Este protocolo é útil porque fornece passos fáceis de seguir que permitem a geração de células epiteliais das vias aéreas funcionais, que podem então ser usadas para estudar vários aspectos da biologia das vias aéreas. A principal vantagem deste protocolo é a capacidade de gerar muitas culturas funcionais de células epiteliais das vias aéreas, evitando simultaneamente as dificuldades de obtenção e cultivo de células primárias das vias aéreas. Demonstrando o procedimento será Taylor Matte, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório.
Comece descongelando um volume suficiente de matriz 3D no gelo. Mantenha-o no gelo até estar pronto para uso. Descongele um frasco de suspensões de células únicas previamente criopreservadas de iBCs incubando-o em uma água Celsius de 37 graus ou banho de contas até que não haja mídia congelada visível.
Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione seis a 10 mililitros de DMEM/F12 dropwise à suspensão da célula. Misture suavemente e centrifugar a 300 RCF por cinco minutos para pelotar as células.
Aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular em um mililitro de Basal Cell Medium com uma micropipette P1000. Prepare uma alíquota de 10 microliter e realize uma contagem de células. Centrifugar as células a 300 RCF por cinco minutos.
Aspire o supernascer e resuspenja as células a uma densidade de 4.000 células por microliter na matriz 3D anteriormente descongelada com uma micropipette P1000. Com uma micropipette P200, adicione uma gotícula da solução matricial correspondente a aproximadamente 25 a 50 microliters à base de cada poço de uma placa tratada com cultura de tecido de 12 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos.
Em seguida, adicione o meio de célula basal suficiente para cada poço para submergir totalmente a gota usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Devolva a placa a uma incubadora umidificada. Células de alimentação a cada dois dias usando o meio celular basal fresco.
Adicione meio fresco ao lado do poço com uma pipeta sorológica de cinco mililitros, tomando cuidado para não perturbar a gota das células. Descongele um volume suficiente da matriz 3D no gelo. Mantenha-o no gelo até estar pronto para uso.
Depois de aproximadamente cinco a sete dias de placas de cultura incubadas, aspire o meio de cada poço, em seguida, usando uma micropipette P1000, adicione um mililitro de dispase II diretamente sobre os esferoides para dissociar da gotícula da matriz. Coloque a placa em 37 graus Celsius incubadora por 10 a 15 minutos. Usando uma micropipette P1000, misture a despase ao esporar duas vezes, quebrando grandes aglomerados da matriz 3D.
Volte a placa para 37 graus Celsius por mais 30 a 40 minutos, permitindo que a matriz se dissolva completamente. Quando a gotícula da matriz 3D não estiver mais visível sob o microscópio de luz, adicione os esferoides livremente flutuantes a um tubo cônico de 15 mililitros usando uma ponta de pipeta sorológica de cinco mililitros. Adicione DMEM/F12 para um volume final de 10 mililitros por tubo cônico e centrífuga a 200 RCF por três minutos para de pelotar os esferoides.
Aspire o supernatante e adicione um mililitro de 0,05% de trippsina para cada gotícula inicial dissociada. Incubar a 37 graus Celsius, triturando-o a cada dois ou três minutos. Avalie a solução com o microscópio de luz a cada poucos minutos.
Quando mais de 90% dos esferoides foram dissociados a células únicas, adicione 10% de soro bovino fetal à trippsina. Filtre as células através de um coador de células de 40 micrômetros e centrífuga a 300 RCF por cinco minutos. Realize uma contagem de células e resuspenja uniformemente as células a uma densidade de 400 células por microliter de matriz 3D descongelada.
Evite introduzir bolhas de ar. Resuspenda quantas gotículas necessários para a aplicação a jusante. Repita este processo para cada poço.
Após 10 a 14 dias da passagem mais recente, dissociar os esferoides a uma única suspensão celular como demonstrado anteriormente e realizar uma contagem celular. Resuspenda as células em buffer de classificação. Esta será a população principal.
