Os autores gostaria de agradecer a Heather Currey por sua contribuição inicial para o projeto de estudo e Dr. Swarup Mitra para sua revisão crítica do manuscrito. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Michael B. Harris por comentários, refinamentos e assistência em produzir a demonstração desta metodologia. As cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio números UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 e por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do o Instituto Nacional de General Medical Ciências do institutos nacionais da saúde sob concessão número 5P20GM103395-15. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. UA é um AA/EO empregador e a instituição educacional e proíbe a discriminação ilegal contra qualquer indivíduo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis peneira construção e uso
<ol><li>
Protocolo de construção
	<ol>
<li>Adquira 2 tampas de tubos de Erlenmeyer de 50 mL (figura 1A).</li>
		<li>Remover a área do centro dentro do lábio interior das tampas (quando visto de baixo, figura 1B) usando um bico de Bunsen e uma sonda de metal quente ou um ferro de solda ou pisar a broca. Nota: Usando o calor para cortar a tampa de plástico é preferível uma lâmina, porque há menos risco de lesão.</li>
		<li>Limpar e lixar as bordas cortadas e cubra a superfície com um arquivo curvado ou um rotativo moer ferramenta (por exemplo, Dremel). Ver Figura 1.</li>
		<li>Corte o círculo da malha monofilamento para o diâmetro apropriado (Figura 1). Para isso, trace uma tampa sobre uma folha de malha de nylon monofilamento e corte apenas dentro da linha desenhada.</li>
		<li>Corte barras/sulcos na superfície superior das tampas para melhorar a aderência das duas tampas, quando a cola é aplicada para o plástico (Figura 1E).</li>
		<li>Limpe as tampas com etanol e deixe-os secar.</li>
		<li>Aplique a cola de cianoacrilato para a superfície superior de ambas as tampas, mantendo a borda externa. Nota: um pouco de cola vai um longo caminho.</li>
		<li>Coloque o engranzamento do monofilamento, de acordo com a tabela 1, em uma tampa colada (Figura 1F). Coloque a segunda tampa invertida em cima da malha; ambas as tampas devem ter seus topos juntos. Pressione firmemente juntos (Figura 1). Certifique-se de que a malha é esticada. Nota: como medida de segurança, usar uma pinça para colocar a malha nas tampas.</li>
		<li>Uma vez que a camada inicial de cola secou, aplica um anel de cola de cianoacrilato em torno o fosso exterior entre as tampas. Ser generoso como isso agrega integridade e impede qualquer peeling separado ou com vazamento.</li>
		<li>Rotule o filtro com o tamanho de poro de malha da malha monofilamento. Nota: Aqui, usamos dois tamanhos de poros de malha — 20 µm e 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de uso
	<ol>
<li>Pre-molhado da peneira.<ol>
<li>Pipetar uma solução salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L de ultrapura H2O e 1 mL de MgSO4 (1m)]17, através do centro da peneira até formar uma gota , condensa e escorre para fora do centro da parte inferior do filtro (Figura 2A). Opcionalmente, aplicar um apagamento de fiapos (por exemplo, Kimwipe) para o fundo de forma ou espalhar uma gota de umidade na malha.</li>
			<li>Coloque a peneira sobre um tubo cónico de 50 mL. Rotular o tubo como 'Tubo de resíduos' (Figura 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave uma população de c. elegans sobre uma placa de ágar.<ol>
<li>Lavar a placa com o buffer M9 e coloque o meio contendo worm da parte de cima da malha monofilamento 1 mL de cada vez (Figura 2). Certifique-se de operar-se no centro da malha. Lave todos os vermes da placa. Nota: Normalmente, 3 mL de M9 para uma placa de 60 mm é suficiente.</li>
			<li>Para minimizar o número de vermes perdido na pipetagem, use um pipeta Pasteur de vidro para mover os vermes fora da placa e no centro da malha (repetição conforme necessário).</li>
			<li>Lave o filtro com o buffer M9 do topo. Novamente, certifique-se de operar-se no centro da malha e lave todos os vermes nessa área. Lave quantas vezes for necessário para garantir que todas as bactérias e vermes menores passaram a malha.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Os animais de tamanho correspondente da peneira da colheita.<ol>
<li>Anexe um novo tubo cónico de 50 mL para a parte superior da peneira, com os vermes adultos da etapa 1.2.2.3 voltados para dentro do tubo da nova coleção (Figura 2D).</li>
			<li>Remover o primeiro tubo (resíduos) e rapidamente vire a peneira e tubo novo para impedir a migração da gota (Figura 2E). Nota: Se esterilidade não é necessária, use uma limpeza de fiapos (por exemplo, Kimwipe) ao pavio fluido de baixo da malha antes de virar.</li>
