פרוטוקול זה מאפשר גידול במבחנה והדמיה מיקרוסקופית ישירה של רקמות דרכי הנשימה המבודדות במהלך הליכי מניפולציה שונים של רקמות, כגון דה-אפיתליזציה והתחדשות רקמות דרכי הנשימה. הדמיית in situ שהוצעה במחקר זה מאפשרת ניטור מהיר ולא הרסני של לומן קנה הנשימה במהלך הסרה מבוקרת מונחית הדמיה של האפיתל האנדוגני והעברת התאים האקסוגניים. ניתן להשתמש בפלטפורמה הביו-ריאאקטיבית מונחית ההדמיה ובפרוטוקולי מניפולציה של רקמות רקמות בדרכי הנשימה כדי ליצור רקמת דרכי אוויר מהונדסת ביולוגית לצורך מידול מחלות ובדיקת תרופות.
הבנייה והשימוש בביוריאקטור של רקמות דרכי הנשימה התומך בהדמיה יודגמו על ידי שני דוקטורנטים מקבוצת המחקר שלנו, מוחמד מיר, וג'יאוון צ'ן. כדי להתחיל ליצור מכשיר הדמיה באתרו, הכנס עדשת צינור לתוך צינור עדשה הניתן לערימה ואבטח אותה באמצעות טבעת תמך. לאחר מכן, הרכיבו את מכלול שולחן העדשה על מצלמת CMOS מדעית באמצעות מתאם C-mount.
השתמש בתוכנת Micromanager כדי להפעיל את המצלמה ולרכוש תמונות וסרטונים. בעת הכוונה לאובייקט הממוקם במרחק של 10 מטרים מהמצלמה, התאם את המרחק בין עדשת הצינור לבין חיישן ההדמיה של המצלמה עד שתיווצר תמונה ממוקדת של האובייקט על מסך המחשב. לאחר מכן, השתמש ברכיבי מערכת כלובים אופטיים, כגון מוט הרכבה, לוחית כלוב מושחלת וקוביית כלוב כדי להרכיב עדשת סינון על מראה דו-צדדית, סופר-רזולוציה, דיכרואית ולייזר למכשיר.
חברו להתקן עדשת 20X אובייקטיבית. לאחר מכן, הרכיבו עדשה ירוקה בקוטר של 500 מיקרומטר בקצה הדיסטלי של צינור העדשה באמצעות מתרגם X-Y. התאם את המרחק בין העדשה הירוקה לעדשות האובייקטיביות כדי ליצור את התמונות המיקרוסקופיות הממוקדות.
כדי לדמיין את לומן קנה הנשימה של החולדה המבודדת בשדה בהיר או פלואורסצנטי, הניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה. לאחר מכן, להחדיר 500 מיקרוליטרים של אסטר קרבוקסיפלואורסצ'ין סוצ'ינימידיל שהוכן זה עתה, או תמיסת CFSE, בקצב זרימה של חמישה מיליליטרים לדקה דרך קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק המחוברת לצינוריות של צינורית קנה הנשימה. ברגע שפתרון ה- CFSE ממלא את קנה הנשימה, עצור את המשאבה.
לאחר 10 דקות, לשטוף את לומן קנה הנשימה על ידי החדרת 10 מיליליטרים של PBS באמצעות משאבת המזרק כדי להסיר את שאריות ריאגנטים CFSE לא מקורבים. לאחר הכביסה, הכנס את קצה ההדמיה הדיסטלי של העדשה הירוקה לקנה הנשימה באמצעות מחבר הלואר המחובר לקצה אחד של קנה הנשימה. לאחר מכן, הזיזו בעדינות את העדשה הירוקה בתוך קנה הנשימה עד שמשטח קנה הנשימה יתמקד.
כדי לצלם את תמונות השדה הבהיר בתוכנת המיקרו-מנג'ר, האירו את לומן קנה הנשימה באור לבן דרך קוביית הכלוב. לאחר מכן, לחץ על הסמל Live כדי להציג את המשטח הלומנלי של קנה הנשימה בזמן אמת. השתמש בכרטיסיות 'הדמיה' וב'חשיפה' כדי לשנות את זמן החשיפה לערך הרצוי.
