Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.

1. produzindo BacMam expressão Baculoviruses
<ol><li>Inserir a sequência de codificação de uma proteína desejada bestrophin mamíferos no pEG BacMam vector18 com uma sequência de reconhecimento de protease tabaco Etch vírus (TEV), seguida por um GFP-10 x sua marca no C-terminal da proteína.</li>
	<li>Transitoriamente, transfect o plasmídeo de expressão em adesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Verifique se a expressão da proteína GFP-fusão sob um microscópio fluorescente com 10 X ou 20 X de ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm (figura 1A). Nota: Baseado em polímero de transfeccao é realizado rotineiramente com 1 μg de DNA de plasmídeo por um prato de 35 milímetros de células HEK293.</li>
	<li>Produzi o baculoviruses em células de inseto Sf9 como descrito anteriormente,16,17. Nota: A passagem 3 (P3) vírus, que serão usado para infectar as células HEK293-F para a produção de proteína, podem ser armazenadas a 4 ° C por 1 mês.</li>
	<li>Determine o título (unidades infecciosas) do vírus P3 pela placa formação ensaio16,17. Nota: Como a proteína de interesse é marcada com as boas práticas agrícolas, um método mais rápido para verificar unidades infecciosas é infectar células Sf9 com diluições em série do vírus e contar o número de células fluorescentes após 48 h.</li>
</ol>2. expressão da proteína
<ol><li>Manter as células HEK293-F em uma cultura de suspensão com o meio de expressão HEK293-F numa incubadora umidificado de 37 ° C, com 8% de CO2. Use frascos de cultura descartável que são 2 - 2,5 vezes maior do que o volume de cultura e giram a cultura em uma plataforma orbital a 135 rpm. Nota: É recomendável para infectar as células quando elas são entre 5 e 30 passagens e para realizar essas ações sob um capuz de cultura de células.</li>
	<li>24 h antes da infecção viral, adicionar 15 μL de Trypan azul para uma alíquota de 15 µ l de cultura de células e verificar a densidade celular e a viabilidade usando um hemocytometer sob um microscópio. Diluir as células de 0,6 x 106 células/mL em frascos de 2 x 2 L cada, com 500 mL de meio de pré aquecida a 37 ° C. Nota: As células mortas são manchadas de azul de Trypan azuis. A viabilidade da célula desejada é > 95%.</li>
	<li>No dia de infecção, verificar a densidade celular e a viabilidade (passo 2.2). Nota: Uma alta viabilidade celular de > 95% é essencial para a expressão eficiente de infecção e proteína. A densidade celular esperado é ~1.0 x 106 células/mL (adulta durante a noite de 2 x 500 mL da 0,6 x cultura de pilha 106 células/mL). O esperado número total de células é ~1.0 x 109.</li>
	<li>Adicione o baculoviruses P3 para as células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Para determinar a quantidade de vírus para inocular, use a seguinte equação: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>Agite as células na plataforma orbital a 135 rpm numa incubadora umidificado 37 ° C, com 8% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Adicionar 10 mM de butirato de sódio à cultura de pilha e continuar incubando por 48 h. Nota: Para algumas proteínas, reduzindo a temperatura de cultura celular para 30 ° C após adição de butirato de sódio pode melhorar a expressão e estabilidade.</li>
	<li>Sob um microscópio de fluorescência com 10x ou 20x ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm, verificar a percentagem e o brilho das células verdes, que representam diretamente o rendimento de proteína (10xHis-bestrophin-GFP) (figura 1B). Nota: A percentagem de células verdes é calculada por: 100 x (células células verdes/Total). Nível de proteína boa expressão é indicada pela forte fluorescência verde sob o microscópio.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. remover o sobrenadante e ressuspender as pelotas de célula com tampão fosfato salino (PBS) até um volume final de ~ 80 mL. Split a suspensão de células nos tubos cônicos de 2 x 50 mL e centrifugar a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. Guarde as pelotas de célula a-80 ° C.</li>
</ol>3. purificação de proteínas