			<li>Enxágue a malha com M9 no novo tubo 50 mL do bordo novo (Figura 2F). Novamente, operar no centro da malha e a manter uma gota na parte de baixo da malha.</li>
			<li>Permitir que os vermes resolver ou spin-os suavemente para baixo (por exemplo, < x 16 g) por aproximadamente 1 min (Figura 2).</li>
			<li>Aspirar a solução-tampão da pelota de vermes, idealmente para > 0,5 mL, ou remover todo o líquido possível sem perturbar o sedimento.</li>
			<li>Pipetar os vermes usando um pipeta Pasteur em um prato NGM do vidro e deixe-os secar. Espaço múltiplas gotículas fora em um prato novo para secar mais rápido (Figura 2 H).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Limpe o crivo.<ol>
<li>Enxágue a peneira delicadamente e completamente com água etanol e osmose reversa. Deixe-o secar.</li>
			<li>Armazená-lo em um recipiente limpo para uso futuro indefinido.</li>
			<li>Descartá-lo quando a malha desenvolve uma aparência de "sag".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. validação de peneira Caenorhabditis , método de classificação
<ol><li>Manutenção geral
	<ol>
<li>Para todos os experimentos, cultura vermes num padrão de nematódeo crescimento Media17 (1L de NGM consiste de 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 975 mL de água bidestilada, 1 mL de colesterol de 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL, 25 mL de 1m KHPO4e 1 mL de 1 M de MgSO4) a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Administração de tratamento experimental
	<ol>
<li>Compare os três grupos: picareta, fluorodeoxyuridine (FUDR) e Caenorhabditis peneira.<ol>
<li>Para o grupo de tratamento FUDR, adicionar 100 mg/mL FUDR para a mídia NGM para uma concentração final de 100 μM para impedir qualquer produção de descendência e transferir os vermes todos os dias para um prato NGM fresco para evitar o esgotamento de comida.</li>
			<li>Para o grupo escolher, selecionar e transferir os vermes manualmente usando um loop de platina.</li>
			<li>Para o grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis , siga a etapa 1.2 e pipetar os vermes em um prato NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Percentagem do rendimento da peneira
	<ol>
<li>Para quantificar como a peneira é eficaz na classificação de c. elegans, crescer idade-síncrono N2 animais para 1 dia de idade adulta, a 25 ° C (ou seja, 48 h após a postura de ovos) e depois transferi-los por pegá-los para novas placas NGM (totalizando N = 50 ou N = 100 animais por tre grupo de atment).</li>
		<li>Após 24h de recuperação, transferir a população para novas placas NGM com o crivo de Caenorhabditis seguindo acima do protocolo (consulte a etapa 1.2) e contar o número de animais transferidos com êxito.</li>
		<li>Calcule a percentagem do rendimento como a relação entre o número de animais transferidos em comparação com o número inicial no início da transferência multiplicado por 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios Healthspan Nota: Pontuação healthspan parâmetros de classe de motilidade, a taxa de bomba da faringe e tanto o anterior e a posterior toque suave resposta nos dias 2, 4, 6 e 8 da maioridade para idade-sincronizado N2 animais mantidas a 25 ° C.<ol>
<li>Motilidade de rastreamento<ol>
<li>Atribuir pontuações de motilidade, baseadas em um sistema baseado em classe (classes A, B e C) seguindo os métodos de Herndon et al . 18. comparar os efeitos dos três grupos experimentais usando um modelo de estatísticas logístico ordinal em software de análise estatística. Nota: Os indivíduos de classe A mover-se espontaneamente em um padrão normal, sinusoidal. Indivíduos de classe B mover-se em movimentos marcadamente não-sinusoidal e podem exigir cutucando para encorajar a circulação. Indivíduos de classe C mover sua cabeça e/ou cauda em resposta ao estímulo, mas são incapazes de se mover através de agar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Taxa de bomba da faringe<ol>
<li>Conte o movimento moedor do bulbo de faríngea terminal do animal visualmente sob um estereomicroscópio com uma 600 X ampliação final por 1 min.</li>
			<li>Realizar uma análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resposta de toque<ol>
<li>Gravar uma resposta de toque suave e comparar entre os três grupos. Realizar os ensaios com base em métodos descritos por Calixto et al . 19.</li>
			<li>Registro anterior e posterior toque resposta por suavemente acariciando um picador de cílios perpendicularmente através da cauda ou na cabeça (5x cada, alterna cabeça e cauda) dos animais.</li>
			<li>Marca qualquer movimento no sentido oposto do traço como 1 ponto em uma escala de 0 a 5 para o anterior e a posterior resposta.</li>
