usando o dispositivo de imagem da lente verde.
Depois de preparar uma traqueia de rato des epitelializada, descongele células-tronco mesenquimais congeladas, ou MSCs, por 30 segundos em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, conte as células com um hemótmetro, seguido pela preparação de uma solução celular com uma concentração de cinco vezes 10 para as seis células por mililitro. Em seguida, rotule as células fluorescentes incubando-as com dois mililitros de solução CFSE de 100 micromolar a temperatura ambiente.
Após 15 minutos, enxágue as células com cinco mililitros de PBS três vezes antes de resumá-las em um meio de cultura DMEM fresco em uma concentração final de três vezes 10 às sete células por mililitro. Imediatamente após a preparação do hidrogel de colágeno I, como descrito no manuscrito, adicione as células à solução de hidrogel com a concentração desejada. Em seguida, misture as células e a solução de gel com uma micropipette para obter uma mistura uniforme de hidrogel celular.
Em seguida, conecte uma extremidade da traqueia dentro do bioreator a uma bomba de seringa programável através de um conector de luer e entregue cinco mililitros de meio de cultura fresca na câmara bioreaator a 37 graus Celsius para cobrir a superfície externa da traqueia. Em seguida, administre 10 microliters bolus da mistura célula-hidrogel na traqueia desetelializada dentro do bioreator para gerar uma camada de hidrogel celular no lúmen traqueia. Após a injeção celular, coloque o bioreator em uma incubadora de cultura celular estéril a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para gelação por 30 minutos para permitir a gelagem.
Para visualizar a distribuição de células implantadas, esterilize a lente verde com álcool ou etanol isopropílico de 70% e coloque o bioreator no estágio de imagem para obter as fotos e vídeos em modos de campo brilhante e fluorescente. Após 30 minutos de semeadura celular, infundir um mililitro de cultura no lúmen traqueia a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Finalmente, cultura a traqueia semeada por células dentro do bioreator em uma incubadora a 37 graus Celsius para o tempo desejado.
Durante a cultura celular, mantenha a mídia dentro do lúmen estático, enquanto a mídia fora da traqueia é continuamente perfundida através de um fluxo unidirecional. Nas imagens de campo brilhante e fluorescentes da traqueia desetelializada, nenhum sinal fluorescente foi observado antes da rotulagem cfse. Com o CFSE, observou-se um sinal fluorescente uniforme em todo o epitélio.
Após a desetelialização, a intensidade fluorescente foi diminuída significativamente, indicando ablação do epitélio. A hematoxilina e a coloração de eosina da traqueia desetelializada ilustraram a remoção do epitélio pseudoestestificado do lúmen da traqueia, e a preservação de células e matriz extracelular, ou micro-estruturas ECM, em camadas de tecido subjacente. Além disso, a coloração pentachrome e tricromática confirmou a manutenção da arquitetura de tecido traqueia e componentes ECM, como colágeno e proteoglycans.
A imunofluorescência das células epiteliais e do colágeno revelei a remoção completa do epitélio e a preservação do colágeno I dentro do tecido sub-epitelial. Os micrografos eletrônicos de varredura indicaram que a traqueia nativa era povoada com células multilastadas e cálices. Na traqueia des epitelializada, a membrana do porão foi exposta, conforme indicado por uma rede de malha de fibras de matriz extracelular e a ausência de células epiteliais.
As imagens de fluorescência da traqueia desetelializada, ao semear com PBS e colágeno, são mostradas aqui. Em comparação com as células semeadas via meio de cultura, as células fluorescentes fornecidas via hidrogel permaneceram aderidas de forma mais uniforme em todo o lúmen. O estudo de viabilidade celular demonstrou que a viabilidade não foi afetada pelo procedimento de entrega de células, e mais de 90% das células permaneceram viáveis.
Criar uma película fina de detergente no processo de desepilação e usar hidrogel como veículo de entrega para células são passos essenciais para o sucesso deste protocolo. Nosso próximo objetivo de pesquisa é implantar as vias aéreas primárias cultivadas em laboratório ou células-tronco no tecido das vias aéreas des epitelializadas para investigar se o tecido funcional das vias aéreas pode ser preparado.
