Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella barriera ematico-testicolo dei campi di biologia su candidati genici, virus o tossine ambientali che possono influenzare la funzione o l'integrità della barriera ematico-testicolare. Tre giorni prima dell'intervento, trattare almeno tre topi maschi C57Black/6 di otto settimane al giorno con un cloruro di cadmio di peso corporeo di cinque milligrammi per chilogrammo tramite iniezione intraperitoneale. Il giorno dell'intervento, posizionare un tessuto pulito su un'area chirurgica sterilizzata con etanolo al 75% e impostare un riscaldatore termostatico a 37 gradi Celsius.
Posizionare un topo anestetizzato sul tessuto, quindi confermare una mancanza di risposta al dito del piedino. Radere i capelli addominali con un rasoio e disinfettare la pelle esposta con il 75% di etanolo. Fai un'incisione cutanea di un centimetro sopra le ghiandole preponiali per esporre la parete addominale e usa piccole forcep per sollevare la pelle per fare un'incisione di 0,5 centimetri nel peritoneo.
Usa le forcep per cercare cuscinetti di grasso intorno all'epididimo e al testicolo, tirando accuratamente fuori i cuscinetti di grasso per esporre un testicolo attaccato. Posizionare un pezzo di carta di nove centimetri sotto i cuscinetti di grasso e il testicolo e caricare una pipetta di microiniezione con soluzione inulina-FITC preparata al momento. Collegare la pipetta a un'unità micromanipolatore e utilizzare un microscopio sezionante per inserire delicatamente la punta della pipetta di microiniezione sotto l'albuginea tunica.
Ruotare lentamente la leva operativa per fornire 20 microlitri dell'inulina-FITC nell'interstizio del testicolo. Se la consegna ha esito positivo, il testicolo diventerà un colore verde-giallo brillante. Riportare immediatamente il testicolo alla cavità addominale e iniettare il testicolo contralaterale con 20 microlitri di PBS, quindi chiudere la pelle con una sutura chirurgica.
E posizionare il mouse sul riscaldatore di un riscaldatore termostatico. 40 minuti dopo l'iniezione, utilizzare forbici affilate per raccogliere i teste da ogni topo e lavare i tessuti in un millilitro di PBS ghiacciato. Successivamente, fissare i tester in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per 12-24 ore, seguiti da tre lavaggi in 1,5 millilitri dell'1%PBS per lavaggio.
Dopo la disidratazione del saccarosio al 30% durante la notte, trasferire i campioni in singoli telai di incorporamento e coprire i tessuti con un composto ottimale della temperatura di taglio. Impostare la temperatura di un criostato su -20 gradi Celsius e posizionare i fotogrammi nel criostato per circa 10 minuti fino a quando lo Strumento di personalizzazione di Office non viene congelato. Quindi, riempire ogni telaio di incorporamento con oct fresco fino a quando l'intero testicolo non è coperto in ogni stampo.
Quando il secondo strato di OCT si è congelato, acquisire sezioni trasversali spesse cinque micrometri di ogni testicolo, catturando le sezioni di tessuto su vetrini al microscopio di vetro man mano che si ottengono. Per immagini i campioni, riscaldare prima le diapositive in una scatola umidificata a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, lavare gli scivoli tre volte in soluzione salina tris-tamponata fresca per lavaggio e lasciare asciugare le sezioni per cinque minuti protette dalla luce.
Utilizzare carta priva di polvere per rimuovere qualsiasi salina residua e montare i campioni con un supporto di montaggio integrato da DAPI. Quindi, coprire ogni campione con uno slittamento di copertura invertito e immagini i campioni sotto l'obiettivo 20X di un microscopio confocale. Tre giorni di trattamento con cloruro di cadmio causano danni alla barriera ematico-testicolo permettendo la diffusione inulina-FITC dal compartimento basale al compartimento apicale dell'epitelio seminifero.
Al contrario, questa diffusione è bloccata nei tester trattati con PBS di controllo. L'entità del danno barriera ematico-testicolo è determinata calcolando il rapporto tra la distanza di diffusione inulina-FITC e il raggio dello stesso tubulo seminifero. Inoltre, la barriera intatta tra i testicoli del sangue nei topi knockout floxed Rictor eterozigoti blocca la diffusione dell'inulina attraverso la barriera nel compartimento apicale, mentre i topi knockout Rictor condizionali possiedono una barriera emato-testicola compromessa che consente la diffusione dell'inulina.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fornire inulina-FITC preparata il giorno dell'esperimento e di mantenere il tessuto protetto dalla luce poiché FITC è una molecola sensibile alla luce. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della spermatogenesi compromessa perché la funzione della barriera ematico-testicolare è fornire un microambiente immune-privilegiato per il completamento della meiosi nella spermatogenesi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica fornisce un modo per i ricercatori nel campo della medicina riproduttiva di esplorare la subfertilità e l'infertilità nei topi.
Non dimenticare che lavorare con le paraformaldeidi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare indumenti e maschere facciali dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