			<li>Realizar análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de fecundidade
	<ol>
<li>Para determinar o uso do impacto da peneira Caenorhabditis na reprodução, crescer idade-síncrono N2 animais ao dia 2 de idade adulta, a 25 ° C.</li>
		<li>60h depois põem ovos, transferir os animais para novas placas NGM com um picador de platina ou a peneira Caenorhabditis e dar-lhes a 4 h para recuperar (seque as placas peneiradas para 20-30 min).</li>
		<li>Após a recuperação, individualmente placa os animais através de um cílio escolher placas de NGM, dar-lhes 24 h para colocar ovos e remover os animais. Permitir que a descendência em cada placa para desenvolver em condições normais, a 25 ° C para outro 24h. Nota: Um picador de cílios é um cílio humano garantiu à extremidade de uma pipeta Pasteur com esmaltes e esterilizados com etanol.</li>
		<li>Conte o número de indivíduos de geração F1 viáveis. Realizar uma análise estatística utilizando um T-teste com α = 0,05. Nota: Prole viável é considerados os ovos que eclodem e iniciam o seu desenvolvimento através dos ciclos regulares larvas com êxito.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de resposta de estresse repórter fluorescentes
	<ol>
<li>Realizar três ensaios de repórter fluorescentes comumente usado para detectar potenciais marcadores de estresse: uma translocação DAF-16::GFP para os núcleos das células em uma cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; uma expressão de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; e uma expressão de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Para cada ensaio, cultura idade-síncrono animais dos grupos de tratamento de três a 20 ° C e examiná-los no dia 3 de idade adulta: usar um controle negativo (em uma base diária, de transferência de um grupo de animais manualmente com um picador de platina), um controle positivo (em uma base diária transferência de um grupo de animais manualmente com uma picareta platinum plus um estressor estabelecido) e o crivo de Caenorhabditis (passar os animais através da peneira e permitir-lhes a recuperar por 30 min em NGM antes de imagem).</li>
		<li>No ensaio de DAF-16::GFP, calor choque os animais controle positivo a 37 ° C por 30 min antes de20de imagem. Para o ensaio de hsp-16.2, calor choque os animais controle positivo para 90 min, 20 h antes de imagem21. Para o ensaio de sod-3, trate os animais de controle positivo com paraquat 100 mM por 4h antes de22de imagem.</li>
		<li>Colher os vermes imediatamente com um picador de cílios e montá-los para uma lamela com 1 μL de solução 36% Poloxâmero 407 surfactante para imobilizar os vermes.</li>
		<li>Sanduíche dos vermes montados com outra lamela. Monte as duas lamelas de uma lâmina de vidro padrão de microscopia e imagem os vermes usando uma ampliação X 8 em um microscópio fluorescente invertido (para uma ampliação total de 80 X) e uma exposição constante com um filtro FITC.</li>
		<li>Para detectar quaisquer diferenças entre os três grupos no ensaio de DAF-16::GFP, categorizar os animais com base na localização do repórter DAF-16::GFP (nuclear, se o repórter translocados para núcleos, citosólico se o repórter localizado no citosol e o intermediário se o repórter localizado em ambos os núcleos e citoplasma).</li>
		<li>Compare os resultados usando um modelo estatístico de logística ordinal em software de análise estatística. Para o hsp-16.2 e os ensaios de expressão sod-3, use uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e testes post hoc de Tukey com α = 0,05 para comparar a fluorescência total da região da cabeça.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar. Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Aqui, apresentamos o projeto e uso da peneira Caenorhabditis acessível, eficaz como uma ferramenta para classificação e mantendo o c. elegans. Esta ferramenta tem várias vantagens para escolher manualmente a animais individuais, lavando as populações, tratamentos químicos (por exemplo, FUDR) e métodos mais caros dos animais segregam. Primeiro, o Caenorhabditis peneira eficientemente e rapidamente (menos de 20 min) classifica a descendência de grandes populações mistas de animais (tabela 2). Além disso, o uso da ferramenta não tem nenhum efeito tóxico detectável na healthspan dos animais (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6), não induz estresse genética bem-descrito repórteres (Figura 7, Figura 8 Figura 9) e reduz a quantidade de estrangeiro químico que poderia influenciar o tratamento aplicado para as placas de cultura ou qualquer ensaio molecular posteriormente. Sua facilidade de uso é uma vantagem significativa; um pesquisador em qualquer fase na sua educação pode ser treinado para usá-lo (Figura 1 e Figura 2; Protocolo).
