שיטה זו מספקת כלי למדענים לחקור גורמים גנטיים סביבתיים המשפיעים על נדידת הזרע והתנהגות בסביבות הילידים שלהם בתוך מערכת הרבייה הנשית. היתרון העיקרי של טכניקה זו נובע מאפידרמיס שקוף של C.elegans, המאפשר לניסויים לדמיין בקלות ולתעד תנועת זרע בבעלי חיים חיים. כדי להתחיל, השתמש בבחירה תולעת עשוי פיפטה פסטר חוט פלטינה שטוח בקצה אחד כדי לבחור 20 עד 30 L4 שלב הרמפרודיטים, בעדינות למקם אותם על צלחת NGM זרעים שישה סנטימטרים.
דגירה הרמפרודיטים ב 20 מעלות צלזיוס במשך 28 עד 30 שעות. לאחר מכן, הפוך צלחת כתמים זכר. השתמש בקצה של מוט ערבוב זכוכית כדי לגרד E.coli ממדשאת החיידקים של צלחת זרעים, ולהפקיד אותו על מרכז צלחת NGM unseeded, מה שהופך את נקודה מזון חמישה עד שבעה מילימטר קוטר.
מערבבים יחד שני מיקרוליטרים של צבע מיטו מילימולרי אחד ב- DMSO ו- 10 מיקרוליטרים של מאגר M9 בצינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה כל פתרון צבע המיטו על נקודה המזון על צלחת הכתמים הגברית. מניחים את הצלחת בחושך לייבוש במשך 30 דקות.
תחת מיקרוסקופ, על צלחת המכילה C.elegans בוגרים בני יום עד שלושה ימים, לזהות את הזכרים על ידי הזנב בצורת מאוורר שלהם. בחרו כ-100 זכרים לנקודה של מזון מוכתם בצבע מיטו על צלחת הכתמים הגברית. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום, ודגירה לילה ב 16 מעלות צלזיוס.
ביום השני, להעביר את הזכרים מוכתמים על צלחת NGM זרעים חדש כדי לנקות את עודף חיידקים מוכתמים צבע מיטו. שומרים את הצלחת בחושך עד להזדווגות. כדי להפוך צלחת הזדווגות, על צלחת NGM unseeded, לטפטף שני microliters של תערובת E.coli עבה.
המתן כ-10 עד 15 דקות עד שהחיידקים העבים יתייבשו ויוצרים נקודה מזדווגת. בזמן ההמתנה לצלחת ההזדווגות להתייבש, לערבב יחד 300 microliters של 1% משקל לפי נפח tricaine, 300 microliters של 0.1% משקל לפי נפח tetramisole, ו 900 microliters של M9. מעבירים 600 מיקרוליטרים של תמיסת הטטרמיסולה/טריקאין לזכוכית שעון. העברה 12 עד 15 הרמפרודיטים הרפרודיטים הרים ביום הראשון לתוך פתרון tetramisole / tricaine על השעון.
מניחים את החצי התחתון של צלחת פטרי על השעון כדי לשמור אותו מכוסה אידוי, ו דגירה במשך 30 דקות כדי לשתק את הרמפרודיטים. לאחר מכן, לאחזר את צלחת NGM זרעים המכיל את הזכרים מוכתמים מן החושך, ולבחור 50 עד 60 זכרים מוכתמים על נקודה הזדווגות מיובשת על צלחת ההזדווגות. אחסן את הצלחת בחושך.
לאחר הרמפרודיטים משותקים, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית להרים את הרמפרודיטים משותקים מכוס השעון. הימנע ממצוץ הרמפרודיטים מעבר לחלק הצר של פיפטה. העבר את הרמפרודיטים על לוחית NGM שלא נפתה.
הסר נוזלים רב ככל האפשר, ולתת את הנוזל העודף יבש. ברגע שכל הנוזלים הנראים לעין התאדו, העבר את הרמפרודיטים הרדמה על נקודה ההזדווגות עם הזכרים המוכתמים. דגירה בחושך במשך 30 דקות כדי לאפשר הזדווגות.
אם יש רצון בהערכת חלוקת הזרע, מעבירים את הרמפרודיטים הממומנים לצלחת NGM זרע ומאפשרים להם לנוח במשך שעה אחת לפני ההרכבה להדמיה. כדי להרכיב תולעים להדמיה, טפטוף ראשון 10 עד 15 microliters של פתרון tetramisole / tricaine על כרית מוכנה 2%agarose, ולהעביר את הרמפרודיטים מום לתוך הפתרון על כרית. מניחים כיסוי על התולעים.
הר את המגלשה על מיקרוסקופ זקוף המצויד באפיפלואורסצנטיות, והצב את התולעת כך שגם הפות וגם זרע אחד יצפו. למקד את התמונה על ידי התמקדות במרכז spermatheca. בדוק את החשיפה הן עבור ערוצי DIC והן עבור ערוצי TRITC.
ב- DIC, מבני תולעת פנימיים גלויים בבירור. ב TRITC, זרע בודדים גלויים כמו puncta ברור. לרכוש תמונות DIC ו פלואורסצנטיות עבור כל רחם.
כדי ללכוד קטעי וידאו לשגות זמן, תחילה לאתר את הרמפרודיטים המכילים זרע שכותרתו בתוך הרחם. בחלונית 'רכישה', התאימו את מרווחי התמונה ל-15 עד 30 שניות ולמשך הזמן ל-10 עד 20 דקות לרחם. לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי להשיג תמונות לשגות זמן בערוצי DIC ו- TRITC.