Transfira uma pequena alíquota de 25 a 50 microliters para um tubo separado. Esta será a população menor. Adicione anticorpo anti-NGFR conjugado à população celular principal.
Adicione anticorpo de controle de isótipo à população celular menor. Proteja as células da luz e mantenha-as no gelo por 30 minutos intermitentemente, triturar as células para evitar a pelota. Após 30 minutos, adicione o tampão de classificação a cada tubo de células.
Células centrífugas a 300 RCF por cinco minutos. Aspire o supernasciente, resuspenda as células pelotas no buffer de classificação e adicione mancha de célula viva ou morta. Usando uma estratégia de gating positiva ngfr apropriada, classifique células positivas ngfr suficientes para aplicações necessárias a jusante.
Prepare as pastilhas de membrana porosa de 6,5 milímetros adicionando uma matriz de 200 microliteres à câmara apical de acordo com a instrução do fabricante. Coloque-o a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas antes do necessário. Aspire a matriz de revestimento da câmara apical da inserção.
Adicione 500 microliters do meio de célula basal à câmara basolateral. Resuspend pelo menos 30.000 células NGFR classificadas em 100 a 200 microliters Basal Cell Medium e transferência para a câmara apical usando uma micropipette P200. Repita para os poços restantes.
Coloque a placa em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius. Em dois a três dias, aspire câmaras apical e basolateral e alimente-se com o meio celular basal fresco. Monitore a câmara apical diariamente com microscopia leve.
Quando as células atingirem mais de 80% de confluência, substitua o meio de célula basal por meio de diferenciação ALI em câmaras apical e basolateral. Proteja o meio de diferenciação ALI da luz, mantendo os recipientes de mídia envoltos em papel alumínio e desligando as luzes aéreas quando possível. No dia seguinte, aspire o meio da câmara apical, expondo assim a superfície apical ao ar.
Substitua a mídia de diferenciação ALI na câmara basolateral a cada dois ou três dias. Monitore a aparência cultural a cada um ou dois dias. Aspire cuidadosamente qualquer líquido acumulado da câmara apical sem perturbar a camada celular.
Adicione suavemente 100 microliters de PBS sem cálcio ou magnésio à câmara apical para remover detritos ou muco. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, aspirar cuidadosamente PBS. Avalie o TEER para integridade epitelial.
Após sete a dez dias de exposição ao ar, observe para o aparecimento de multicilia utilizando microscopia leve. Dependendo do experimento planejado e da leitura, as células podem ser analisadas após 14 a 28 dias de exposição ao ar. Após 10 a 14 dias da mais recente passagem de cultura 3D, dissociar os esferoides à suspensão de célula única, como demonstrado anteriormente.
Realize uma contagem de células, resuspense a suspensão celular em meio criopreservação em um criovial. Coloque os criovias em um recipiente para garantir uma queda constante da temperatura. E transferir para menos 80 graus Celsius por 24 a 48 horas seguido de transferência para menos 150 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.
Com essa técnica de gating, 28% das células individuais vivas foram positivas em GNR. Após dois dias, as células individuais eram inicialmente facilmente identificáveis e tinham uma aparência alongada em forma de fuso. Depois de mais dois dias, as células formaram uma monocamada confluente e vagamente embalada.
Nos dias seguintes, as células formaram uma camada epitelial altamente embalada e altamente celular. E depois de sete a dez dias, houve um claro surgimento de uma produção de cílios e mucos. O TEER das amostras foi medido e os resultados foram semelhantes às medições de amostras de controle de células epiteliais das vias aéreas primárias.
Posterior fixação com aldeído paraforme e imunolabeling para marcadores epiteliais das vias aéreas canônicas foi realizada para MUC5AC e alfa-tubulina acetilada, entre outros. Seguindo este protocolo, os pesquisadores podem gerar um grande número de culturas epiteliais das vias aéreas derivadas do paciente para avaliar várias leituras, incluindo aquelas que testam as funções das células basais, secretas e multiciliadas em doenças e saúde.
