Simples fabricação de coluna capilar de desempenho ultra-alto com a abordagem FlashPack. O objetivo deste procedimento é introduzir um protocolo otimizado para embalagem de coluna capilar de alto desempenho rápido e fácil para análise de proteômica LC-MS. A proteômica moderna é baseada na espectrometria de massa, juntamente com cromatografia líquida capilar de alto desempenho.
A separação do peptídeo é feita principalmente em colunas capilares com diâmetro interno de 75 micrômetros. Em comparação com os produtos comerciais, é possível preparar colunas capilares internamente. Colunas personalizadas demonstram qualidades de separação semelhantes às analogias comerciais, economizando muito dinheiro e permitindo a personalização do tamanho da coluna.
Aqui demonstramos um procedimento de embalagem otimizado para a fabricação de colunas capilares internas, que chamamos de FlashPack. A ideia por trás da otimização é embalar a partir de uma concentração de chorume muito alta, enquanto ainda usa a mesma configuração comum de embalagem de bomba de pressão de 100 barras. Isso requer a quebra contínua de aglomerados sorbent, que se formam ao redor da entrada da coluna em alta concentração sorbent e impedem que um novo material sorbent entre no capilar.
Tecnicamente, conseguimos isso usando uma barra de ímã como um martelo, aquecendo constantemente e movendo-se ao redor do capilar dentro do fio sorbent. O FlashPack aplicado corretamente aumenta a taxa de embalagem em até 10 vezes. Isso o torna adequado para embalar sorbents de desempenho ultra alto de tamanho micro metricbeat mais suave e para fabricação de colunas muito longas até um metro de comprimento em tempos razoáveis.
O procedimento de preparação da coluna consiste em cinco etapas. Três etapas preparatórias, que incluem montagem da estação de embalagem e preparação capilar e de chorume sorbent. Em seguida, o capilar é embalado pela primeira vez na bomba de pressão a 60 a 100 bar pressão.
É seguido pela conexão do capilar embalado com o sistema HPLC, embalando o sorbent em alta pressão e corte de coluna ao tamanho. O procedimento FlashPack requer alterações nas etapas três e quatro do protocolo comum. Primeiro, preparamos uma estação de embalagem.
Consiste em um tanque de gás nitrogênio com pelo menos 50 barras de pressão de saída. O tanque está conectado à válvula de ventilação da bomba de pressão, que é colocada no agitador magnético. A saída da válvula de ventilação é inserida em uma garrafa de água através de capilaridade ID PEEK estreita, que permite um controle fino sobre a despressurização.
Em seguida, preparamos um capilar. A embalagem pode ser feita em um capilar frito com um frit de vidro integrado formado a partir de Kasil e formamida. Outra opção é embalar em um capilar puxado preparado por sutter laser puller.
O capilar deve ser feito de 10 a 15 centímetros a mais do que o comprimento da coluna pretendida. O vídeo a seguir é preparado no exemplo de uma embalagem capilar emitter puxada. Proteja uma extremidade do emissor puxado com uma ponta de pipeta de carregamento de gel cortada.
Para obter detalhes, consulte a versão do texto do manuscrito. A próxima etapa é a preparação do chorume sorbent. Primeiro, coloque cerca de 50 miligramas de sorbent seco em tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Isso será um frasco de estoque sorbent. Este vídeo foi preparado com o uso de Reprosil Pur C18 AQ 1.9 micro sorbent de Dr. Maisch. Adicione um mililitro de metanol no frasco de sorbent de estoque.
Vórtice por 10 segundos. E sonicate em um banho de sônica por mais 10 segundos. Deixe o sorbent absorver completamente por 20 a 30 minutos, em seguida, vórtice e sonicate-lo mais uma vez.
Prepare um frasco de trabalho sorbent. Deve ser um frasco de fundo cônico que se encaixa na bomba. Pode ser outro tubo de centrífugas de 1,5 mililitro ou qualquer outro frasco, dependendo do design da bomba de pressão em particular.
Usamos um tubo de tampa de fundo cônico contornado cortado na altura da bomba de pressão. Suspenda o sorbent no frasco de sorbent de estoque e transfira 500 microliters para o frasco de sorbent funcionando junto com uma barra de ímã de dois por três milímetros de tamanho. Topo para o frasco de trabalho para um mililitro com metanol.
Deixe o frasco de trabalho ficar sobre a mesa por 10 minutos para o sorbent se estabelecer pela gravidade. O resultado desta etapa deve ser um frasco de fundo cônico com a camada inferior de sorbent solto em torno de quatro milímetros de altura. Se a camada estiver muito baixa, e um pouco mais sorbent do frasco de estoque.
