Простое производство капиллярных колонн со сверхвысокой производительностью с помощью flashPack. Целью данной процедуры является внедрение оптимизированного протокола для быстрой и простой сверхвысокопроизводительной упаковки капиллярных колонн для протеомического анализа LC-MS. Современная протеомика основана на масс-спектрометрии в сочетании со сверхвысокой производительностью капиллярной жидкостной хроматографии.
Разделение пептидов в основном производится в капиллярных колоннах с внутренним диаметром 75 микрометров. Наравне с коммерческими продуктами, можно готовить капиллярные колонны на месте. Специально подготовленные колонки демонстрируют качества разделения, аналогичные коммерческим аналогиям, экономя при этом много денег и позволяя настраивать сорбент и размер столбца.
Здесь мы демонстрируем оптимизированную процедуру упаковки для производства капиллярных колонн на месте, которую мы называем FlashPack. Идея оптимизации заключается в том, чтобы упаковать из очень высокой концентрации сорбента, все еще используя ту же обычную установку упаковки бомбы под давлением 100 бар. Это требует непрерывного разрушения кластеров сорбентов, которые образуются вокруг входа в колонну при высокой концентрации сорбента и предотвращают попадание нового сорбентного материала в капилляр.
Технически мы достигаем этого, используя магнитный стержень в качестве молотка, постоянно нагревая и перемещаясь по капилляру внутри сорбентной проволоки. Правильно применяемый FlashPack увеличивает скорость упаковки до 10 раз. Это делает его пригодным для упаковки сверхвысокопроизводительных сорбентов более мягкого размера микрометрического ритма и для изготовления очень длинных колонн длиной до метра в разумные сроки.
Процедура подготовки колонны состоит из пяти этапов. Три подготовительных этапа, которые включают в себя сборку упаковочной станции и подготовку капиллярной и сорбентной суспензии. Затем капилляр сначала упаковывается в бомбу давления при давлении от 60 до 100 бар.
Затем следует подключение упакованного капилляра к системе ВЭЖХ, упаковка сорбента под высоким давлением и резка колонны до размера. Процедура FlashPack требует внесения изменений на третьем и четвертом шагах общего протокола. Прежде всего, мы готовим упаковочную станцию.
Он состоит из азотного газового бака с давлением на выходе не менее 50 бар. Бак соединен с вентиляционным клапаном бомбы под давлением, который помещается в магнитную мешалку. Выходное отверстие вентиляционного клапана вставляется в бутылку с водой через узкий капилляр ID PEEK, что позволяет осуществлять тонкий контроль над разгерметизацией.
Далее готовим капилляр. Упаковка может быть выполнена либо в фритированный капилляр со встроенным стеклянным фритом, сформированным из касила и формамида. Другим вариантом является упаковка в вытянутый капилляр, подготовленный лазерным съемщиком.
Капилляр должен быть сделан на 10-15 сантиметров длиннее предполагаемой длины колонны. Следующее видео подготовлено на примере вытягиваемого излучателя капиллярной упаковки. Защитите вытянутый конец излучателя с помощью вырезанного наконечника пипетки с гелевой загрузкой.
Подробности смотрите в текстовой версии рукописи. Следующим этапом является приготовление сорбентной суспензии. Сначала поместите около 50 миллиграммов сухого сорбента в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.
Это будет запас сорбентного флакона. Данное видео было подготовлено с использованием микрометрического сорбента Reprosil Pur C18 AQ 1.9 от Dr.Maisch. Добавьте один миллилитр метанола в запасной флакон сорбента.
Вихрь в течение 10 секунд. И прожничать в ванне с ультразвуком еще 10 секунд. Дайте сорбенту тщательно впитаться в течение 20-30 минут, затем вихрь и снова обжаряйте его ультразвуком.
Приготовьте рабочий флакон с сорбентом. Это должен быть конический нижний флакон, который помещается в бомбу. Это может быть либо еще одна 1,5-миллилитровая центрифужная трубка, либо любой другой флакон в зависимости от конкретной конструкции бомбы давления.
Мы используем коническую нижнюю винтовую колпачку с юбкой, вырезанную на высоте бомбы давления. Повторно суспендирует сорбент в запасе сорбентного флакона и переложите 500 микролитров в рабочий флакон сорбента вместе с магнитным стерженом размером два на три миллиметра. Сверху на рабочий флакон на один миллилитр с метанолом.
Дайте рабочему флакону постоять на столе в течение 10 минут, чтобы сорбент оседал под действием силы тяжести. Результатом этого шага должен быть конический нижний флакон с нижним слоем рыхлого сорбента высотой около четырех миллиметров. Если слой слишком низкий, и еще немного сорбента из запаса флакона.
