Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na barreira de exames de sangue dos campos de biologia sobre candidatos a genes, vírus ou toxinas ambientais que podem afetar a função ou integridade da barreira do exame de sangue. Três dias antes da cirurgia, trate pelo menos três camundongos machos C57Black/6 de oito semanas diariamente com um cloreto de cádmio de peso corporal de cinco miligramas por quilograma por injeção intraperitoneal. No dia da cirurgia, coloque um tecido limpo sobre uma área cirúrgica esterilizada com etanol de 75% e coloque um aquecedor termostático a 37 graus Celsius.
Coloque um rato anestesiado no tecido e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo. Raspe o cabelo abdominal com uma máquina de barbear e desinfete a pele exposta com 75% de etanol. Faça uma incisão de pele de um centímetro acima das glândulas pré-procriais para expor a parede abdominal, e use pequenos fórceps para levantar a pele para fazer uma incisão de 0,5 centímetros no peritônio.
Use os fórceps para procurar almofadas de gordura ao redor do epidídis e testis, puxando cuidadosamente as almofadas de gordura para fora para expor um testis anexado. Coloque um pedaço de papel de nove centímetros sob as almofadas de gordura e testis, e carregue uma pipeta de microinjeção com solução inulina-FITC recém-preparada. Conecte a pipeta a uma unidade de micromanipulador e use um microscópio de dissecação para inserir suavemente a ponta de pipeta de microinjeção sob a tunica albuginea.
Gire lentamente a alavanca de operação para entregar 20 microlitadores da inulina-FITC no interstício do testífico. Se a entrega for bem sucedida, o testis vai virar uma cor verde-amarela brilhante. Retorne imediatamente o testío à cavidade abdominal, e injete o testífero contralateral com 20 microliters de PBS, depois feche a pele com uma sutura cirúrgica.
E coloque o mouse na almofada de calor de um aquecedor termostático. 40 minutos após a injeção, use uma tesoura afiada para coletar os testículos de cada rato e lave os tecidos em um mililitro de PBS gelado. Em seguida, fixar os testículos em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas seguido por três lavagens em 1,5 mililitros de 1%PBS por lavagem.
Após 30% de desidratação de sacarose durante a noite, transfira as amostras para quadros individuais de incorporação e cubra os tecidos com o composto de temperatura de corte ideal. Defina a temperatura de um criostat para 20 graus Celsius negativos e coloque os quadros no criostat por cerca de 10 minutos até que o OCT esteja congelado. Em seguida, encha cada quadro de incorporação com OCT fresco até que todo o testis esteja coberto em cada molde.
Quando a segunda camada de OCT tiver congelado, adquira uma seção transversal de cinco micrômetros de espessura de cada testímetro, capturando as seções teciduais em lâminas de microscópio de vidro à medida que são obtidas. Para a imagem das amostras, primeiro aqueça os slides em uma caixa umidificada à temperatura ambiente. Após 10 minutos, lave os slides três vezes em soro fisiológico fresco com tampo tris por lavagem e deixe as seções secarem por cinco minutos protegidas da luz.
Use papel sem poeira para remover qualquer solução salina residual e monte as amostras com meio de montagem suplementado pelo DAPI. Em seguida, cubra cada amostra com um deslizamento de cobertura invertido e imagem as amostras sob o objetivo de 20X de um microscópio confocal. Três dias de tratamento de cloreto de cádmio causam danos à barreira de exames de sangue permitindo a difusão da inulina-FITC do compartimento basal para o compartimento apical do epitélio seminiferous.
Em contraste, essa difusão é bloqueada no controle de testículos tratados com PBS. A extensão do dano da barreira do exame de sangue é determinada pelo cálculo da razão da distância da difusão inulina-FITC ao raio do mesmo túbulo seminifero. Além disso, a barreira intacta de exames de sangue no rictor heterozigosto blocou a difusão de inulina através da barreira no compartimento apical, enquanto os camundongos rictor condicional possuem uma barreira de exames de sangue comprometida que permite a difusão de inulina.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de entregar inulina-FITC preparada no dia do experimento e manter o tecido protegido da luz, já que o FITC é uma molécula sensível à luz. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da espermatogênese prejudicada porque a função da barreira do exame de sangue é fornecer um microambiente imunoprivilegiado para a conclusão da meiose na espermatogênese. Após seu desenvolvimento, essa técnica fornece uma forma de pesquisadores do campo da medicina reprodutiva explorarem a subfertilidade e a infertilidade em camundongos.
Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeíddedes pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de roupas e máscaras faciais devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.
