Trabalho de laboratório autores tem sido apoiada pela USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) e Alberta Inova - Health Solutions.

PARTE A. transplante de células germinativas em camundongos 1. Preparação de camundongos de destinatário <ol><li> Destinatários deve ser imunologicamente tolerante (quer seja geneticamente combinados a doadores ou imuno-deficientes) para as células testiculares dos doadores. </li><li> Destinatários deve ser ou naturalmente desprovido de espermatogênese (por exemplo, W / W v camundongos) ou empobrecido de células germinais endógenas. Depleção de células Germ pode ser alcançado por irradiação ou drogas quimioterápicas, tais como O busulfan. Neste protocolo, descrevemos o método de preparação de ratos receptores com busulfan. </li><li> Trate os destinatários em 4-6 semanas de idade através da injeção ip de busulfan. A dose óptima de O busulfan é a estirpe dependente. Em cepas de destinatário comumente usados, uma dose de 40-50 mg / kg é suficiente para empobrecem células germinativas endógena (por exemplo, 44 ​​mg / kg para ratinhos nus, 50 mg / kg para B6/129 destinatários F1). </li><li> Dissolver O busulfan em pó em DMSO e em seguida, adicionar um volume igual de t de água destilada estérilÓ, façam uma concentração final de 4 mg / ml. Mantenha solução quente a 35-40 ° C antes de usar para evitar a precipitação dos O busulfan. Eliminar a solução que se precipitação é observado. </li><li> Após o tratamento O busulfan, permitir que, pelo menos, um mês antes de usar destinatários. Os destinatários podem ser utilizadas entre 1 mês e 3 meses pós-tratamento com busulfan. </li></ol> 2. Preparação de pipetas de microinjecção <ol><li> Escolha pipetas de vidro de borosilicato (tubos capilares) com um diâmetro 1,0 milímetros exterior, uma 0,75 mm de diâmetro interior, e um comprimento de 3 polegadas. </li><li> Siliconize pipetas de vidro com Sigmacote, enxaguar pipetas com metanol e secar com ar. </li><li> Puxe as pipetas usando um extrator da pipeta. Máquinas diferentes extratores da pipeta ter configurações diferentes, portanto, testar algumas configurações. Geralmente, uma configuração semelhante ao utilizado para a tomada de pipetas de enucleação pode trabalhar. </li><li> Quebre os pontas de pipeta sob microscópio de dissecação antes de usar para alcançar um diâmetro de aproximadamente 50 iMna ponta. </li></ol> 3. Preparação de células do doador para o transplante <ol><li> Choise da estirpe doador é dependente sobre a questão experimental estudada. Se quantificação da espermatogênese é usado como ponto de extremidade, o uso de doadores com um marcador facilmente identificável genética, tais como Lac-Z (por exemplo, B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J a partir de Jackson Laboratory) ou GFP (por exemplo, C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J a partir de Jackson Laboratory). </li><li> Prepare a 7 ml de colagenase em DMEM menos 1 mg / ml, 4 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina acrescido de 1 mM de EDTA), e 2 ml de DNase em DMEM às 7 mg / ml. Este montante é para digerir 2 testículos camundongo doador. </li><li> Coletar assepticamente testículos e remover a túnica albugínea. Spread túbulos seminíferos delicadamente com uma pinça fina para facilitar a digestão enzimática. </li><li> Túbulos de transferência em colagenase, incubar a 37 ° C durante 5-10 min, e agitar freqüentemente. </li><li> Lave túbulos duas vezes por fiação (200-300 g para 3 min) e re-que suspende em PBS w / o Ca 2 + + </sup&gt;. </li><li> Re-suspender túbulos em tripsina-EDTA e agitar até que se torne pegajoso e nublado. Monitore a digestão de túbulos a 37 ° C como que ela