FlashPack Yaklaşımı ile Basit Şirket İçi Ultra Yüksek Performanslı Kılcal Sütun Üretimi. Bu prosedürün amacı, LC-MS proteomik analizi için hızlı ve kolay ultra yüksek performanslı kılcal sütun paketleme için optimize edilmiş bir protokol sunmaktır. Modern proteomik, ultra yüksek performanslı kılcal sıvı kromatografisi ile birlikte kütle spektrometresine dayanmaktadır.
Peptit ayırma çoğunlukla iç çapı 75 mikrometre olan kılcal sütunlarda yapılır. Ticari ürünlerle eşit olarak, kılcal sütunları şirket içinde hazırlamak mümkündür. Özel olarak hazırlanmış sütunlar, ticari benzetmelere benzer ayırma niteliklerini gösterirken, çok fazla para tasarrufu sağlar ve sorbent ve sütun boyutu özelleştirmesine izin verir.
Burada FlashPack dediğimiz şirket içi kılcal kolon üretimi için optimize edilmiş bir paketleme prosedürü sergiliyoruz. Optimizasyonun arkasındaki fikir, aynı ortak 100 bar basınçlı bomba paketleme kurulumunu kullanırken, çok yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundan paketlemektir. Bu, sütun girişinin etrafında yüksek sorbent konsantrasyonda oluşan ve yeni sorbent malzemenin kılcal damara girmesini önleyen sorbent kümelerinin sürekli olarak parçalanmasını gerektirir.
Teknik olarak, bunu çekiç olarak bir mıknatıs çubuğu kullanarak, sürekli ısıtarak ve sorbent telin içindeki kılcal damarın etrafında hareket larak başarıyoruz. Düzgün uygulanan FlashPack, paketleme oranını 10 kata kadar artırır. Bu, daha yumuşak mikro metrik boyutlu ultra yüksek performanslı sorbentleri paketlemek ve makul zamanlarda bir metre uzunluğa kadar çok uzun sütunlar üretmek için uygun hale getirir.
Sütun hazırlama prosedürü beş adımdan oluşur. Paketleme istasyonu montajı ve kılcal ve sorbent bulamaç hazırlamayı içeren üç hazırlık adımı. Daha sonra kılcal damar ilk olarak 60 ila 100 bar basınçta basınç bombasına paketlenir.
Bunu, paketlenmiş kılcal damarın HPLC sistemine bağlanması, sorbent'in yüksek basınçta paketlenerek ve kolon kesimi boyutuna kadar takip edilir. FlashPack yordamı, ortak protokolün üçüncü ve dördüncü adımlarında değişiklik yapılmasını gerektirir. Öncelikle bir paketleme istasyonu hazırlıyoruz.
En az 50 bar çıkış basıncına sahip bir azot gaz tankından oluşur. Tank, manyetik karıştırıcıya yerleştirilen basınç bombasının havalandırma vanasına bağlanır. Havalandırma vanasının çıkışı, basınç basınçsızlaştırma üzerinde ince kontrol sağlayan dar ID PEEK kılcal damarı aracılığıyla bir su şişesine yerleştirilir.
Sonra, bir kılcal damar hazırlıyoruz. Ambalaj, Kasil ve formamidden oluşan entegre bir cam frit ile fritlenmiş bir kılcal damara yapılabilir. Başka bir seçenek, sutter lazer puller tarafından hazırlanan çekilmiş bir kılcal damar içine paketlemektir.
Kılcal damar, hedeflenen kolon uzunluğundan 10 ila 15 santimetre daha uzun yapılmalıdır. Aşağıdaki video, çekilmiş bir yayıcı kılcal damar ambalajı örneği üzerine hazırlanmıştır. Çekilmiş bir yayıcı ucunu kesilmiş jel yükleme pipet ucuyla koruyun.
Ayrıntılar için makalenin metin sürümüne bakın. Bir sonraki aşama sorbent bulamaç hazırlığıdır. İlk olarak, 1,5 mililitre santrifüj tüpüne yaklaşık 50 miligram kuru sorbent koyun.
