Este método fornece uma ferramenta para os cientistas estudarem fatores genéticos ambientais que afetam a migração e o comportamento do esperma em seus ambientes nativos dentro do trato reprodutivo feminino. A principal vantagem dessa técnica decorre da epiderme transparente dos C.elegans, que permite aos experimentadores visualizar e registrar facilmente o movimento do esperma em animais vivos. Para começar, use uma picareta de verme feita a partir de uma pipeta Pasteur e um fio de platina achatado em uma extremidade para escolher hermafroditas de 20 a 30 estágioS L4, e coloque-os suavemente em uma placa de NGM semeada de seis centímetros.
Incubar as hermafroditas a 20 graus Celsius por 28 a 30 horas. Em seguida, faça uma placa de coloração masculina. Use a ponta de uma haste de vidro para raspar E.coli do gramado de uma placa semeada, e deposite-a no centro de uma placa de NGM não semeada, fazendo um ponto alimentar de cinco a sete milímetros de diâmetro.
Misture dois microliters de um mililitro em DMSO e 10 microliters de tampão M9 em um tubo de microcentrifuagem. Pipeta toda a solução mito-corante no ponto de alimento na placa de coloração masculina. Coloque a placa no escuro para secar por 30 minutos.
Sob um microscópio, em uma placa contendo C.elegans adultos de um a três dias de idade, identificar os machos por sua cauda em forma de ventilador. Escolha aproximadamente 100 machos para o ponto de alimento manchado de mito-corante na placa de coloração masculina. Enrole a placa em papel alumínio e incubar durante a noite a 16 graus Celsius.
No segundo dia, transfira os machos manchados para uma nova placa de NGM semeada para limpar o excesso de bactérias manchadas de mito-corante. Mantenha a placa no escuro até o acasalamento. Para fazer uma placa de acasalamento, em uma placa de NGM não semeada, gotejar dois microlitros de mistura espessa de E.coli.
Aguarde aproximadamente 10 a 15 minutos para que as bactérias grossas sequem para formar um ponto de acasalamento. Enquanto espera que a placa de acasalamento seque, misture 300 microliters de 1%de peso por tricaine de volume, 300 microliters de 0,1% de peso em volume tetramisole e 900 microliters de M9. Transfira 600 microliters da solução tetramisole/tricaine para um vidro de relógio. Transfira de 12 a 15 hermafroditas colhidas no primeiro dia na solução tetramisole/tricaine no vidro do relógio.
Coloque a metade inferior de uma placa de Petri sobre o vidro do relógio para mantê-la coberta de evaporação, e incubar por 30 minutos para imobilizar as hermafroditas. Em seguida, recupere a placa de NGM semeada que contém os machos manchados do escuro, e escolha 50 a 60 machos manchados no ponto de acasalamento seco na placa de acasalamento. Guarde a placa no escuro.
Depois que as hermafroditas forem imobilizadas, use uma pipeta pasteur de vidro para pegar as hermafroditas imobilizadas do vidro do relógio. Evite chupar as hermafroditas além da parte estreita da pipeta. Transfira as hermafroditas para uma placa ngm não semeada.
Retire o máximo de líquido possível e deixe o excesso de líquido secar. Assim que todo o líquido visível evaporar, transfira as hermafroditas anestesiadas para o ponto de acasalamento com os machos manchados. Incubar no escuro por 30 minutos para permitir o acasalamento.
Se a avaliação de distribuição de esperma for desejada, transfira as hermafroditas acasaladas para uma placa de NGM semeada e deixe descansar por uma hora antes de montar para visualização. Para montar vermes para visualização, primeiro gotejar de 10 a 15 microlitadores da solução tetramisole/tricaine para a almofada preparada de 2% de agarose, e transferir as hermafroditas acasaladas para a solução na almofada. Coloque uma mancha sobre os vermes.
Monte o slide em um microscópio vertical equipado com epifluorescência, e posicione o verme para que tanto a vulva quanto uma espermatozoide estejam à vista. Concentre a imagem focando no centro da espermatozoide. Verifique a exposição para os canais DIC e TRITC.
Em DIC, estruturas internas de vermes são claramente visíveis. No TRITC, espermatozoides individuais são visíveis como puncta distintos. Adquira imagens de DIC e fluorescência para cada útero.
Para capturar vídeos de lapso de tempo, primeiro localize as hermafroditas que contêm esperma rotulado dentro do útero. No painel Aquisição, ajuste os intervalos de aquisição da imagem para 15 a 30 segundos e a duração de 10 a 20 minutos por útero. Em seguida, clique em Executar para adquirir imagens de lapso de tempo nos canais DIC e TRITC.