Os materiais necessários para a fabricação e o uso da peneira (por exemplo, pipetas, amortecedores) estão prontamente disponíveis em laboratórios de pesquisa padrão; assim, se quebrado, o crivo de Caenorhabditis não é caro para substituir ou reparar. A construído pela própria natureza da peneira Caenorhabditis permite que ele seja uma ferramenta versátil: ele pode ser construído com malha tamanhos apropriados para diferentes c. elegans estádios de desenvolvimento e fenótipos. A peneira de Caenorhabditis pode também ser utilizada em ensaios conduzidos em outras espécies de nematoides ou quando isolar pequenos organismos, desde o tamanho de engranzamento apropriado é usado na fabricação.
Além dos benefícios desta ferramenta fornece para manutenção de população de c. elegans , a peneira pode ser usada para limpar animais antes da sua utilização em outras aplicações experimentais. Por exemplo, com o desenvolvimento de microfluídica para conduzir o c. elegans pesquisa vem a questão do uso de chip e limpeza. Dependendo da quantidade de bactérias anexado aos animais, precauções especiais devem ser tomadas para não entupir o chip microfluídicos, tornando-o inutilizável29. Muitas vezes, quando c. elegans são transferidos para um chip microfluídicos, resíduo de gramado bacteriano é trazido com eles. Este resíduo pode e obstruir os canais microfluídicos, tornando o mau funcionamento do chip, que então requer limpeza ou substituição. A construção do dispositivo neste protocolo oferece um método para a colheita não só animais sincronizados para microfluídica, mas também para a limpeza dos animais antes da sua inserção em um dispositivo microfluidic. Removendo os detritos e resíduo bacteriano, retomada quando a coleta de animais, os canais microfluídicos são menos propensos a avaria, aumentando assim a vida operacional de fichas individuais e a taxa de transferência subsequente de pesquisas sendo realizadas com eles.

O verme nematoide, Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo premier. Além da natureza simples e controlada do seu cultivo em laboratório, todo o seu genoma é sequenciado1 e o destino do desenvolvimento de cada célula é conhecido2. Devido a estas características, c. elegans é um organismo modelo amplamente usado para estudos genéticos. No entanto, juntamente com estas características benéficas vem alguns desafios para os pesquisadores. Devido ao seu tempo de geração rápida, as populações de c. elegans rapidamente podem ficar sem comida e/ou se misturam as populações com várias gerações e estádios de desenvolvimento presentes ao mesmo tempo. Assim, experimentos realizados na mídia de crescimento sólido de nematoides (NGM) exigem pesquisadores mover fisicamente os animais para placas frescas antes da fonte de alimento bacteriana esgota e desenvolvem novas larvas. Isto pode ser tedioso como uma transferência frequente dos animais é necessária para evitar as populações experimentais de tornar-se misturado com gerações de prole. Ainda, alguns experimentos requerem ambos grande número de animais e de pontos de tempo prolongado (por exemplo, extração de DNA ou RNA na idade adulta). Este compostos os desafios com precisão, mantendo uma população sincronizada e transferir um grande número de animais.