Bu bir hisse senedi sorbent şişesi olacak. Bu video, Dr.Maisch'in Reprosil Pur C18 AQ 1.9 mikro metrik sorbent kullanımıyla hazırlandı. Stok sorbent şişesine bir mililitre metanol ekleyin.
10 saniye boyunca girdap. Ve sonikasyon banyosunda 10 saniye daha sonicate. Sorbent'i 20 ila 30 dakika boyunca iyice ıslatın, sonra girdaplayın ve bir kez daha sonicate edin.
Çalışan bir sorbent şişesi hazırlayın. Bombaya uyan konik bir alt şişe olmalı. Belirli bir basınçlı bomba tasarımına bağlı olarak başka bir 1,5 mililitre santrifüj tüpü veya başka bir şişe olabilir.
Basınç bombasının yüksekliğine kadar kesilmiş etekli konik alt vidalı kapak tüpü kullanıyoruz. Stok sorbent şişesinde sorbent yeniden askıya alın ve çalışan sorbent şişesine 500 mikrolitreyi ikiye üç milimetre büyüklüğünde bir mıknatıs çubuğu ile birlikte aktarın. Metanol ile bir mililitreye kadar çalışma şişesine kadar.
Sorbent'in yerçekimi ile yerleşmesi için çalışma şişesinin 10 dakika boyunca masada durmasına izin verin. Bu adımın sonucu, dört milimetre yüksekliğinde gevşek sorbent alt tabakasına sahip konik bir alt şişe olmalıdır. Katman çok düşükse ve stok şişesinden biraz daha sorbent ise.
Bu nedenle hazırlanan çalışma şişesi, aylarca birden fazla sütunun hazırlanması için tasarlanmıştır. Çalışan sorbent şişesi iki saatten fazla karıştırmadan kalırsa, paketlemeden önce girdaplı, sonicated ve yerçekimi tarafından tekrar yerleşmelidir. Her şey hazırlandığında, basınçlı bombayı paketleyerek dördüncü aşamaya geçin.
Kaynaşmış silika kılcal damarlar ve basınçlı bomba ile çalışırken her zaman koruyucu gözlük takın. Aynı zamanda, koruyucu eldivenler önerilmez. Küçük çaplı kılcal damarların düzgün kullanımı için gereken dokunma hissini ciddi şekilde azaltır ve hatalara yol açar.
Sorbent şişesini basınçlı bombaya yerleştirin ve tüm düğümleri sıkıca sabitleyin. Dönüşü dakikada 60 ila 100 mermiyle başlatın, fırfırlı veya çekilmiş yayıcı kılcal damarı bombaya yerleştirin. Şişenin en altına doğru itin, sonra iki ila üç milimetre yukarı kaldırın ve düğümü sabitle.
Kılcal damarı sabitlemek için minimum gerekli kuvveti uygulayın. Kılcal damarın düzgün bir şekilde sabit olup olmadığını kontrol edin. Kılcal damarı elle çekerek hareket ettirmek imkansız olmalı.
Çok yavaş, yüzünüzden işaret edilen kılcal damarın açık ucunu tutarken basınçlı bomba vanasını açın. Paketleme işleminin ilk adımlarını izleyin. Basınçlandırmadan hemen sonra, sorbent kılcal damarı doldurur ve tüm uzunluk boyunca şeffaf olmaz.
Sorbent distal ucun içine toplanmaya başlar başlamaz, geri basınç artar, akış yavaşlar ve kılcal reformların içindeki sorbent bulamaç, sorbent serbest boşluklarla ayrılmış birkaç sorbent pakete dönüşür. Zaten paketlenmiş sorbent, yoğun renkli sürekli büyüyen bir bölge olarak görülebilir. Sorbent dolgulu bölgeleri, paketleme işlemi boyunca küçük sorbent serbest boşluklarla kılcal uzunluğun en az% 70'i olacak şekilde tutun.
