この方法は、女性の生殖管内のネイティブ環境での精子の移動と行動に影響を与える環境遺伝的要因を研究するためのツールを提供します。この技術の主な利点は、実験者が生きている動物の精子の動きを容易に視覚化し、記録することを可能にするC.elegansの透明な表皮に由来する。まず、パスツールピペットとプラチナワイヤーから作られたワームピックを使用して、20〜30 L4ステージの雌雄同体を選び、6センチメートルの播種NGMプレートにそっと置きます。
28〜30時間摂氏20度で雌雄同体をインキュベートします。次に、男性の染色プレートを作ります。ガラス攪拌棒の端を使用して、種まいたプレートのバクテリア芝生から大腸菌を削り取り、播種されていないNGMプレートの中央に堆積させ、直径5~7ミリメートルの食品ドットを作ります。
DMSOの1ミリモルミト染料の2マイクロリットルとマイクロ遠心チューブにM9バッファーの10マイクロリットルを混ぜます。すべての水戸染料溶液を、雄染色板の食品ドットにピペットします。プレートを暗闇の中に置き、30分間乾燥させます。
顕微鏡下で、1〜3日齢の成人C.elegansを含むプレート上で、ファン型の尾で男性を識別します。約100人の男性を、男性染色プレートの水色染色食品ドットに選びます。プレートをアルミホイルで包み、一晩摂氏16度でインキュベートします。
2日目には、染色した雄を新しい播種NGMプレートに移して、過剰な水生染色細菌を除去します。交配するまでプレートを暗闇の中に保管してください。交配プレートを作るために、播種されていないNGMプレートに、厚い大腸菌混合物の2マイクロリットルを滴下する。
厚い細菌が乾燥して交配点が形成されるまで約10〜15分待ちます。嵌合板が乾くのを待っている間に、体積トリカインで1%重量の300マイクロリットル、体積四トラミソールで0.1%重量の300マイクロリットル、M9の900マイクロリットルを混ぜ合わせます。テトラミソール/トリカイン溶液の600マイクロリットルを時計ガラスに移します。1日目に選んだ12~15個の雌雄同体を時計ガラスの四面体/トリカイン溶液に移します。
ペトリ皿の下半分を時計ガラスの上に置いて蒸発から覆い、30分間インキュベートして雌雄同体を固定します。次に、暗黒から染色した雄を含む播種したNGMプレートを取り出し、50〜60個の染色したオスを交配プレートの乾燥した交配ドットにピックします。プレートを暗闇の中に保管してください。
雌雄同体が固定化された後、ガラス製のパスツールピペットを使用して、時計ガラスから固定化された雌雄同体を拾います。ピペットの狭い部分を越えて雌雄同体を吸うのを避けてください。雌雄同体をシードなしのNGMプレートに移します。
できるだけ多くの液体を取り出し、余分な液体を乾燥させます。すべての目に見える液体が蒸発するとすぐに、麻酔した雌雄体を染色した男性と交配点に移します。暗闇の中で30分間インキュベートして交配を可能にする。
精子分布評価が望ましい場合は、交尾した雌雄同体を播種されたNGMプレートに移し、視覚化のために取り付ける前に1時間休むことを可能にする。視覚化のためにワームをマウントするには、まずテトラミソール/トリカイン溶液の10〜15マイクロリットルを調製された2%アガロースパッドに滴下し、嵌合した雌雄同体をパッド上の溶液に移します。ワームの上にカバースリップを置きます。
滑り台を蛍光を備えた直立顕微鏡に取り付け、外陰部と1つの精子が見えるようにワームを配置します。精子の中心に焦点を当てることによって画像を集中させる。DIC および TRITC チャネルの両方のエクスポージャーを確認します。
DICでは、内部ワーム構造がはっきりと見える。TRITCでは、個々の精子は明確なパンクタとして見える。各子宮のDICおよび蛍光画像を取得します。
タイムラプスビデオをキャプチャするには、まず子宮内にラベル付き精子を含む雌雄同体を見つける。取得パネルで、画像取得間隔を 15 ~ 30 秒、持続時間を子宮当たり 10 ~ 20 分に調整します。次に、[実行]をクリックして、DICおよびTRITCチャンネルのタイムラプス画像を取得します。