כדי להתאים את הניגודיות והבהירות של תמונות, השתמש בחלון ההיסטוגרמה ושינוי הגודל של העוצמה כדי להזיז חצים בשחור-לבן בנקודת הקצה של תצוגת ההיסטוגרמה האינטראקטיבית. לחץ על עצור בשידור חי כדי להפעיל את סמל ההצמדה ולאחר מכן לחץ על סמל ההצמדה כדי להקפיא את התמונה. לאחר מכן, השתמש בהגדרה ייצוא ולאחר מכן תמונות ככרטיסיות עקורות כדי לשמור את התמונות בתבנית הרצויה.
כדי להשיג תמונות וסרטונים במצב פלואורסצנטי, האירו את לומן קנה הנשימה באור לייזר ספציפי ל-CFSE דרך קוביית הכלוב ורכשו את התמונות בזמן אמת על ידי הזזת גשושית ההדמיה קדימה ואחורה. לאחר קבלת התמונות והסרטונים, הסר בעדינות את העדשה הירוקה מקנה הנשימה. עבור דה-אפיתליזציה של קנה הנשימה, להחדיר 50 מיקרוליטרים של 2% נתרן דודציל סולפט מוכן טרי דרך צינורית קנה הנשימה כדי ליצור סרט דק של תמיסת דטרגנט על לומן קנה הנשימה.
לאחר ההחדרה, סגרו את חיבורי הצינורות של הביוריאקטור באמצעות תקעי לואר זכריים או נקביים והעברו את הביוריאקטור לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר ל-SDS לשכון בתוך קנה הנשימה. חזור על ההחדרה פעם אחת. לאחר ההחדרה השנייה, הסר את האפיתל וה- SDS על ידי השקיית לומן קנה הנשימה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של PBS באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה.
לאחר מכן, הניחו את הביוריאקטור על שייקר כדי לרטוט מכני בתדר של 20 הרץ ומשרעת תזוזה של 0.3 מילימטרים כדי לקדם פיזית ניתוק של תאי אפיתל שטופלו ב-SDS מלומן קנה הנשימה. בזמן שקנה הנשימה רוטט מכנית, החדירו 500 מיקרוליטרים של PBS פעמיים דרך לומן קנה הנשימה כדי להסיר את שאריות ה-SDS ואת פסולת התאים. לאחר הסרת האפיתל, העריכו את פינוי שכבת האפיתל על ידי מדידת עוצמת ה-CFSE באמצעות מכשיר הדמיית העדשה הירוקה.
לאחר הכנת קנה הנשימה של חולדה שעברה דה-אפיתל, הפשרת תאי גזע מזנכימליים קפואים, או MSCs, למשך 30 שניות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ספרו את התאים עם המוציטומטר, ולאחר מכן הכנת תמיסת תאים בריכוז של חמישה פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר. לאחר מכן, סמן את התאים באופן פלואורסצנטי על ידי דגירה שלהם עם שני מיליליטרים של תמיסת CFSE 100 מיקרומולרית בטמפרטורת החדר.
לאחר 15 דקות, יש לשטוף את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS שלוש פעמים לפני שתחזירו אותם לתרבית DMEM טרייה בריכוז סופי של שלוש פעמים 10 עד שבעת התאים למיליליטר. מיד לאחר הכנת קולגן I הידרוג'ל, כפי שמתואר בכתב היד, מוסיפים את התאים לתמיסת ההידרוג'ל בריכוז הרצוי. לאחר מכן, ערבבו את התאים ואת תמיסת הג'ל עם מיקרופיפט כדי לקבל תערובת תאים-הידרוג'ל אחידה.