Paketleme işlemi sırasında izlenecek birkaç yaygın sorun vardır. Kılcal damarlara verimli sorbent teslimatı sağlamak için uçuşta kurulum ayarı gerektirirler. En sık karşılaşılası sorun, yeni sorbent kılcal damara girmeyi bıraktığında, zaten içerideki sorbent hareket etmeye devam ettiğinde.
Çoğu durumda, kılcal giriş kendi kendine toplanan sorbent kümeleri tarafından engellenir. Sorbent akışı geri yüklenene kadar bu adımları tek tek uygulayın, sonra sorunla ilgili adımların geri kalanını atlayın. Dönüş hızını dakikada 500 mermiye çıkarın ve hemen 60 RPM'ye düşürün.
Çoğu zaman sorbent akışını geri yükler. Paketleme işleminin geri kalanı için dönüş hızının en az 60 RPM olmasını kontrol edin. Yardımcı olmazsa, ambalaj bombasını kısa bir süre havalandırın ve hemen geri bastırın.
Yardımcı olmazsa veya engelleme tekrar olursa, kılcal damarı sorbent katmanın içinde yeniden konumlandırın. Sorbent'in yokluğu, kılcal ucun mıknatıs çubuğunun çok üzerinde olması nedeniyle olabilir, bu nedenle sütun ucu ona dokunmaz. Veya kılcal damar çok alçak konumlandırılmış ve şişe tabanına yapışır.
İlk olarak, bombayı tamamen boşalt, sonra somunu gevşet, kılcal damarı dibe it ve sonra iki milimetre geri çek. Somunu tamir et. Bombayı basınçlandırmak için vanayı açın ve paketlemeye devam edin.
Paketleme sorunları hakkında daha fazla ayrıntı yöntemin metin sürümünde açıklanmıştır. Hedef sütun uzunluğu artı beş ila yedi santimetre elde edilene kadar sütunu paketlemeye devam edin. Dönüşü durdurun ve bombanın basıncını yavaşça düşür.
Bomba vanasını biraz açın ve su şişesinin içindeki baloncuğun patlamasını bekleyin. Sonra vanayı biraz daha açın ve tekrar kabarcık patlamasının yavaşlamasını bekleyin. Bu nedenle, artımlı adımlarda, vanadan gaz çıkmayana kadar basıncı serbest bırakın.
Vanayı aynı anda açmayın. Kılcal damarın içinde köpürmeye ve sorbent'in şişeye geri dönmesine yol açacaktır. Bu olursa, bombayı geri bastırın ve sütunun tekrar toplandığını bekleyin.
Havalandırma vanasının içinden gaz çıkmadığında, paketlenmiş kılcal damarı basınç bombasından çıkarın. Sütunun kurumasına izin vermeyin. Daha fazla paketleme için hplc sistemine hemen bağlı değilse, paketlenmiş kılcal damarı% 10 etanol çözeltisine tamamen batırarak depoya koyun.
Bağlantısı kesilen HPLC sütunları da aynı şekilde depolanır. Bugün için daha fazla paketleme planlanmazsa, sorbent şişesini bombadan çıkar ve sıkıca kapatın. Sütun paketlemeyi daha ileriye saklamak için saklayın.
Beşinci aşama, HPLC toplanıyor. Paketlenmiş kılcal damarı HPLC bağlantısı ile HPLC sistemine bağlayın. Yüksek organik çözücü akışını başlatın.
Akışı, yaklaşık 300 çubuğu hedefleyen paketlenmiş uzunluğa göre ayarlayın. 40 santimetre paketlenmiş kılcal damarlar için dakikada 200-300 normal litre akış hızını kullanın. Toplam paketlenmiş uzunluğa ekleyerek, paketlenmedeki kılcal damarın içindeki gevşek sorbent'i izleyin.
Akışı durdurmadan, sütun gövdesini sonikasyon banyosuna iki kez daldırın. Sütun gövdesinin sadece bir kısmını daldırmak önemlidir. Sütun uçlarını ve kılcal bağlantıları batırma.