Começando com a vulva de uma extremidade e a espermatozoide na outra, divida o útero em três zonas, com zona contendo a vulva e a zona três contendo a espermatozoide. Conte manualmente o número de espermatozoides dentro de cada terço do útero, e informe o número em cada zona como um percentual do esperma total em todo o útero. Se necessário, use a tabela de procuração para ajustar a intensidade do sinal das imagens do canal TRITC para que cada esperma possa ser visível e quantificado.
Para rastrear o esperma em imagens de lapso de tempo, use o software Fiji para análise. Use a função Importação de Bioformiões para importar as imagens de uma série de lapso de tempo como um hipersepilar. Em seguida, clique em Plugins, Rastreamento e, em seguida, Rastreamento Manual.
Na caixa de diálogo aberta, selecione a ferramenta TrackMate na barra de ferramentas Fiji. Clique duas vezes no esperma que será rastreado. Clique dentro do círculo verde com linhas tracejadas e arraste para a posição desejada.
Clique no círculo novamente. A linha verde tracejada se transforma em uma linha verde sólida. Acerte simultaneamente as teclas Shift e L para ativar o modo de rastreamento.
Passe para o próximo quadro na série time-lapse. Para definir a nova localização do esperma rastreado no novo quadro, passe o mouse sobre o novo ponto e pressione a tecla A. O rastreador aparece no novo local, e uma linha aparece, conectando o local onde o rastreador foi colocado no quadro anterior.
Repita o mesmo procedimento para o resto dos quadros. Depois que os rastreamentos tiverem sido concluídos, clique em Analisar na caixa de diálogo TrackMate para gerar os dados necessários. Para calcular a velocidade, divida o comprimento total do caminho do esperma pelo tempo decorrido.
Para calcular a velocidade vetorial, desenhe uma linha através do útero a partir da vulva, apontando para a espermatozoide. Use a ferramenta Linha para medir a distância que o esperma migrou ao longo desta linha do início ao fim do rastreamento. Divida essa distância pelo tempo decorrido.
Valores negativos indicam que o esperma migrou para longe da espermatoca. Para registrar a frequência de reversão, conte o número de vezes durante o qual o traço do esperma gerou um ângulo inferior a 90 graus durante três quadros consecutivos de lapso de tempo. Neste protocolo, os vermes machos de neblina 2 q71 foram manchados com mito-corante e acoplados a hermafroditas N2 do tipo selvagem.
O trato reprodutivo hermafrodita adulto tem dois braços que são imagens espelhadas um do outro. Após o acasalamento, o esperma rotulado é depositado no útero hermafrodita através da vulva. Os espermatozoides se movem em torno dos embriões em desenvolvimento dentro do útero, em direção à espermatozoide, onde são armazenados até a fertilização.
O útero hermafrodita foi dividido em três zonas para quantificar a distribuição e migração de espermatozoides. Para avaliar a velocidade do esperma e a frequência de reversão, apenas os espermatozoides na zona dois foram rastreados através de imagens de lapso de tempo. Esperma na zona um, começando da vulva, e a zona três, incluindo a espermatozoide, tendem a se mover em um padrão circular.
O esperma marcado pelos pontos vermelho e azul teve a velocidade do esperma e a frequência de reversão quantificada. Ao quantificar a distribuição de esperma no útero, a orientação adequada do esperma usando hermafroditas n2 tipo selvagem e os machos de neblina 2 q71 resultou em aproximadamente 90% do esperma rotulado atingindo a espermatozoide. Os dados não devem ser contados se o acasalamento resulta em poucos espermatozoides no útero ou espermatozoides demais no útero, preenchendo cada fenda.
É importante que os animais sejam manuseados suavemente durante cada etapa de transferência, que as hermafroditas sejam imobilizadas completamente, e que as placas e vermes contendo o mio-corante sejam protegidos da luz. Este método pode ser combinado com experimentos de knockdown genético ou nocaute, experimentos de exposição ambiental ou química, ou outras manipulações para identificar fatores que possam regular a migração de espermatozoides. Esta técnica nos permitiu identificar prostaglandinas específicas que são importantes para guiar o esperma até o oócito.
Essas prostaglandinas são sintetizadas através de um mecanismo não convencional que pode ser conservado em mamíferos superiores. Tetramisole, tricaine, DMSO são irritantes de pele e olhos e podem ter efeitos tóxicos em altas doses. É importante usar o equipamento de proteção adequado ao manusear quaisquer produtos químicos.