<ol><li>Incube os tubos cónicos contendo as pelotas de células em um banho de água a agitação à temperatura ambiente por 10-15 min, para que eles descongelar. Ressuspender as células em 2 x volume (p/v) reserva um (tabela 1) (por exemplo, 10 g de pellets de célula em 20 mL de tampão) suplementado com inibidores da protease (fluoreto de aprotinina, Leupeptin, Pepstatin A e phenylmethylsulfonyl) em 0.1-1.0 mM. Pipeta sobem e descem extensivamente para obter uma suspensão homogênea.</li>
	<li>Lise as células usando um homogeneizador de alta pressão. Executar a suspensão de células através do homogenizador em 7-10 MPa para um total de 3 - 4 vezes para alcançar a completa homogeneização. Deixe o celular lisado no gelo durante 2-3 minutos entre os rounds.</li>
	<li>Adicione detergente [por exemplo, 2% w/v sol grau n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)] para o lisado celular. Incube com agitação durante 1 h a 20 ° C, para extrair as proteínas de membrana. Nota: O tipo de detergente deve ser otimizado para cada proteína alvo18,24.</li>
	<li>Centrifugar a 150.000 x g em um se a 4 ° C, durante 1 h. Nota: Todas as seguintes etapas são executadas a 4 ° C.</li>
	<li>Recolha o lisado de células claras e fluxo passar uma 5ml sua armadilha Ni2 +- NTA coluna de afinidade previamente incubado com buffer um (tabela 1). Nota: Após centrifugação, a lisado de células claras irão ser imprensada entre um sedimento no fundo e uma camada de nublado em cima. Use uma pipeta de transferência de 10 mL para recolher cuidadosamente a clara lisado e alterne para uma pipeta de 1 mL para o último poucos mililitros de lisado. Evitar a pelota, que pode obstruir a coluna do Ni2 + ; no entanto, uma pequena quantidade de camada superior é fina ou pode ser filtrada com um filtro de 1,5 μm.</li>
	<li>Lavar a coluna com 25 mL de tampão B e, em seguida, 40 mL de tampão C (tabelas 2 e 3, respectivamente). Nota: Este é um bom lugar para fazer uma pausa, como a purificação total pode levar até 12 h e a proteína pode permanecer estável enquanto anexado à coluna durante a noite.</li>
	<li>Unir a coluna para um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida e eluir a proteína da coluna com 13 mL de tampão D (tabela 3) com fracionamento. Recolha as frações enriquecidos com proteína de acordo com a leitura de absorbância UV. Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 1,0 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido de 0,3 MPa e uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Medir a concentração de produto de proteína eluted no espectrofotómetro microvolume. Ler a absorbância em 280 nm.</li>
	<li>(Opcional) Para remover a marca de GFP-10xHis, adicione a protease do PEV na proporção 1:1 em massa e incubar a 4 ° C por 30 min. Nota: A tag pode ou não pode afetar a função ou estrutura do canal purificado. Calcule a quantidade TEV de volume e concentração da proteína coletada de passos 3.7-3.8. Por exemplo, se 10 mL de produto de eluição é coletado e medido em 0,1 mg/mL, a proteína total massa é 10 x 0,1 = 1 mg e 1 mg de TEV será usado para a digestão.</li>
	<li>Concentrar a proteína com uma centrífuga de 15 mL (50 ou 100 kDa) unidade de filtro por fiação a 4.000 x g em 4 ° C, até um volume final de 400-500 μL (para um loop de carregamento de amostra de 2 mL em FPLC). Nota: O tempo de centrifugação para concentração varia de acordo com a concentração e o tamanho da proteína. Para evitar excesso de concentração, que pode causar precipitação de proteínas, girar por 10 min em primeiro lugar, em seguida, observar o volume restante e estimar o tempo para uma rodada subsequente (por exemplo, 2-5 min), e assim por diante, para obter o volume final. Pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro.</li>
	<li>Transferi a proteína concentrada para uma nova 1,5 mL tubo e remover qualquer precipitado ou bolhas do produto concentrado. Rotação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Carrega o produto final com uma seringa de 1 mL e uma agulha de ponta redonda em um sistema FPLC para cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna de tamanho-exclusão previamente incubada com buffer E (tabela 5). Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 0,5 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido para 2,50 MPa, um volume de fluxo definido para 30 mL de tampão E (tabela 5), e uma taxa de fluxo definido como 0,5 mL/min.</li>