deverá ocorrer no prazo de 1-2 min. </li><li> Adicionar DNase e agite bem. Incubar durante 1-2 min. </li><li> Adicionar 3 ml de FBS para parar a ação de enzimas. </li><li> Suspensão de células filtro usando uma malha de nylon com 40-70 mM tamanho dos poros para remover células / tecido pedaços. </li><li> Coletar as células a 600 g para 5 min e re-suspender as células em uma pequena quantidade de DMEM (&lt;uL 100). </li><li> Contar as células e ajustar o volume para uma concentração final desejada (geralmente 100 x 10 6). Mantenha suspensão de células em gelo antes de usar. </li><li> Cada testículo O busulfan-tratados de mouse será preenchido com apenas 10-15 uL de suspensão de células. Devido ao potencial de desperdício e perdas, ter por objectivo a 30-50 ul por testículo. </li></ol> 4. Transplante de procedimento (Figura 1) <ol><li> Anestesiar os destinatários seguintes protocolos aprovados. </li><li> Coloque em decúbito dorsaldecúbito e cirurgicamente preparar a área abdominal. Faça um ~ 1 centímetro incisão na linha média abdominal para expor a parede abdominal. Levante parede abdominal pelo uso de fórceps pequenas no ponto de a linha branca para evitar que acidentalmente ferindo órgãos abdominais, e proceder para fazer uma ~ incisão centímetros 0,5 menos da linha mediana da parede abdominal para expor a cavidade peritoneal. </li><li> Use uma pinça íris para segurar a parede abdominal, e usar outro par de fórceps íris para procurar as bolsas de gordura ligados ao epidídimo e do testículo na cavidade peritoneal. Puxe delicadamente a almofada de gordura até que o testículo é exteriorizado e da artéria testicular e epidídimo são claramente visíveis. Os trabalhos sobre um testículo em um tempo. </li><li> Coloque uma cortina fina estéril feita a partir de cartões de índice autoclavados debaixo da almofada de gordura / testículos para melhor identificação visual (opcional). A cortina também trabalha para absorver o líquido. </li><li> Adicionar uma gota de Trypan corante Azul em a suspensão de células e, cuidadosamente, carregar o suspensão de células para o polyethytubagem de lene conectado a uma seringa de 1 ml. Anexar a pipeta puxado para dentro da tubulação e gentilmente forçar a suspensão de células para a pipeta através da aplicação de pressão para a seringa. </li><li> Identificar os ductos eferentes (que liga o testículo ao epidídimo) e remova cuidadosamente tecido adiposo ao redor dos ductos. Trabalhe com cuidado, as condutas e da membrana ao redor deles são translúcidas. </li><li> Insira com cuidado a pipeta em um duto no feixe dos dutos eferentes, gentilmente enrosque poucos milímetros em direção ao testículo. </li><li> Evitando ao mesmo tempo movendo o pipeta de injeção, o alcance para a seringa, suavemente deprimir o êmbolo da seringa para garantir que a suspensão flui para o rete testis e nos túbulos seminíferos começam a encher. </li><li> A taxa de injecção e de fluxo de suspensão de células é regulada por pressão do dedo polegar. Evitar o aumento súbito da pressão; monitorar o movimento de suspensão de túbulos. </li><li> Pare a injeção quando quase todos os túbulos de superfície foram preenchidos antes do testículo começa a become isquêmica. </li><li> Retorne o testículo para a cavidade abdominal. Repita o procedimento com o testículo contralateral. Suture a parede abdominal com 6-0 de sutura de seda e feche a pele com clips de feridas de metal. Monitorar camundongos em uma almofada de aquecimento até a recuperação completa. </li></ol> 5. Análise dos testículos de destinatário <ol><li> Permitir que de 2-4 meses após o transplante antes da análise. </li><li> Euthanize o mouse destinatário de acordo com o cuidado com os animais e as diretrizes de uso e recolher o testículo e epidídimo em PBS. Quando um Lac-Z estirpe doador transgênico tem sido utilizado, o epidídimo pode ser usado como um controle de coloração positiva como ele tem atividade beta-galactosidase endógena. </li><li> Para a detecção de células do doador por Lac-Z de coloração, resolver o problema o testículo para 1-2 horas a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Enxágüe 3 x 30 min à temperatura ambiente em lacZ enxaguar buffer. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C em lacZ solução de coloração. Testículo pode ser manchado como um todo ou depois de dispersantedos túbulos. </li><li> Corrigir e armazenar em 10% formalina tamponada neutra. Se seções são necessários usar o vermelho neutro rápido como contra-mancha. </li></ol> PARTE B. ectópica xeno em camundongos (De Dobrinski e Rathi 2008 15, e Rodriguez-Sosa et al. 2011 16). 1. Coleta de tecido de um doador <ol><li> Obter o tecido testículo por castração ou biópsia a partir de um do sexo masculino doador. </li><li> Testículo Coloque em PBS ou biópsias em meio de cultura, mantendo condições estéreis. </li><li> Mantenha o tecido coletadas em gelo e transporte para o laboratório. </li></ol> 2. Preparação de tecido do doador <ol><li> Realiza-se em o capô de cultura de tecido para manter a esterilidade. </li><li> Lave cada testículo em antibióticos gelo-frios PBS contendo duas a três vezes antes de transferir o em uma cultura-prato com PBS. No caso de biópsias, lave fragmentos de testículo duas a três vezes com gelo-frio Medi culturauhm contendo antibióticos por girando em 150g para 2 min e ressuspensão em meio de cultura fresco gelo-frio. </li><li> Para testículos intactos, remova túnica vaginal por fazer uma incisão ao longo da superfície e extrudar os testículo. Retire do testículo todas as estruturas Anexo (cordão espermático, epidídimo, o tecido conjuntivo). Lave testículos uma vez em PBS frio e transferência em uma cultura-prato com PBS. </li><li> Cuidadosamente remova a túnica albugínea do testículo usando uma lâmina de bisturi e um par de tesouras. Se o testículo é muito pequena, da túnica pode ser removido por espremendo o tecido testicular para fora da túnica através de uma pequena incisão feita em uma extremidade enquanto segura a túnica com um par de fórceps pequenas sobre a outra extremidade. </li><li> Dependendo do tamanho do testículo, quer o tecido testículo todo pode ser cortado em pequenos pedaços de em torno de 1 - 2 mm 3 em tamanho usando fórceps curvadas e uma lâmina de bisturi, ou de peças a grandes do tecido do testículo pode primeiro ser removidos a partir do testículo e, em seguida, cortadas em pequenospeças. Tudo isto deveria ser feito em gelo-frio meio de cultura e sob condições estéreis em um prato de cultura pequena (60 x15 mm). </li><li> Transfira os fragmentos de tecido preparadas para o gelo-frio meio de cultura em pequenas culture-pratos em gelo até enxertia. </li></ol> 3. Castração de destinatário do mouse <ol><li> Anestesie do mouse como acima e preparar campo cirúrgico estéril por de grampeamento o cabelo (não é necessário em ratinhos nus), limpando-o com Etanol 70% e solução de Betadine. </li><li> Faça um 0,5 -1 centímetros incisão da pele ventral linha mediana para expor a parede abdominal. </li><li> Cuidadosamente expor o testículo, a artéria testicular e epidídimo tal como descrito no ParteA, 4,2-4,3. </li><li> Retire a cauda da epididime do gubernáculo por dissecção romba. </li><li> Ligadura a artéria testicular, e os ducto deferente de rato juntamente com o vaso sanguíneo com seda, e secção as estruturas com ligadura através do corte entre o testículo e a ligadura. </li><li> Repita