Приготовленный таким образом рабочий флакон предназначен для приготовления нескольких колонок в течение нескольких месяцев. Если рабочий флакон сорбента остается без перемешивания более двух часов, его необходимо снова вихрь, обработать ультразвуком и снова оседнуть под действием силы тяжести перед упаковкой. Когда все будет готово, переходите к четвертому этапу, упаковывая бомбу под давлением.
Всегда надевайте защитные очки при работе с плавлеными кварцевыми капиллярами и бомбой давления. При этом защитные перчатки не рекомендуются. Они сильно снижают чувство осязания, необходимое для правильной обработки капилляров малого диаметра и приводят к ошибкам.
Поместите флакон сорбента в бомбу под давлением и плотно зафиксируйте все узлы. Начинайте вращение со скоростью от 60 до 100 выстрелов в минуту, вставьте в бомбу фритированный или вытянутый излучатель капилляр. Прижмите его к самому низу флакона, затем поднимите его на два-три миллиметра и зафиксируйте узел.
Приложите минимально необходимое усилие для фиксации капилляра. Убедитесь, что капилляр правильно закреплен. Должно быть невозможно переместить капилляр, вытащив его вручную.
Очень медленно откройте клапан бомбы давления, удерживая открытый конец капилляра направленным в сторону от вашего лица. Следите за начальными этапами процесса упаковки. Сразу после надавливания сорбент заполняет капилляр и он становится непрозрачным на всю длину.
Как только сорбент начинает упаковываться внутри дистального конца, противодавленное давление увеличивается, поток замедляется, и ровная сорбентная суспензия внутри капилляра превращается в несколько пакетов сорбента, разделенных свободными от сорбента промежутками. Уже упакованный сорбент виден как густо окрашенный непрерывно растущий регион. Держите заполненные сорбентом области не менее 70% длины капилляров с небольшими свободными от сорбента промежутками в течение всего процесса упаковки.
Есть несколько распространенных проблем, на которые следует обратить внимание в процессе упаковки. Они требуют регулировки настройки в полете, чтобы обеспечить эффективную доставку сорбента в капилляр. Наиболее частая проблема возникает, когда новый сорбент перестает поступать в капилляр, в то время как сорбент, уже находящийся внутри, продолжает двигаться.
В большинстве случаев капиллярный вход блокируется самоагрегирующими кластерами сорбентов. Применяйте эти шаги по одному, пока поток сорбента не будет восстановлен, а затем пропустите остальные шаги, связанные с проблемой. Увеличьте скорость вращения до 500 выстрелов в минуту и немедленно уменьшите ее до 60 оборотов в минуту.
Большую часть времени он восстанавливает течение сорбента. Убедитесь, что скорость вращения не менее 60 об/мин для остальной части процесса упаковки. Если это не помогает, ненадолго выхватил упаковочную бомбу и немедленно надавите на нее обратно.
Если это не помогает, или блокировка происходит снова, перепозиционирует капилляр внутри слоя сорбента. Отсутствие сорбента может быть связано с тем, что капиллярный открытый конец находится либо слишком высоко над магнитной полосой, поэтому конец колонны не касается его. Или капилляр расположен слишком низко и втыкается в дно флакона.
Сначала полностью выпустили бомбу, затем ослабьте гайку, отодвиньте капилляр на дно, а затем потяните его на два миллиметра назад. Зафиксируйте гайку. Откройте клапан, чтобы создать давление на бомбу и продолжить упаковку.
Более подробно по вопросам упаковки описана в текстовой версии метода. Продолжайте упаковывать колонну до тех пор, пока не будет достигнута целевая длина колонны плюс пять-семь сантиметров. Остановите вращение и очень медленно разгерметизируйте бомбу.
Немного откройте клапан бомбы и подождите, пока пузырь лопнет внутри бутылки с водой, чтобы утихнуть. Затем откройте клапан немного шире и снова подождите, пока пузырь лопнет, чтобы замедлиться. Таким образом, на шаговых этапах спустите давление до тех пор, пока из клапана не выйдет газ.
Не открывайте клапан сразу. Это приведет к пузырьку внутри капилляра и возвращению сорбента во флакон. Если это произойдет, надавите на бомбу и подождите, пока колонна снова будет заполнена.
Когда газ перестанет выходить из вентиляционного клапана, выньте упакованный капилляр из бомбы давления. Не дайте колонке высохнуть. Если система ВЭЖХ не подключена немедленно для дальнейшей упаковки, поместите упакованный капилляр в хранилище, погрузкив его целиком в 10%-ный раствор этанола.