	<li>Observe que proteínas bem-comportado executar como um único pico (Figura 2A) e recolher a fraction(s) proteína correspondente a esse pico (Figura 2A).</li>
	<li>Concentre a proteína com uma unidade de filtro centrífugo 4 mL ou 0,5 mL (de mesmo peso molecular recorte como na etapa 3.10) e girar a 4.000 x g a 4 ° C, a uma concentração final de 5-10 μg/μL. Use o espectrofotômetro para verificar a concentração do produto final (etapa 3.8). Nota: O tempo de centrifugação varia, conforme o volume de produto final pode ser diferente entre ensaios de purificação. Normalmente, a centrifugação leva 10-20 min. Recomenda-se a pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro.</li>
	<li>Transferi a proteína concentrada para um novo tubo de 1,5 mL. Remover qualquer precipitado por centrifugação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Faça 10 alíquotas μL para armazenamento a-80 ° C e salve um 2-5 μL pequena parte alíquota para executar em um gel de SDS-PAGE 4-15% gradiente em 9 V/cm (Figura 2B).</li>
	<li>Confirme a identidade da proteína purificada por espectrometria de massa8. Nota: Análise In vitro da função e estrutura da proteína purificada podem ser realizadas através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um pipeline útil para expressão e purificação dos canais de íon bestrophin mamíferos deve ser usado para análises futuras em vitro . Enquanto o dispositivo FPLC é necessário para a cromatografia de exclusão de tamanho, uma bomba de seringa é suficiente para todas as etapas da cromatografia de afinidade, incluindo vinculação, lavagem e eluição. Ao usar uma bomba de seringa para soluções de impulso (em uma seringa) através de uma coluna, é essencial a subjacência de lado para evitar empurrando as bolhas de ar na coluna de primavera. Se a pureza da proteína após cromatografia de afinidade já é suficiente para os experimentos subsequentes, cromatografia de exclusão de tamanho pode ser omitida para que um dispositivo FPLC não pode ser exigido em tudo.
Como demora cerca de 2 semanas para fazer o baculoviruses de pBacMam de plasmídeos, para aumentar a eficiência, uma tela inicial para homologs bem-comportado de proteína pode ser realizada pela colheita das células HEK293 transitoriamente transfectadas (ex., de um prato de 60 mm) e testes como o expresso da proteína de interesse (GFP-etiquetado) se comporta em detergentes (por exemplo, DDM) com fluorescência-deteção tamanho-exclusão cromatografia (FSEC)18,24. É mais produtivo concentrar-se nas construções de proteína que exibem forte fluorescência em transfectadas células HEK293 e boa monodispersity e estabilidade no FSEC.
Existem várias recomendações para aumentar o rendimento de purificação de proteínas. Em primeiro lugar, as condições para a digestão do PEV podem precisar de ser otimizado para cada proteína. Isso pode ser feito por testes de uma variação da proporção de massa de proteína-para-PEV (por exemplo, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 e 01:10) e incubando vezes (por exemplo, 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 h e durante a noite). Em seguida, sugere-se para executar que as amostras tratadas em um SDS-PAGE gel para verificar a eficiência de clivagem. Além disso, é importante não deixar qualquer fuga de líquido sobrenadante ou eluente centrífuga fora as ligações na FPLC ou seringas. Da mesma forma, é importante evitar bolhas quando Pipetar a proteína concentrada.
Vários subsequentes em vitro análise os procedimentos que utilizam as proteínas do presente protocolo incluem bicapa lipídica, cristalografia de raios x, crio-microscopia, espectroscopia e alto throughput screening8,25 , 26.

Bestrophins é uma família de canais iônicos conservada através da espécie, variando de bactérias a seres humanos1. Em humanos, o gene BEST1 , localizado no cromossoma 11q12.3, codifica a proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expressa predominantemente na membrana basolateral das células do epitélio (RPE) pigmento da retina dos olhos2,3 ,4. Composto de 585 aminoácidos, o primeiro ~ 350 dos quais são altamente conservadas entre as espécies e conter sua região transmembrana, BEST1 atua como um CaCC em seres humanos1,5,6. Além disso, os BEST1 homologs em galinhas Klebsiella pneumoniae ambos funcionam como homopentamers7,8, sugerindo um alto nível de conservação ao longo da evolução.