החל מהפות בקצה אחד והזרע בצד השני, מחלקים את הרחם לשלושה אזורים, עם אזור המכיל את הפות ואת האזור השלישי המכיל את הזרע. לספור באופן ידני את מספר הזרע בתוך כל שליש של הרחם, ולדווח על המספר בכל אזור כאחוז מכלל הזרע ברחם כולו. במידת הצורך, השתמש בטבלת בדיקת המידע כדי להתאים את עוצמת האות של תמונות ערוץ TRITC כך שכל זרע יכול להיות גלוי וכימת.
כדי לעקוב אחר זרע בתמונות זמן לשגות, להשתמש בתוכנת פיג'י לניתוח. השתמש בפונקציה Bio-Formats Import כדי לייבא את התמונות מסדרה אחת של כשל בזמן כהיפרסטאק אחד. לאחר מכן, לחץ על תוספים, מעקב ולאחר מכן מעקב ידני.
בתיבת הדו-שיח שנפתחה, בחר בכלי TrackMate בסרגל הכלים של פיג'י. לחץ פעמיים על הזרע כי יהיה במעקב. לחץ בתוך העיגול הירוק הופיע עם קווים מקווקווים, וגרור למיקום הרצוי.
לחץ על המעגל שוב. הקו הירוק המקווקו הופך לקו ירוק מלא. לחץ בו-זמנית על המקשים Shift ו- L כדי להפעיל את מצב המעקב.
מעבר למסגרת הבאה בסדרת הזמן לשגות. כדי להגדיר את המיקום החדש של הזרע המסומן במסגרת החדשה, רחף עם העכבר מעל הנקודה החדשה והקש על מקש A. הגשש מופיע במיקום החדש ומופיע קו המחבר בין המיקום שבו הוצב הגשש במסגרת הקודמת.
חזור על אותו הליך עבור שאר המסגרות. לאחר השלמת המעקבים, לחץ על נתח בתיבת הדו-שיח TrackMate כדי ליצור את הנתונים הדרושים. כדי לחשב את המהירות, חלק את אורך הנתיב הכולל של הזרע לפי הזמן שחלף.
כדי לחשב את המהירות הווקטורית, למתוח קו דרך הרחם החל מהפות, הצבעה לכיוון spermatheca. השתמש בכלי קו כדי למדוד את המרחק הזרע עבר לאורך קו זה מההתחלה ועד סוף המעקב. חלק מרחק זה לפי הזמן שחלף.
ערכים שליליים מצביעים על כך שהזרע היגר הרחק מהזרע. כדי לתעד תדירות היפוך, ספור את מספר הפעמים שבמהלכן עקבות הזרע יצרו זווית של פחות מ- 90 מעלות במהלך שלוש מסגרות רצופות של זמן לשגות. בפרוטוקול זה, תולעים זכרות ערפל-2 q71 היו מוכתמות בצבע מיטו והומתו להרמפרומיטים מסוג N2 פראי.
למערכת הרבייה של הרמפרודיט למבוגרים יש שתי זרועות שהם תמונות מראה אחד של השני. עם ההזדווגות, זרע שכותרתו מופקדים ברחם הרמפרודיט דרך הפות. הזרע לנוע סביב העוברים המתפתחים בתוך הרחם, לכיוון spermatheca, שם הם מאוחסנים עד ההפריה.
הרחם הרמפרודיט חולק לשלושה אזורים לכמת את התפלגות הזרע והנדידה. כדי להעריך את מהירות הזרע ואת תדירות היפוך, רק זרע באזור השני היו במעקב באמצעות תמונות לשגות זמן. זרע באזור אחד, החל מהפות, ואת אזור שלוש, כולל spermatheca, נוטים לנוע בתבנית מעגלית.
זרע מסומן על ידי הנקודות האדומות והכחולות היה מהירות הזרע ותדירות היפוך כימתה. בעת כימות התפלגות הזרע ברחם, הנחיית זרע נכונה באמצעות הרמפרודיטים מסוג N2 פראיים וזכרי ערפל-2 q71 גרמו לכ-90% מהזרע המסומנים להגיע לזרע. אין לספור נתונים אם ההזדווגות גורמת למעט מדי זרע ברחם או יותר מדי זרע ברחם, וממלאת כל סדק.
חשוב כי בעלי החיים מטופלים בעדינות במהלך כל שלב העברה, כי הרמפרודיטים משותקים לחלוטין, כי הצלחות והתולעים המכילות את צבע המיו מוגנים מפני אור. שיטה זו עשויה להיות משולבת עם ניסויי הפלת גנים או נוקאאוט, ניסויי חשיפה סביבתית או כימית, או מניפולציות אחרות כדי לזהות גורמים שעשויים לווסת את נדידת הזרע. טכניקה זו אפשרה לנו לזהות פרוסטגלנדינים ספציפיים שחשובים להנחיית הזרע לאוציטים.
פרוסטגלנדינים אלה מסונתזים באמצעות מנגנון לא קונבנציונלי שניתן לשמר ביונקים גבוהים יותר. טטרמיסולה, טריקאין, DMSO הם מגרים בעור ובעין ועשויים להיות בעלי השפעות רעילות במינונים גבוהים. חשוב ללבוש את ציוד המגן המתאים בעת טיפול בכל כימיקלים.