לאחר מכן, חבר קצה אחד של קנה הנשימה בתוך הביוריאקטור למשאבת מזרק ניתנת לתכנות באמצעות מחבר luer והספק חמישה מיליליטרים של מדיום תרבית טרי לתוך תא הביוריאקטור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לכסות את פני השטח החיצוניים של קנה הנשימה. לאחר מכן, תן 10 מיקרוליטרים בולוס של תערובת התא-הידרוג'ל לתוך קנה הנשימה דה-אפיתליאלי בתוך הביוריאקטור כדי ליצור שכבת תא-הידרוג'ל על לומן קנה הנשימה. לאחר הזרקת התאים, מניחים את הביוריאקטור בחממת תרביות תאים סטרילית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני לגלציה למשך 30 דקות כדי לאפשר גלציה.
כדי לדמיין את התפלגות התאים המושתלים, עקרו את העדשה הירוקה עם 70% אלכוהול איזופרופיל או אתנול והניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה כדי לקבל את התמונות והסרטונים הן במצב שדה בהיר והן במצב פלואורסצנטי. לאחר 30 דקות של זריעת תאים, מחדירים מיליליטר אחד של מדיום תרבית לתוך לומן קנה הנשימה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לבסוף, תרבית את קנה הנשימה הזורע בתאים בתוך הביוריאקטור באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי.
במהלך תרבית התאים, שמור את המדיה בתוך הלומן סטטי, בעוד המדיה מחוץ לקנה הנשימה מתכלה באופן רציף באמצעות זרימה חד כיוונית. בתמונות השדה הבהיר והפלורסנטי של קנה הנשימה נטול האפיתל, לא נצפה אות פלואורסצנטי לפני תיוג ה-CFSE. עם ה-CFSE נצפה אות פלואורסצנטי אחיד לאורך כל האפיתל.
לאחר דה-אפיתליאליזציה, עוצמת הפלואורסצנטיות ירדה באופן משמעותי, מה שמעיד על אבלציה של האפיתל. צביעת ההמטוקסילין והאאוזין של קנה הנשימה דה-אפיתל המחישה את הסרת האפיתל המדומה-מרובד מלומן קנה הנשימה, ואת שימור התאים והמטריצה החוץ-תאית, או מיקרו-מבנים של ECM, בשכבות הרקמה הבסיסיות. יתר על כן, צביעת הפנטכרום והטריכרום אישרה את תחזוקת ארכיטקטורת רקמות קנה הנשימה ורכיבי ECM, כגון קולגן ופרוטאוגליקן.
אימונופלואורסצנציה של תאי אפיתל וקולגן חשפתי הסרה מלאה של האפיתל ושימור של קולגן I בתוך רקמת תת-האפיתל. מיקרוגרפי האלקטרונים הסורקים הצביעו על כך שקנה הנשימה הטבעי היה מאוכלס בתאים רב-ציליליים וגביעיים. בקנה הנשימה הדה-אפיתליאלי נחשף קרום המרתף, כפי שמעידה רשת רשת של סיבי מטריצה חוץ-תאיים והיעדר תאי אפיתל.
התמונות הפלואורסצנטיות של קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל, עם זריעה עם PBS וקולגן, מוצגות כאן. בהשוואה לתאים שנזרעו באמצעות מדיום תרבית, התאים המסומנים בפלואורסצנטיות המועברים באמצעות הידרוג'ל נשארו דבוקים באופן אחיד יותר על פני הלומן. מחקר הכדאיות של התאים הראה כי הכדאיות לא הושפעה מהליך העברת התאים, ויותר מ-90% מהתאים נותרו בני קיימא.
יצירת סרט דק של חומר ניקוי בתהליך הדה-אפיתליזציה ושימוש בהידרוג'ל ככלי אספקה לתאים הם שלבים חיוניים להצלחת פרוטוקול זה. מטרת המחקר הבאה שלנו היא להשתיל תאי אוויר ראשוניים או תאי גזע שגודלו במעבדה על רקמת דרכי הנשימה שעברה דה-אפיתל כדי לחקור אם ניתן להכין רקמת דרכי אוויר תפקודית.