Nos seres humanos, mais de 200 mutações no gene BEST1 clinicamente têm sido associadas a um grupo de doenças de degeneração da retina chamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicos têm sido relatados, incluindo doença melhor, distrofia vitelliform adulto-início, autossômica dominante vitreoretinochoroidopathy, autossômica recessiva bestrophinopathy e retinite pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Estas doenças, que levam a diminuição da acuidade visual e até mesmo cegueira, são atualmente incurável. A fim de desenvolver tratamentos terapêuticos e medicina potencialmente personalizada, é de fundamental importância compreender como essas mutações causam doenças de BEST1 influenciam a função e a estrutura do BEST1 canal15. Para estes fins, os pesquisadores precisam obter canais bestrophin purificado (tipo selvagem e/ou mutante) e conduta em vitro análises5,8.
O primeiro passo fundamental é a expressão de canais de bestrophin de espécies superiores em células de mamíferos. Como transdução de baculovirus de células HEK293-F (sistema BacMam) é um método poderoso para heterologously express de16,de proteínas de membrana17, este protocolo utiliza um vetor de BacMam (pEG BacMam) otimizado para expressão robusta do alvo da proteína18, que neste caso é um homólogo de mamíferos bestrophin. Este vetor tem sido usado para a expressão de várias proteínas de membrana, incluindo G-receptores, receptores nucleares e outros canais de íon18. Há também evidências de que as proteínas produzidas são apropriadas para cristalografia18. Com altos níveis de expressão em células HEK293-F, as proteínas podem então ser purificadas usando cromatografia; especificamente, no caso de bestrophins, tanto a afinidade e a cromatografia de exclusão de tamanho podem ser usados.
Uma vez que este protocolo é aperfeiçoá-lo para um canal de bestrophin, a proteína purificada pode ser analisada para sua função e estrutura através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8. No total, essas técnicas fornecem um poderoso pipeline para investigações funcionais e estruturais de bestrophins e outros canais de íon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC327265000&#160;</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC446212500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC301870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC197530010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA4058704&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ63039MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ61188MB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ20037MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC215740050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM sol-grade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM anagrade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10902179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12338018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pressure homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;">Emulsiflex-C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td>17-5248-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex-200 column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AKTA Pure</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-15 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-4 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC810024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-0.5 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC505024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN precast gel</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PolyJet transfection reagent</td>
			<td style="width:148px;">SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEG BacMam vector</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of mammalian bestrophin ion channels

O genoma humano codifica quatro paralogs de bestrophin, nomeadamente BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificada pelo gene BEST1 , é um Ca2 +-ativado Cl– canal (CaCC) predominantemente expressado no epitélio pigmentar da retina (RPE). O significado fisiológico e patológico de BEST1 é realçado pelo fato de que mais de 200 mutações diferentes no gene BEST1 foram geneticamente ligadas a um espectro de pelo menos cinco doenças degenerativas da retina, como a melhor vitelliform Distrofia macular (doença melhor). Portanto, compreendendo a biofísica dos canais bestrophin no nível do único-molécula tem enorme significado. No entanto, obtenção de canais iônicos de mamíferos purificada é muitas vezes uma tarefa desafiadora. Aqui, nós relatamos um protocolo para a expressão de proteínas de mamíferos bestrophin com o sistema de transferência do gene de baculovirus BacMam e sua purificação por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purified têm o potencial para ser utilizado em posteriores análises funcionais e estruturais, tais como gravação eletrofisiológica no bilayers do lipid e Cristalografia. Importante, este gasoduto pode ser adaptado para estudar as funções e estruturas de outros canais iônicos.

A intensidade de fluorescência em transitoriamente transfectadas adesivas células HEK293 (figura 1A) é um bom indicador para o nível de expressão de proteínas projetadas em células HEK293-F de suspensão (figura 1B). Se a proteína do alvo não for bem expressa ou mis está localizada em células HEK293 depois de transfecção transiente, é aconselhável considerar modificando o conceito de expressão (EG., mudando a posição da marca de GFP ou fazendo mutações/truncamentos sobre a proteína do alvo). Pequenas culturas de suspensão HEK293-F (por exemplo, culturas de 25 mL) são usadas para otimizar as condições para a expressão da proteína, entre os quais a infecção MOI e temperatura de cultivo têm sido o mais importante em experiências anteriores.