Отключенные столбцы ВЭЖХ хранятся таким же образом. Если на сегодня больше не планируется упаковка, доньте из бомбы флакон с сорбентом и плотно закройте его. Сохраните его для дальнейшей упаковки колонны.
Этап пятый, упаковка ВЭЖХ. Подключите упакованный капилляр к системе ВЭЖХ через ВЭЖХ-соединение. Запустите поток высокоорганических растворителей.
Отрегулируйте поток в соответствии с упакованной длиной, ориентируясь примерно на 300 бар. Для 40-сантиметрового упакованного капилляра используют расход 200-300 нормальных литров в минуту. Следите за тем, чтобы рыхлый сорбент внутри капилляра упаковывался, добавляя к общей упакованной длине.
Не останавливая потока, дважды окуните корпус колонны в ванну для обработки ультразвуком. Важно погружать только часть корпуса колонны. Не погружайте концы колонн и капиллярные соединения.
Когда сорбентный ложе перестанет сжиматься, опустите корпус колонны в ванну для обработки ультразвуком еще в два раза, не останавливая поток. Запускаем колонку в течение дополнительных 10 минут на 300 барах. Остановите поток, подождите, пока давление упадет ниже трех бар и отсоедините колонну.
Визуально осмотрите колонну на отсутствие зазоров и обесцвечивания. Если таковые обнаружены, обработку ультразвуком под потоком можно повторить. Для критических экспериментов рассмотрите возможность создания нового столбца.
Обрежьте колонну до нужной длины. Правильно выполненная резка является обязательным условием эффективности колонны. Сделайте выемку в полиамидном покрытии с помощью писца.
Частично расколоть капилляр и раздвинуть два куска. Отполировать переднюю часть колонны на керамической пластине или притиркой пленкой. Повторно подключите колонну к системе LC с помощью соединения сверхвысокого давления.
Начните рабочий расход с 2%B. Рабочий расход регулируется в соответствии с параметрами столбца. Например, 100-микрометрические идентификационные колонны выполняются со скоростью 500 нанолитров в минуту.
Подождите, пока давление уравновесятся, и проверьте обратное давление в колонке. Правильно подготовленная колонна дает обратное давление, пропорциональное ее длине и характеристикам сорбента. Например, 30-сантиметровая капиллярная колонна, заполненная двумя микрометрами сорбента, имеет обратное давление от 450 до 500 бар при 2% растворителя В. Если произведенная колонна дает обратное давление в пределах ожидаемого диапазона, она готова к использованию.
Если противодавливая температура выходит за пределы ожидаемого диапазона, что-то не так либо с колонкой, либо с системой LC. Упаковка с FlashPack производит капилляр, упакованный на 50 сантиметров с сорбентом 1,9 микрометра менее чем за один час при давлении упаковки 100 бар. В качестве примера мы производим 30-сантиметровую 100-микрометровую колонку сверхвысокого давления, упакованную в капилляр вытянутого излучателя с сорбентом ReprosilPur C18 AQ 1,9 микрометра.
Упаковка была выполнена на 60 барах в 50-сантиметровый вытянутый излучатель капилляр. Капилляр был упакован до 40 сантиметров за 40 минут с еще одним сорбентом внутри капилляра, не упакованным. Упакованный капилляр был подключен к системе ВЭЖХ и работал со скоростью 300 нанолитров в минуту с растворителем B, который в нашем случае составлял 80% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты.
Окончательная упакованная длина составляла 43 сантиметра. Колонна была разрезана на 30 сантиметров. При 500 нанолитрах в минуту рабочего потока с 99%-ным растворителем В колонка давала обратное давление 275 бар, что близко к ожидаемому значению.
Чтобы проверить колонку, мы отделили 50 фмоль триптического дайджеста белка цитохрома С в 15-минутном градиенте от 2-50% В. Хроматографические пики были очень симметричными с минимальным хвостом. Средний показатель FWHM составлял около трех секунд.
Описанный протокол способен производить колонны UHPLC в общей упаковке 100 бар, установленной в разумные сроки. Короткие колонны ВЭЖХ или UPLC могут быть упакованы за минутное время, в то время как длинные 30-50-сантиметровые колонны упаковываются менее чем за один час. Метод эффективен для упаковки сорбентов с РП и любой другой химией в любые идентификаторы колонн.
Производимые колонки воспроизводимо столь же эффективны, как и любые другие коммерческие колонки аналогичного размера и параметров сорбента.