o procedimento para o secotestículo ª. </li><li> Suture a parede abdominal com um ou dois pontos cirúrgicos. </li><li> Feche a incisão da pele com um ou dois clips de Michel. </li></ol> 4. Ectópica xeno <ol><li> Posicione o mouse em decúbito ventral e preparar um campo cirúrgico estéril em sua parte traseira como acima. </li><li> Dependendo de quantos enxertos são para ser inserido (geralmente 4-8/mouse), fazer do ~ 0,5 cm incisões na pele longos em cada lado da linha de meados de parte de trás do mouse. </li><li> Use uma pinça para segurar uma borda da incisão na pele, e faça uma cavidade subcutânea por provocando além do tecido conjuntivo com uma tesoura. </li><li> Usando um íris o local de fórceps um pedaço de testículo profunda do tecido para dentro da cavidade subcutânea, segurando a borda da incisão da pele com um outro fórceps íris. </li><li> Feche a incisão na pele com um clipe de Michel e manter o mouse sobre almofada de aquecimento até que ele começa a se recuperar da anestesia. </li><li> Transfira o mouse para uma gaiola com isolamento adicional e cover e monitor até que os ratos são totalmente recuperado. </li></ol> 5. Recolha de xenoenxertos testículos para análise e colheita de esperma <ol><li> Euthanize o mouse host de acordo com cuidados com os animais e as diretrizes de uso, e fazer uma incisão na pele na linha média sobre a pele running back da cauda para o pescoço e pele aberta. Isto expõe os enxertos quais podem ser localizadas, quer por o tecido subcutâneo ou anexado para a pele. </li><li> Retire cuidadosamente os enxertos com uma pinça par e um par de tesouras. </li><li> Número recorde de tamanho enxertos recuperados, e peso de enxertos individuais. </li><li> Recuperar as vesículas seminais do abdome do rato e registar o seu peso como um indicador da produção de testosterona pelo tecido enxertado. </li><li> Para análise histológica <ol class="lalpha"><li> Suspender xenoenxertos em frasco para injectáveis ​​amostra contendo solução de Bouin (ou fixador de outro) em um volume ~~~V 10x que a do xenoenxerto, e frasco para injectáveis ​​rótulo de forma apropriada. </li><li> Incubarnoite para o dia na geladeira seguida por lavagem pelo menos 3 vezes em etanol 70% em intervalos de 24 horas de preferência. </li><li> Prossiga para o processamento e inclusão em parafina. </li></ol></li><li> Para a colheita de esperma <ol class="lalpha"><li> Lave xenoenxertos por fiação-los para baixo, para 300g para 1 min e de ressuspender-los em meio de cultura contendo antibióticos. </li><li> Cortar enxertos em pedaços pequenos e mince cuidadosamente com o fórceps em um prato de cultura de tecido contendo 3 - 5 ml de meio de cultura. </li><li> Tecido picada filtro através do filtro da célula 40 mM. </li></ol></li></ol> PARTE resultados representativos C. 1. Gérmen de transplante de células Se a suspensão de células transplantado doador contém células-tronco espermatogónias que transportem um marcador genético, tais como o transgene LacZ, a colonização do SSCs doadoras em que o testículo de destinatário pode ser visualizada por X-gal coloração como distintivos segmentos azuis do MEViniferous túbulos após 2-3 meses pós-transplante de 3 (Figura 2A). Uma colônia bem-estabelecida deve ter um trecho escuro de longo azul de segmentos de completamente cheios com duas ou mais camadas de células azuis mais estreitas para o centro, e as regiões coradas relativamente mais fracas em ambas as extremidades onde uma rede de único, emparelhado ou pequenos grupos de células azuis é aparente 3 (Figura 2B). A seção transversal do escuro região túbulo seminífero azul deveria revelar bem estabelecida e bem organizada espermatogênese com células germinativas azuis em vários estágios de diferenciação (Figura 2C). 