Métodos atuais de transferência de c. elegans cultivadas em NGM estão escolhendo ou lavar os animais de placa para placa; quimicamente, tratando os animais (por exemplo, com o DNA replicação inibidor fluorodeoxyuridine ou FUDR); ou usando citometria de fluxo para classificar os animais em placas multi bem. Colheita envolve o uso de uma ferramenta de mão, feito com um arame fino de platina ou um cílio, para transferir manualmente o indivíduo ou vários animais3,4. Esse método é preciso, mas requer habilidade e tempo e é uma limitação de estudos envolvendo um grande número de animais. Escolher o maio também ser fisicamente prejudiciais e estressante para os animais potencialmente sujeitando indivíduos quantias antinatural e inconsistente de perturbação e força. Lavar roupa envolve um prato de cultura com uma solução tampão de lavagem e transferir a solução com os animais através de uma pipeta Pasteur de vidro para uma nova placa de cultura. Este método é rápido e eficiente, mas não é exato, como várias gerações e estádios de desenvolvimento dos animais são transferidos em massa. Tratamentos químicos, tais como FUDR, podem ser dissolvidos na mídia cultivo para impedir a produção de descendência através de bloquear qualquer replicação do DNA e, portanto, o desenvolvimento de ovos e produção de gametas. Pouco eficaz, este método deve ser aplicado após a maturação do desenvolvimento como para não perturbar os processos do desenvolvimento normais, e isso significa que ainda há um requisito para transferir os animais antes da sua administração3. Esse método também influencia vários celulares vias de sinalização, resultando em efeitos visíveis dos animais com a idade (por exemplo, uma extensão de vida útil ou um proteostasis alterada) dependendo da cepa de c. elegans usado5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometria de fluxo automaticamente classificar e transferir individual c. elegans de uma placa multi bem para outro11. Enquanto este método é muito eficaz e eficiente, equipamento de citometria de fluxo é proibitivamente caro e inacessível para muitos pesquisadores. Uma alternativa para transferência de animais é usar modelos mutantes que são sensível, tais como fer-15 e fem-1, que se tornam estéreis com ajuste de temperatura12de temperatura. Enquanto usar animais mutantes é útil em algumas situações, estas cepas específicas crescem mais lentamente do que os animais selvagem-tipo e eles contam com um genoma alterado, servindo como pobres representantes para vermes envelhecimento ou saudáveis. Além disso, a dependência de uma mudança de temperatura para induzir esterilidade também resulta na ausência de um ambiente estático, e mudanças de temperatura foram prontamente mostradas para influenciar o gene expressões13,14, 15. grupos de pesquisa têm publicado anteriormente técnicas descrevendo o uso de uma malha para filtrar c. elegans por tamanho16. No entanto, fomos capazes de encontrar trabalhos anteriores testes para qualquer alteração nos resultados saúde geral podem ser associados com o uso de tais filtros.
Há, assim, uma necessidade um método acessível, eficiente, rápido e preciso para transferir um grande número de animais entre placas de cultura dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans . Nós desenvolvemos uma peça melhorada, acessível do equipamento (chamado Caenorhabditis peneira) e um protocolo associado para sua manufatura e operação que atenda às necessidades da comunidade de pesquisa de c. elegans . Aqui, partilhamos o projeto do Caenorhabditis peneira e métodos para sua utilização, e demonstramos que seu uso não afeta a saúde comum ou qualquer marcadores de estresse quando comparado a colheita manual padrão e um tratamento com o comumente usados, restrição da fertilidade química FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo de bem-estabelecida modelo usado em toda uma gama de pesquisas básicas e biomédica. Dentro da comunidade de pesquisa nematoide, há uma necessidade de uma maneira acessível e eficaz para manter as populações grandes, idade-combinadas de c. elegans. Aqui, apresentamos uma metodologia para mecanicamente classificação e limpeza c. elegans. O nosso objectivo é fornecer um processo econômico, eficiente, rápido e simples para obter animais de tamanhos uniformes e estágios de vida para a sua utilização em experiências. Esta ferramenta, o crivo de Caenorhabditis , usa um sistema de tampa custom-built que tópicos para tubos comuns de laboratório cónico e classifica c. elegans com base no tamanho do corpo. Também demonstramos que a peneira Caenorhabditis efetivamente transfere animais de placa de uma cultura para outra que permite uma classificação rápida, sincronizando e limpeza sem afetar marcadores de saúde, incluindo a motilidade e stress-inducible repórteres do gene. Esta ferramenta acessível e inovadora é uma opção rápida, eficiente e não estressante para manter as populações de c. elegans .

A peneira de Caenorhabditis consiste de 2 tampas de rosca, protegendo uma área de malha de monofilamento de nylon tecido menor que o diâmetro do corpo da época do desenvolvimento desejado, usado para extrair ao vivo populações de organismos usando uma técnica simples lavagem. Ele atribui aos tubos cónicos padrão e usa a tela de engranzamento mecanicamente classificar animais pelo diâmetro do corpo, deixando os animais desejados no tubo pronto para mais manutenção e experimentação (por exemplo, transferência ou cultura genética). Um manual suave de lavagem com o crivo de Caenorhabditis é rápido, cerca de 5 min por placa de 60 a 100 mm e os organismos são facilmente recuperados de malha.
Percentagem de rendimento dos animais a seguir Caenorhabditis Use peneira Para estabelecer a percentagem do rendimento da peneira Caenorhabditis , dispositivos foram testados com 20 μm e 50 μm malhas de tamanho de poro em animais adultos. A dizer o rendimento de um > 90% transferência de animal bem sucedido foi alcançada para ambos os tamanhos de malha testados (tabela 1).