一方の端の外陰部ともう一方の端の精子から始まり、子宮を3つのゾーンに分け、外陰部を含むゾーンと精子を含むゾーン3を含む。手動で子宮の3分の1以内の精子の数を数え、各ゾーンの数を子宮全体の全精子の割合として報告する。必要に応じて、ルックアップテーブルを使用して、すべての精子を見て定量化できるように、TRITCチャンネル画像の信号強度を調整します。
タイムラプス画像内の精子を追跡するには、フィジーのソフトウェアを使用して分析します。1 つのハイパースタックとして 1 つのタイムラプス シリーズから画像をインポートするバイオフォーマットインポート機能を使用します。次に、[プラグイン]、[追跡]、[手動追跡] の順にクリックします。
開いたダイアログ ボックスで、フィジーのツールバーの TrackMate ツールを選択します。追跡される精子をダブルクリックします。表示された緑色の円の内側を破線でクリックし、目的の位置までドラッグします。
もう一度円をクリックします。緑の破線は、緑色の実線に変わります。同時に、トラッキングモードをオンにするには、ShiftキーとLキーを押します。
タイムラプスシリーズの次のフレームに移動します。新しいフレームで追跡された精子の新しい位置を設定するには、新しいポイントの上にマウスを移動し、A キーを押します。トラックが新しい位置に表示され、前のフレームにトラッカーが配置された位置を接続するラインが表示されます。
残りのフレームについても同じ手順を繰り返します。トレースが完了したら、[TrackMate] ダイアログ ボックスの [解析] をクリックして、必要なデータを生成します。速度を計算するには、精子の全パス長を経過時間で割ります。
ベクトル速度を計算するには、外陰部から始まる子宮を通して、精子に向かって線を引く。[ライン] ツールを使用して、精子がこのラインに沿って移動した距離をトレースの先頭から末尾まで測定します。この距離を経過時間で割ります。
負の値は、精子が精子から離れて移動したことを示しています。逆転周波数を記録するには、精子のトレースが3つの連続したタイムラプスフレームの間に90度未満の角度を生成した回数を数えます。このプロトコルでは、霧-2 q71雄のワームを糸色素で染色し、野生型N2雌雄同体に交配した。
成人雌雄同体生殖管は、お互いの鏡像である2本の腕を有する。交尾の際、標識された精子は外陰部を通して雌雄同体の子宮に沈着する。精子は子宮内の発達中の胚の周りを移動し、受精するまで保存される精子に向かう。
雌雄同体の子宮は、精子の分布と移動を定量化するために3つのゾーンに分けられた。精子の速度と逆転頻度を評価するために、ゾーン2の精子のみがタイムラプス画像を介して追跡された。ゾーン1の精子は、外陰部から始まり、精子を含むゾーン3は円形のパターンで移動する傾向がある。
赤と青の点でマークされた精子は、精子の速度と逆転周波数を定量化しました。子宮内の精子分布を定量化する場合、野生型N2雌雄同体および霧-2 q71雄を用いた適切な精子誘導により、標識された精子の約90%が精子に到達した。交配の結果、子宮内の精子が少なすぎる場合や、子宮内の精子が多すぎて、各割れ目を満たす場合は、データをカウントしないでください。
動物は、各移動工程中に穏やかに処理され、雌雄同体が完全に固定化され、ミオ染料を含むプレートやワームが光から遮蔽されるということが重要です。この方法は、遺伝子のノックダウンまたはノックアウト実験、環境または化学的暴露実験、または精子の移動を調節する可能性のある因子を同定するための他の操作と組み合わせることができる。この技術は、卵母細胞に精子を導くために重要である特定のプロスタグランジンを識別することを可能にしました。
これらのプロスタグランジンは、より高い哺乳類で保存され得る非伝統的なメカニズムを介して合成される。四トラミソール, トリカイン, DMSOは皮膚および眼刺激物であり、高用量で毒性作用を有する可能性があります.あらゆる化学物質を扱うときに適切な保護具を着用することが重要です。