2. Testículo tecido xeno A viabilidade do tecido testicular após o transplante é inversamente correlacionado com o estágio de desenvolvimento do doador, o melhor resultado é obtido quando o tecido de machos recém-nascidos é usado, enquanto o tecido adulto mostra uma tendência de alta para se degeneram e morrem 17-21. Geralmente, o sucesso xenoenxerto diminui à medida que tecido do doador sofre-meiosis da primeira onda da espermatogênese. Tempo para a pleno desenvolvimento de tecido do doador imaturo e espermatogênese completo é específico da espécie, e muitas vezes um pouco mais curto em comparação com testículos em situ. O número de túbulos seminíferos com espermatogênese completo é variável conforme a espécie. Enquanto em ovinos, caprinos e suínos esse número é maior do que 50%, em bovinos e gatos ela é menos do que 15% 14 (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" /> Figura 1. Germ procedimento de transplante de células. Coloque destinatários em decúbito dorsal após a anestesia e fazer uma ~ 0.4 polegadas incisão mediana abdominal (A). Exponha testículo mediante a retirada do almofada de gordura anexado a do epidídimo e do testículo e coloque um drape fina estéril debaixo da almofada de gordura / testículo, para melhor identificação visual (B). Posicione o testículo e epidídimo de modo que os dutos eferentes, enterrados em a almofada de gordura são discerníveis (C, D, E). Identidade dos dutos eferentes e remova cuidadosamente tecido adiposo ao redor dos ductos. Um pedaço de papel colorido ou de plástico podem ser colocadas por debaixo das dutos para melhor visualização (G). Ruptura de ou moer a ponta da pipeta de acordo com o tamanho dos ductos e suspensão célula de carga para a pipeta (H). Insira com cuidado a pipeta em um duto no feixe dos dutos eferentes, gentilmente enrosque poucos milímetros em direção ao testículo (a seta em H mostra a direção da pipeta de injeção e threading). Um testículo com injeção de sucesso em túbulos seminíferos é mostrada (I). Ts: Testículo; Ep: epidídimo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" /> Figura 2. Os resultados representativos para o transplante de células germinativas A) Um testículo injetados coradas com X-gal. Os segmentos azuis dos túbulos seminíferos representam colônias estabelecidas a partir de doadores transgênicos SSC (lacZ transgene). B) Maior ampliação de uma colônia SSC em 3 meses pós-transplante. Thde e região azul-escuro no centro representa a espermatogênese completa e as regiões pálidos azuis nas extremidades representam extensão crescente de a colônia. C) Um corte histológico do escuro túbulo seminífero azul (3 meses pós-transplante) mostra espermatogênese bem organizado. Barras de escala em B e C são 200 mM e 30 æM, respectivamente. (Figuras adaptado a partir Annu Célula Rev Dev Biol 2008;. 24:263-86 e Biol Reprod 1999 junho;. 60 (6) :1429-36). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" /> Figura 3. Xeno ectópica de tecido dos testículos imaturos de animais de grande porte em ratos imunodeficientes. Fragmentos de testículo doadores imaturos (~ 1 mm 3) transplantados sob a pele dorsal de ratos imunodeficientes (A) são capazes de sobreviver e responder às gonadotrofinas do rato. Como resultado, o tecido testículo sofre de desenvolvimento completo, incluindo a formação de esperma fertilização competente (B). Uma vez xenoenxerto de testículo são coletados (C)eles podem ser usados ​​para a análise ou para obter esperma (D) para ICSI (E) e de produção de embriões (F). Bares igualdade de 50 um (B, E e F) or 10 iM (D). (Modificado de Rodriguez-Sosa e Dobrinksi 2009 14).