Sorbent yatak küçülme durduğunda, sütun gövdesini akışı durdurmadan sonikasyon banyosuna iki kat daha fazla daldırın. Sütunu 300 çubukta 10 dakika daha çalıştırın. Akışı durdurun, basıncın üç çubuğun altına düşmesini bekleyin ve sütunun bağlantısını kesin.
Sütunda boşluk ve renk değişikliği olmamasını görsel olarak inceleyin. Varsa, akış altında sonication tekrarlanabilir. Kritik denemeler için yeni bir sütun oluşturmayı düşünün.
Sütunu istediğiniz uzunluğa kesin. Düzgün yapılmış kesim, kolon verimliliği için bir ön koşuldur. Katip ile poliamid kaplamada bir çentik yapın.
Kılcal damarı kısmen kırın ve iki parçayı ayırın. Sütunun ön ucunu seramik bir gofret üzerinde veya lepleme filmiyle parlatın. Ultra yüksek basınçlı bağlantı kullanarak sütunu LC sistemine yeniden bağlayın.
Çalışma akış hızını %2 B'den başlatın. Örneğin, dakikada 500 nanolitrede 100 mikrometre kimlik sütunu çalıştırılır.
Basıncın dengelemesini bekleyin ve sütun geri basıncını kontrol edin. Düzgün hazırlanmış bir sütun, uzunluğu ve sorbent özellikleriyle orantılı olarak geri basınç verir. Örneğin, iki mikrometre sorbent ile dolu 30 santimetre kılcal sütun% 2 solvent B'de 450 ila 500 bar geri basınca sahiptir.Üretilen sütun beklenen aralıkta bir geri basınç veriyorsa, kullanıma hazırdır.
Geri basınç beklenen aralığın çok dışındaysa, sütunda veya LC sisteminde bir sorun vardır. FlashPack ile paketleme, 100 bar paketleme basıncında bir saatten daha kısa bir sürede 1,9 mikrometre sorbent ile 50 santimetre boyunca paketlenmiş bir kılcal damar üretir. Örnek olarak, 1.9 mikrometre ReprosilPur C18 AQ sorbent ile çekilmiş bir yayıcı kılcal içine paketlenmiş 30 santimetre 100 mikrometre kimliği ultra yüksek basınçlı sütun üretiyoruz.
Paketleme 60 çubukta 50 santimetre uzunluğunda çekilen yayıcı kılcal damara yapıldı. Kılcal damarlar 40 dakikada 40 santimetreye kadar paketlenmişti ve kılcal damarın içinde biraz daha sorbent paketli değildi. Paketlenmiş kılcal damar HPLC sistemine bağlandı ve bizim durumumuzda% 80 asetonitril,% 0.1 formik asit olan solvent B ile dakikada 300 nanolitrede çalıştırıldı.
Son dolu uzunluğu 43 santimetreydi. Sütun 30 santimetre kesilmiş. %99 solvent B ile dakikada 500 nanolittre çalışma akışında sütun, beklenen değere yakın olan 275 çubuğun geri basıncını verdi.
Sütunu test etmek için, sitokrom C proteininin 50 fmol'ünü 15 dakikalık bir gradyanda% 2-50 B'den ayırdık. Kromatografik tepeler minimum kuyruklama ile oldukça simetrikti. Ortalama FWHM yaklaşık üç saniyeydi.
Açıklanan protokol, uhplc sütunlarını makul bir sürede kurulan ortak bir 100 bar ambalajında üretebilir. Kısa HPLC veya UPLC sütunları dakikalar içinde paketlenebilirken, uzun 30-50 santimetrelik sütunlar bir saatten kısa sürede paketlenir. Yöntem, RP ve diğer kimyalara sahip sorbentleri herhangi bir sütun kimliğine paketlemek için etkilidir.
Üretilen sütunlar, benzer boyuttaki ve sorbent parametrelerdeki diğer ticari sütunlar kadar tekrarlanabilir şekilde etkilidir.