Uma bem sucedida purificação é indicada por um único pico principal no volume de eluição esperado em cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2A) e uma única banda dominante em um gel de SDS-PAGE desnaturado (Figura 2B). Se vários picos aparecem na cromatografia de exclusão de tamanho, é importante coletar cada pico e executar um gel nativo para determinar qual pico contém o canal funcional pentamers. Note-se que entre duas construções de proteína, o nível de expressão, indicado pela intensidade de fluorescência no momento da colheita, não nesessarily correlacionar com o rendimento final, cada construção de proteínas se comporte de forma diferente durante a purificação. Uma proteína de bestrophin bem comportados, 200-500 µ g do produto final purificado normalmente podem ser obtidos de 1 L de células de suspensão HEK293-F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57832/57832fig1.jpg"> Figura 1: expressão de uma proteína de mamíferos bestrophin. Imagens microscópicas de um bestrophin de mamíferos GFP-etiquetado expressaram nas células (A) adesivo HEK293 por transfeccao Plasmideo e em (B) suspensão HEK293F células por infecção de baculovirus. Esquerda = fluorescência verde; direita = brilhante-campo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57832/57832fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57832/57832fig2.jpg"> Figura 2: purificação de uma proteína de mamíferos bestrophin. (A) afinidade-purified proteínas GFP-etiquetado funcionou em uma coluna de gel filtração de exclusão de tamanho, como um pico principal. Foram coletadas frações entre linhas tracejadas. (B) produto de proteína final correu em um gel de SDS-PAGE com escadas (coluna esquerda). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57832/57832fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>MW</td>
			<td>Quantidade por 1 L</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238,3</td>
			<td>11,9 g</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>g 17,529</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazol</td>
			<td>68,1</td>
			<td>g 1,3616</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>203</td>
			<td>g 0,20331</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris(2-carboxyethyl) fosfina</td>
			<td>287.</td>
			<td>2,5 mL caldo de 200 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Purificação da proteína de Buffer (Buffer de ressuspensão)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>MW</td>
			<td>Quantidade por 1 L</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238,3</td>
			<td>11,9 g</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>g 17,529</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazol</td>
			<td>68,1</td>
			<td>g 2,7232</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>203</td>
			<td>g 1,01655</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris(2-carboxyethyl) fosfina</td>
			<td>287.</td>
			<td>0,5 mL caldo de 200 mM</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0,5 g</td>
			<td>0,05% (p/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Buffer de purificação de proteínas B (primeiro lavar Buffer)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>MW</td>
			<td>Quantidade por 1 L</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238,3</td>
			<td>g 5,95</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>29,2 g</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazol</td>
			<td>68,1</td>
			<td>5,1 g</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris(2-carboxyethyl) fosfina</td>
			<td>287.</td>
			<td>0,5 mL caldo de 200 mM</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0,5 g</td>
			<td>0,05% (p/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Buffer de purificação da proteína C (segundo lavar Buffer)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>MW</td>
			<td>Quantidade por 1 L</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238,3</td>
			<td>7,74 g</td>
			<td>32,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>g 11,686</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>92.09</td>
			<td>25 mL</td>
			<td>2,5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazol</td>
			<td>68,1</td>
			<td>17,02 g</td>
			<td>250 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris(2-carboxyethyl) fosfina</td>
			<td>287.</td>
			<td>0,5 mL caldo de 200 mM</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0,5 g</td>
			<td>0,05% (p/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Buffer de purificação de proteínas D (tampão de eluição)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>MW</td>
			<td>Quantidade por 1 L</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238,3</td>
			<td>9,53 g</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>g 11,686</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris(2-carboxyethyl) fosfina</td>
			<td>287.</td>
			<td>0,5 mL caldo de 200 mM</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0,5 g</td>
			<td>0,05% (p/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: Buffer de purificação da proteína E (Gel filtração Buffer)

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Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.3K visualizações.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Vídeo: Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...