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	<li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation.">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).</li><li>Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+and+kinetics+of+mouse+donor+spermatogonial+stem+cell+colonization+in+recipient+testes.">Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes.</a> Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).</li><li>Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+produced+by+retroviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).</li><li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+rats+through+the+male+germline+using+lentiviral+transduction+and+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).</li><li>Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cells+dictate+spermatogonial+stem+cell+niches+in+the+mouse+testis.">Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).</li><li>Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+efficiency+and+proliferation+kinetics+of+male+germ+line+stem+cells+following+transplantation+in+mice.">Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice.</a> Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).</li><li>Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+essential+for+self-renewal+and+expansion+of+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).</li><li>Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+genes+important+for+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+and+survival.">Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).</li><li>Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+transplantation+and+testis+tissue+xenografting+in+domestic+animals.">Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals.</a> Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).</li><li>Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+germ+cells+from+rabbits+and+dogs+into+mouse+testes.">Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes.</a> Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).</li><li>Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+from+neonatal+mammalian+testes+grafted+in+mice.">Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice.</a> Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).</li><li>Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+testis+tissue+xenografting.">Recent developments in testis tissue xenografting.</a> Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).</li><li>Dobrinski, I., Rathi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+grafting+of+mammalian+testis+tissue+into+mouse+hosts.">Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts.</a> Methods in Molecular Biology. 139, 450-450 (2008).</li><li>Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I., Seli, E., Agarwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+tissue+transplantation+for+fertility+preservation.">Testicular tissue transplantation for fertility preservation.</a> Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. , 331-331 (2011).</li><li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+fate+and+seminiferous+tubule+development+in+bovine+testis+xenografts.">Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts.</a> Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).</li><li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+development+in+equine+testis+tissue+xenografted+into+mice.">Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice.</a> Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).</li><li>Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+donor+age+on+success+of+spermatogenesis+in+feline+testis+xenografts.">Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).</li><li>Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenografting+of+adult+mammalian+testis+tissue.">Xenografting of adult mammalian testis tissue.</a> Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).</li><li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft.">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li><li>Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells.">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells.">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li><li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal.">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li><li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells.">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li><li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege.">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li><li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue.">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li><li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts.">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li><li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice.">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li><li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice.">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