Monofilamento malha com tamanho diferente, as lacunas podem ser usadas para separar animais dos estágios de vida diferentes. Malha com 20 μm de lacunas é apropriada para lavar afastado desenvolvimento de embriões e estágios larvas menores do que a quarta fase larval, retendo o último (L4; com um diâmetro de corpo médio de 32 μm) e animais nas fases posteriores de vida, enquanto malha com 50 μm lacunas permitirá que todos os outra vida dos estágios de lado de adultos (com um diâmetro de corpo médio de 70 μm) a ser lavada (tabela 2).
Caenorhabditis Uso de peneira não afeta healthspan métricas Motilidade: Em c. elegans movimento senoidal normal (ou seja, motilidade) declina com a idade de18 anos e é um marcador de saúde geral. Para determinar se o crivo de Caenorhabditis influenciado motilidade, motilidade foram comparados para escolher, FUDR e peneira Caenorhabditis grupos de tratamento nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Todos os animais através de cada grupo (n = 10/grupo) exibiram padrões de movimento normal e espontânea (classe A), em várias idades em toda a vida adulta (dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta; p > 0,05 para comparações múltiplas em todos os dias, Figura 3).
Taxa de bomba faríngea: A capacidade dos músculos da faringe c. elegans' de bomba declina com a idade e é mais um biomarcador de healthspan23. Para determinar se o crivo de Caenorhabditis influenciado taxa de bomba faríngea, picareta, FUDR e Caenorhabditis dos animais foram comparados grupos de tratamento de peneira dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta (n = 8 a 10 por grupo). Houve diferença significativa entre os animais que foram submetidos a colheita e métodos FUDR nos dias 6 (p < 0,001) e 8 (p < 0,001). Além disso, houve uma diferença significativa entre os grupos FUDR e peneira nos dias 6 (p < 0,001) e dia 8 da idade adulta (p < 0,001). No entanto, não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa entre a palheta e os grupos de peneira Caenorhabditis para qualquer dia (p > 0,05, Figura 4), indicando que a peneira não afeta esta medida de healthspan.
Toque gentil resposta: Resposta ao estímulo mecânico é um marcador fisiológico para avaliar o envelhecimento ou geral saúde24,25; assim, o impacto dos métodos de transferência diferente na câmara anterior e as posterior toque suave respostas foram testados. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a palheta e FUDR Caenorhabditis peneira grupos de tratamento (n = 8/grupo), anterior ou posterior, para qualquer dia de testes (p > 0,4 para todas as comparações; Figura 5A e 5B).
Fecundidade: Para estabelecer ou não a peneira Caenorhabditis influenciado a quantidade de descendência viável produzida por c. elegans, a prole individual produzida em um período de 24 horas durante o dia 3 de idade adulta foi contado e comparado (n = 20 a 22 por grupo). O uso da peneira Caenorhabditis não teve impacto significativamente o número de descendentes produzidos quando comparados com um grupo de tratamento de escolha (p = 0,61, Figura 6).
Ensaios de repórter molecular DAF-16 translocação nuclear: Em c. elegans, a ativação do fator de transcrição DAF-16 está associada com aumento da pressão resistência26. A localização nuclear do DAF-16 foi examinada em uma cepa de nematoides transgênica TJ356, que expressa o DAF-16 fundida a uma proteína verde fluorescente (DAF-16::GFP)20. Em condições normais de crescimento, DAF-16::GFP está localizada principalmente no citosol, mas sob vários estressores (por exemplo, stress de calor), é rapidamente translocado para o núcleo de20. Para testar o impacto da classificação com o crivo de Caenorhabditis na translocação de DAF-16, DAF-16::GFP localizações foram comparadas em idade-combinadas dia-5 adultos em um grupo de controle positivo (stress térmico), um grupo de controle negativo (transferência manual através de escolha), e um grupos de tratamento Caenorhabditis peneira (n = 10/grupo). A transferência com o crivo de Caenorhabditis não afetou a translocação nuclear do DAF-16::GFP e mostrou um fenótipo semelhante aos animais controle negativo (p > 0,05, Figura 7).