Assim, o frasco de trabalho preparado destina-se à preparação de várias colunas ao longo de meses. Se o frasco sorbent de trabalho permanecer sem mexer por mais de duas horas, ele deve ser vórtice, sonicado e resolvido pela gravidade novamente antes de embalar. Quando tudo estiver preparado, vá para a fase quatro, embalando a bomba de pressão.
Use sempre óculos de proteção ao trabalhar com capilares de sílica fundido e a bomba de pressão. Ao mesmo tempo, luvas de proteção não são recomendadas. Eles reduzem severamente a sensação de toque necessária para o manuseio adequado de capilares de pequeno diâmetro e levam a erros.
Coloque o frasco sorbent na bomba de pressão e conserte todos os nós firmemente. Inicie a rotação em 60 a 100 rounds por minuto, insira o capilar de emissor frito ou puxado na bomba. Empurre-o para o fundo do frasco, em seguida, levante-o de dois a três milímetros e fixe o nó.
Aplique força mínima necessária para fixar o capilar. Verifique se o capilar está devidamente consertado. Deve ser impossível mover o capilar puxando-o à mão.
Muito lentamente, abra a válvula da bomba de pressão mantendo a extremidade aberta do capilar apontada para longe do seu rosto. Observe as etapas iniciais do processo de embalagem. Imediatamente após a pressurização, o sorbent preenche o capilar e torna-se não transparente durante todo o comprimento.
Assim que o sorbent começa a embalar dentro da extremidade distal, a pressão traseira aumenta, o fluxo diminui e o chorume ainda mais sorbent dentro das reformas capilares em vários pacotes sorbent, separados por lacunas livres sorbentes. O sorbent já embalado é visível como uma região de crescimento contínuo densamente colorida. Mantenha as regiões preenchidas sorbent pelo menos 70% do comprimento capilar com pequenas lacunas livres de sorbent durante toda a duração do processo de embalagem.
Existem vários problemas comuns para assistir durante o processo de embalagem. Eles exigem ajuste de configuração no voo para manter a entrega eficiente sorbent no capilar. A questão mais frequente é quando o novo sorbent pára de entrar no capilar, enquanto o sorbent já dentro continua se movendo.
Na maioria dos casos, a entrada capilar é bloqueada por aglomerados sorbent auto-agregantes. Aplique essas etapas uma a uma até que o fluxo de sorbent seja restaurado e, em seguida, pule o resto das etapas relacionadas ao problema. Aumente a velocidade de rotação para 500 rodadas por minuto e reduza-a imediatamente para 60 RPM.
Na maioria das vezes restaura o fluxo sorbent. Verifique a velocidade de rotação como pelo menos 60 RPM para o resto do processo de embalagem. Se não ajudar, desabafe a bomba de embalagem e pressurize-a imediatamente de volta.
Se não ajudar, ou o bloqueio acontecer novamente, reposicione o capilar dentro da camada sorbent. A ausência do sorbent pode ser devido ao capilar aberto ser muito alto acima da barra de ímã, de modo que o final da coluna não tocá-lo. Ou o capilar é posicionado muito baixo e gruda no fundo do frasco.
Primeiro, desabafe a bomba completamente, depois solte a porca, empurre o capilar para o fundo, e depois puxe-a dois milímetros para trás. Conserte a porca. Abra a válvula para pressurizar a bomba e continue embalando.
Mais detalhes sobre os problemas de embalagem estão descritos na versão de texto do método. Continue embalando a coluna até que o comprimento da coluna-alvo mais cinco a sete centímetros seja alcançado. Pare a rotação e despressurize lentamente a bomba.
Abra um pouco a válvula da bomba e espere que a bolha estoure dentro da garrafa de água para diminuir. Em seguida, abra a válvula um pouco mais larga e novamente espere a bolha estourar para diminuir a velocidade. Assim, em etapas incrementais, solte a pressão até que nenhum gás saia da válvula.
Não abra a válvula de uma vez. Isso levará a borbulhar dentro do capilar e o sorbent voltando para o frasco. Se isso acontecer, pressurize a bomba de volta e espere a coluna ser embalada novamente.
Quando o gás parar de sair da válvula de ventilação, tire o capilar embalado da bomba de pressão. Não deixe a coluna secar. Se não estiver conectado ao sistema HPLC imediatamente para mais embalagem, coloque o capilar embalado no armazenamento, submergindo-o inteiro em uma solução de 10% de etanol.