1. Gérmen de transplante de células Gérmen de transplante de células fornece o ensaio somente funcional para a confirmação inequívoca de a presença de células-tronco espermatogónias (SSCs) em uma população de células. SSC só pode casa e colonizar o nicho SSC na membrana basal e iniciar doador-derivado espermatogênese. Gérmen de transplante de células tornou possível para estudar e manipular SSCs em uma forma sem precedentes. A técnica tem sido utilizada para produzir animais transgénicos através da manipulação genética de SSCs 4; para elucidar o padrão de eficiência, e da cinética do SSC colonização 3,8; para estudar as vias de sinalização que regulam SSC auto-renovação e diferenciação 9,10; para caracterizar marcadores de superfície em SSC para a sua identificação 22,23; para estudar o ambiente nicho para SSCs 6,7,24. Além disso, o transplante de recíproca tem sido empregada para investigar se um fenótipo de infertility originado a partir de um defeito em células de Sertoli ou em células germinativas 25,26. Para o transplante para trabalhar de forma eficiente, a escolha e tratamento dos animais receptores é importante. Os beneficiários devem ser ou geneticamente combinados a doadores ou imuno-suprimidos. Os destinatários deveriam também carecem de espermatogênese endógena: ou devido a uma mutação como em camundongos W / W V, ou renderizado infértil como um resultado de depleção de células de gérmen por irradiação ou drogas quimioterápicas, tais como O busulfan. Além disso, uma boa preparação de suspensões de doadoras de células e de aptidão, em procedimento de transplante são importantes para o sucesso da técnica como bem. Gérmen de transplante de células tem suas próprias limitações. Não há nenhuma rápido de leitura-para fora para resultados. A análise dos testículos destinatário precisa esperar pelo menos dois meses como restabelecimento de espermatogênese completo nos receptores de outra forma inférteis acontece dois meses após o transplante 3. É isa ensaio qualitativo ou semi-quantitativa devido a grandes variações de injeção de células número e grau de destinatário supressão de células germinativas. Embora o conceito de transplante de células de gérmen tenha sido adaptado a outras espécies animais, o procedimento em si é tecnicamente diferente e um tanto mais desafiador em espécies não roedoras como um resultado das diferenças anatômicas em toda a espécies 11. 2. Testículo tecido xeno Tecido testicular xeno funciona em muitas espécies de mamíferos e doadores é uma técnica relativamente simples. Tal como em outros tipos de transplantes, a coleção mais cedo após o tecido é transplantados, o maior chance de sucesso. Portanto, a preservação e manuseio do tecido a partir de coleção para o transplante é importante. No entanto, no nosso tecido testicular experiência não necessita de tratamento especial que não está sendo mantido refrigerado. Tecido Testículo pode ser mantida a temperatura de refrigerador até 24-36 hr,e, em seguida, fragmentos podem ser preparados para o transplante. Além disso, fragmentos de testículo frescos pode ser mantida em meio de cultura padrão a 4 ° C transplante de noite para o dia prévio, sem que um efeito perceptível sobre o resultado enxertia 27. Tecido Testículo também pode ser criopreservados se armazenamento a longo prazo é desejada. Estudos realizados em caprinos 13, suínos 13,27, e macaco 28 demonstraram que o congelamento e posterior descongelamento do tecido testicular não afeta significativamente a sua capacidade de desenvolver e produzir espermatozóides após ectópica xeno em camundongos. Criopreservação bem-sucedida de tecido de testículo pode ser alcançado por automatizado de congelamento de 28 ou convencional lento-congelamento em um banho de álcool 13,27, utilizando-se DMSO como crioprotetor em meio de padrão de tecido de cultura contendo de FBS. Para o transplante, o tecido testículo criopreservado é, então, descongeladas por métodos padrão e, subsequentemente, lavou-se em meio de cultura antes do transplante 27. Uma vez que o tisSue tem sido transplantada o mouse destinatário serve como um in vivo incubadora e nenhum grandes intervenções são obrigatórios. No entanto, em alguns casos, a suplementação com gonadotrofinas exógenas podem ser exigidos; tecido testículo partir de 6-meses-old macacos rhesus exigido injetando camundongos de destinatário por via subcutânea com 10 UI de hCG duas vezes por uma semana para atingir a espermatogênese completo de menos 6-7 meses 29. Como mencionado acima, o melhor resultado é obtido quando o tecido a partir de machos recém-nascidos é usado. Tecido a partir de machos em que as células germinativas postmeiotic estão presentes mostra uma tendência a degenerar. No entanto, com animais imaturos recapitulação completa de o desenvolvimento dos testículos é possível e tem inúmeras aplicações clínicas e de pesquisa. Em um ambiente clínico, testículos tecido xeno-enxerto pode ser usado para a fertilidade preservação, particularmente nos machos imaturos em qual a recuperação esperma não é uma opção. Pequenos pedaços sob a forma de biópsias podem ser coletados e congelados para armazenamento a longo prazo. Quando desIred, os fragmentos podem ser descongeladas e enxertado em camundongos 27,28. Outra alternativa é a criopreservação de o esperma que é colhida a partir de xenoenxertos. Microinjeção com snap-congelado esperma a partir de xenoenxertos de testículo de suínos resultou em geração de embriões morfologicamente normais, embora a um menor eficiência em comparação com testicular, epididimal, ou ejaculou esperma 27. Depois de tecido tem desenvolvido, ele pode ser coletadas para a colheita de esperma e de esperma pode ser usado para produzir embriões in vitro 13,16,30. A limitação deste, no entanto, é o fato de que resulta o esperma não sofrem maturação epididimária e ICSI, portanto, exigem para a fertilização. Portanto, uso de xenoenxerto-derivada de esperma para a fertilização é limitado a espécies onde o ICSI tem sido estabelecidos. Na pesquisa, testículos tecido xeno é uma alternativa atraente para estudar o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies de grande porte em um modelo de roedor. Por exemplo, umtestículo único doador podem ser transplantadas para camundongos múltiplas. Camundongos de Destinatário pode, então, ser