HSP-16.2 repórter: proteínas de choque térmico pequeno como HSP-16.2 são biomarcadores de uma resposta ao estresse, e eles são altamente expressos durante uma exposição a choque térmico ou estresse oxidativo agentes21,27. A tensão de TJ375 tem um gene de repórter GFP fundido com um promotor de hsp-16.2 que não está ativo sob condições normais,21. No entanto, após uma exposição a um choque térmico, expressão de proteínas HSP-16.2 é induzida, e os animais exibir altos níveis de expressão de GFP21. Para testar o envolvimento da peneira Caenorhabditis em uma resposta ao estresse HSP-16,2-mediada, a densidade de fluorescência na região da faringe (n = 10 animais/grupo) de animais de idade correspondente foi comparado em dia-5 adultos entre um grupo de controle positivo (calor estresse), um negativo controlar grupo (escolher) e um grupo de tratamento Caenorhabditis peneira. A transferência com o crivo de Caenorhabditis não induz significativamente a expressão de HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) quando comparado com o controle negativo (p > 0,05, Figura 8).
SOD-3 repórter: Em c. elegans, o gene de anti-oxidante que códigos de superóxido dismutase (SOD-3) de 3 está acima-regulada durante estresse oxidativo28. A cepa de c. elegans CF1553 expressa a proteína verde fluorescente (GFP)-rotulado promotor de SOD-3, cuja expressão é induzida por estresse oxidativo, como o paraquat5. Para testar o envolvimento da peneira Caenorhabditis classificação da resposta antioxidante em c. elegans, a densidade de fluorescência na região da cabeça dos adultos idade-combinados do dia-5 foi comparada entre uma população de controlo positivo (paraquat 100 μM tratamento), uma população de controlo negativo (colheita manual) e um Caenorhabditis população peneira-transferido. A transferência com o crivo de Caenorhabditis não induz significativamente a expressão de sod-3::gfp quando comparado com o controle negativo (p > 0,05, Figura 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig1.jpg"> Figura 1: Construção de peneira Caenorhabditis . A progressão da fabricação da ferramenta 'faça você mesmo' é mostrada. Estes painéis mostram (A) dois 50 mL tubo cônico caps (B) cujos centros foram removidos, (C) cortadas bordas suavizadas e (D - F) que estão equipados com tela de monofilamento, correspondente à fase de vida desejado de C. elegans (Veja o protocolo para obter detalhes). (G) a peneira concluída também é mostrada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig2.jpg"> Figura 2: Representação de imagem passo a passo do uso de peneira Caenorhabditis . (A), a peneira é pre-molhado com uma gota de solução de M9, e (B) se encaixam em cima de um tubo cónico de 50 mL. Tubo superior (C), 1 mL de M9 solução com vermes é pipetada da parte de cima da peneira, (D) um tubo cónico de 50 mL é colocado em cima da peneira com os vermes voltados para dentro do tubo e (E) a peneira com um recém-anexado é rapidamente invertido o Ver. (G) a peneira é enxaguada com M9 transportava os animais desejados para os novo 50 mL tubo e os vermes podem resolver por gravidade para o fundo do tubo. (H) os vermes são pipetados e colocados como gotas num prato fresco de NGM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig3.jpg"> Figura 3: Caenorhabditis peneira não teve impacto motilidade durante toda vida. Esta figura mostra a distribuição de classe de motilidade dos animais nos dias 2, 4, 6 e 8 da maturidade para escolha, FUDR e grupos de tratamento Caenorhabditis peneira. Classe A animais deslocados normalmente e espontaneamente, classe B animais mudou-se anormalmente e podem ter necessário cutucando e classe C animais eram incapazes de se mover. Não houve diferença entre grupos de FUDR, picareta e peneira Caenorhabditis (p > 0,05). Três repetições (n = 10 animais por placa de tratamento) foram conduzidos e analisado com o modelo logístico Ordinal. animais de classe B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig4.jpg"> Figura 4: Uso de Caenorhabditis peneira não teve impacto de bombeamento da faringe durante toda a vida. Esta figura mostra as taxas de bomba da faringe de escolher, FUDR, e grupos de tratamento Caenorhabditis peneira, comparado nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Os asteriscos denotam um significado entre a palheta, peneira e grupos de tratamento FUDR nos dias especificados (* * * p < 0,05). Não houve diferença entre a peneira Caenorhabditis e o grupo de escolha (p > 0,05). Duas repetições (N = 10 animais por placa de tratamento) foram conduzidos e analisados com uma ANOVA One-Way e um pós-teste de Bonferroni. As barras representam a média ± erro padrão da média. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig5.jpg"> Figura 5: Uso de Caenorhabditis peneira não teve impacto toque anterior resposta durante toda vida. Estes painéis mostram (A) anterior e grupos de tratamento (B) a contagem de resposta posterior toque de picareta e FUDR Caenorhabditis peneira comparado nos dias 2, 4, 6 e 8 da vida adulta. Duas repetições foram realizadas com N = 10 para cada grupo de tratamento e comparado com uma ANOVA One-Way e um pós-teste de Bonferroni (p = 0,4 e p = 0,9 para anterior e posterior, respectivamente). As barras representam a média ± erro padrão da média. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig6.jpg"> Figura 6: Caenorhabditis peneira não teve impacto a quantidade de descendência viável no dia 3 de idade adulta. Esta figura mostra a descendência viável de dia-3 adultos após um período de oviposição de 24 h, abrangendo o dia 3 de idade adulta para animais progenitores. As barras representam a média ± erro padrão da média. N = 20-22 animais pelo menos duas repetições biológicas separados por grupo de tratamento. Os grupos de tratamento são comparados com um t-teste, (p > 0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig7.jpg"> Figura 7: Caenorhabditis peneira não afetou translocação nuclear do DAF-16::GFP. Estes painéis mostram imagens representativas de translocação de grupo (A), um choque de calor (controlo positivo), grupo (B) uma picareta (controlo negativo) e o grupo de tratamento (C) um Caenorhabditis peneira DAF-16. (D) os animais no grupo controle positivo exibido uma ativação de translocação nuclear DAF-16. A peneira de Caenorhabditis não induz a uma translocação nuclear e exibido a proteína de fusão citosólica semelhante aos animais no grupo controle negativo. N = 10 animais de cada grupo de tratamento pelo menos três réplicas biológicas separados. Os grupos de tratamento foram comparados com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig8.jpg"> Figura 8: Caenorhabditis peneira não afetou a expressão de hsp16.2::gfp. As expressões de HSP-16.2 (em unidades arbitrárias de fluorescência) de um grupo de choque do calor (controlo positivo), um grupo de escolha (o controle negativo) e um grupo de tratamento Caenorhabditis peneira são comparadas. Os asteriscos denotam uma alta expressão de hsp16.2::gfp para o grupo controle positivo, que foi significativamente diferente dos outros grupos de tratamento (* * * p < 0,05). A peneira de Caenorhabditis não afetou a expressão hsp16.2::gfp e exibido as intensidades de fluorescência semelhantes aos animais no grupo controle negativo (p > 0,05). Realizaram-se três repetições com N = 10 para cada grupo de tratamento e em comparação com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig9.jpg"> Figura 9: Caenorhabditis peneira não afetou a expressão de sod-3::gfp. As expressões de SOD-3 (em unidades arbitrárias de fluorescência) de um grupo de paraquat 100 μM (controlo positivo), um grupo de escolha (o controle negativo) e um grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis são mostradas. Os asteriscos denotam uma alta expressão de sod-3::gfp para o grupo controle positivo, que foi significativamente diferente dos outros grupos (* * * p < 0,05). A peneira de Caenorhabditis não afetou a expressão de sod-3::gfp e exibido as intensidades de fluorescência semelhantes aos animais no grupo controle negativo (p > 0,05). Realizaram-se três repetições com N = 10 para cada grupo de tratamento e em comparação com uma One-Way ANOVA e teste post hoc de Tukey, um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58014/58014fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tamanho de engranzamento</td>
			<td>N = 50</td>
			<td>N = 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 μm</td>
			<td>% de 95 e 33 centavos</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>50 μm</td>
			<td>99,00%</td>
			<td>93.33%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: percentagem do rendimento de malhagens. Esta tabela mostra os resultados de um dispositivo de 20 μm testado com N = 50 adultos para 3 repetições e um dispositivo de 50 μm testado com N = 50 adultos para 2 repetições e com N = 100 para 3 repetições.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tamanho de engranzamento</td>
			<td>Estágio do desenvolvimento</td>
			<td>Diâmetro do corpo</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 μm</td>
			<td>Estágio larval 4</td>
			<td>~ 35 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 μm</td>
			<td>Dia 1 adulto</td>
			<td>~ 70 μm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: diâmetro médio corpo. Esta tabela exibe o diâmetro médio corpo adquirido por uma média de 3 medidas igualmente distribuídas por cada worm para 15 animais em cada fase de vida medido.

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.

Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K visualizações.  University of Alaska Fairbanks. O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genética

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Imunologia e Infecção

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Biologia

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...