As colunas HPLC desconectadas são armazenadas da mesma forma. Se não for mais planejado para hoje, tire o frasco sorbent da bomba e feche-o firmemente. Guarde para mais a embalagem da coluna.
Estágio cinco, HPLC empacotando. Conecte o capilar embalado ao sistema HPLC via conexão HPLC. Inicie o fluxo de solvente orgânico elevado.
Ajuste o fluxo de acordo com o comprimento embalado visando cerca de 300 barras. Para 40 centímetros embalados capilarmente use a taxa de fluxo de 200-300 litros normais por minuto. Observe o sorbent solto dentro do capilar que está sendo embalado, adicionando ao comprimento total embalado.
Sem parar o fluxo, mergulhe o corpo da coluna duas vezes no banho de sônica. É importante imergir apenas parte do corpo da coluna. Não mergulhe as extremidades da coluna e as conexões capilares.
Quando a cama sorbent parar de encolher, mergulhe o corpo da coluna no banho de sônica duas vezes mais sem parar o fluxo. Execute a coluna por mais 10 minutos em 300 barras. Pare o fluxo, espere a pressão cair para abaixo de três barras e desconecte a coluna.
Inspecione visualmente a coluna pela falta de lacunas e descolorações. Se algum for encontrado, a sônica sob o fluxo pode ser repetida. Para experimentos críticos, considere fazer uma nova coluna.
Corte a coluna ao comprimento desejado. O corte feito corretamente é um pré-requisito para a eficiência da coluna. Faça um entalhe no revestimento de poliamida com o escriba.
Quebre parcialmente o capilar e puxe duas peças separadas. Polir a coluna frontal em um wafer de cerâmica ou com filme lapping. Reconecte a coluna ao sistema LC usando conexão de ultra alta pressão.
Inicie a taxa de fluxo de trabalho em 2%B. A taxa de fluxo de trabalho é ajustada de acordo com os parâmetros da coluna. Por exemplo, as colunas de ID de 100 micrômetros são executadas a 500 nanoliters por minuto.
Aguarde a pressão para equilibrar e verifique a coluna de pressão traseira. Uma coluna devidamente preparada dá pressão de volta proporcional ao seu comprimento e características sorbent. Por exemplo, a coluna capilar de 30 centímetros embalada com dois micrômetros tem pressão traseira de 450 a 500 barras a 2%de solvente B.Se a coluna produzida der uma pressão de volta dentro da faixa esperada, ela está pronta para usar.
Se a pressão traseira estiver bem fora do alcance esperado, algo está errado com a coluna ou com o sistema LC. A embalagem com FlashPack produz um capilar embalado por 50 centímetros com 1,9 micrômetros sorbent em menos de uma hora a 100 bar de pressão de embalagem. Como exemplo, produzimos uma coluna de ultra alta pressão de 30 centímetros de 100 micrômetros embalada em um capilar de emissor puxado com 1,9 micrômetros ReprosilPur C18 AQ sorbent.
A embalagem foi feita em 60 barras em 50 centímetros de comprimento puxado emitter capilar. O capilar foi embalado a 40 centímetros em 40 minutos com um pouco mais de sorbent dentro do capilar não embalado. O capilar embalado foi conectado ao sistema HPLC e executado a 300 nanoliters por minuto com solvente B, que no nosso caso foi 80% de acetonitrilo, 0,1% de ácido fórmico.
O comprimento final embalado foi de 43 centímetros. A coluna foi cortada 30 centímetros. A 500 nanolitres por minuto de fluxo de trabalho com 99% de solvente B a coluna deu a pressão traseira de 275 barras, que está perto do valor esperado.
Para testar a coluna, separamos 50 fmol de um digestor trippático de proteína citocromática C em um gradiente de 15 minutos de 2-50%B. Picos cromatográficos eram altamente simétricos com o mínimo de rejeito. A média da FWHM foi de cerca de três segundos.
O protocolo descrito é capaz de produzir colunas UHPLC em uma embalagem comum de 100 barras configurada em tempo razoável. As colunas HPLC ou UPLC curtas podem ser embaladas em minutos, enquanto as colunas longas de 30-50 centímetros são embaladas em menos de uma hora. O método é eficiente para embalar sorbents com RP e qualquer outra química em qualquer ID de coluna.
As colunas produzidas são reprodutivelmente tão eficazes quanto qualquer outra coluna comercial de tamanho semelhante e parâmetros sorbent.