exposto a diferentes tratamentos, e / ou sacrificado em pontos de tempo diferentes para a recolha de xenoenxerto. Isto não só elimina os efeitos dos doadores, mas também reduz o número de machos grandes exigidos para um experimento em particular ou de estudo. Isto é particularmente importante em animais de grande porte onde os estudos que envolvam os machos numerosos são logisticamente difícil e caro, e pode transportar limitações éticas, particularmente em primatas. No entanto, as aplicações de xeno-enxerto de tecidos testículo são limitados como a manipulação de tipos de células específicas antes do transplante não é facilmente possível e eficiência da espermatogênese é baixa em espécies doadoras certas 14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Colagenase (tipo IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Filtro de nylon de malha celular </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 (40μm) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> De parede fina capilares de vidro </td><td> Instrumento de precisão Mundial </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD tubulação plyethylene intramedic (PE100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon fio de seda 6-0 </td><td> Ethicon </td><td> 706G </td></tr><tr><td> Grampos de sutura </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Ferrocianeto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Ferricianeto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> cloreto de magnésio </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> desoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ cell transplantation and testis tissue xenografting in mice

Gérmen de transplante de células foi desenvolvido pelo Dr. Ralph Brinster e colegas da Universidade da Pensilvânia, em 1994, 1,2. Estes estudos inovadores mostraram que a microinjeção de células germinativas de camundongos doadores férteis no interior dos túbulos seminíferos de ratos inférteis receptor resulta em doador-derivado espermatogênese e produção de espermatozóides pelo animal destinatário 2. O uso de machos dadores que transportem a identificação gene bacteriano β-galactosidase permitido de doador-derivado espermatogênese e transmissão de o haplótipo o dador até ao a prole, pelos animais, destinatário 1. Surpreendentemente, após o transplante para dentro do lúmen dos túbulos seminíferos, as células germinativas transplantados eram capaz de se mover a partir do compartimento luminal para a membrana cave, onde espermatogônias estão localizados 3. É geralmente aceite que SSCs só são capazes de colonizar o nicho e restabelecer a espermatogênese nos testículos beneficiários. Portanto células germinativas,transplante oferece uma abordagem funcional para estudar o nicho de células-tronco nos testículos e caracterizar supostas células-tronco espermatogônias. Até à data, o transplante de células de gérmen é usado para elucidar a biologia célula básica do caule, para produzir animais transgénicos através da manipulação genética de células germinais antes do transplante 4,5, para estudar de Sertoli interação célula a célula de gérmen de 6,7, SSC homing e colonização 3, 8, bem como SSC auto-renovação e diferenciação 9,10. Transplante de células germinativas é também viável em grandes espécies 11. Nestes, as principais aplicações são a preservação da fertilidade, a divulgação da genética nas populações animais de elite, e geração de animais transgênicos como o estudo da espermatogênese ea biologia SSC com esta técnica é logisticamente mais difícil e caro do que em roedores. Transplante de células germinais de espécies de grande porte no interior dos túbulos seminíferos de ratos resulta em colonizatíon de células doadoras e de expansão das espermatogónias, mas não na sua plena diferenciação presumivelmente devido à incompatibilidade do compartimento da célula destinatário somática com as células germinativas a partir de espécies filogeneticamente distantes 12. Uma abordagem alternativa é o transplante de células germinativas a partir de espécies de grandes juntamente com o seu compartimento de somática circundante. Nós relatada pela primeira vez em 2002, de que pequenos fragmentos de tecido testículo a partir de machos imaturos transplantados sob a pele dorsal de camundongos imunodeficientes são capazes de sobreviver e submetidos a um desenvolvimento pleno com a produção de esperma fertilização competente 13. Desde que, em seguida, tecido testículo xeno-enxerto tem sido mostrado para ser bem sucedido em muitas espécies e emergiu como uma alternativa valiosa para estudar o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de animais de grande porte em camundongos 14.

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Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos receptores.

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K visualizações.  University of Calgary. Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos rec...

Vídeo: Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Heterotopic Heart Transplantation in Mice

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable for studying rejection and immune response now that newer transgenic and gene knockout mice are available, and a large number of immunologic reagents have been developed. The heart transplant model is less stringent than the skin transplant models, although technically more challenging. We have developed a modified technique and have completed over 1000 successful cases of heterotopic heart transplantation in mice. When making anastomosis of the ascending aorta and abdominal aorta, two stay sutures are placed at the proximal and distal apexes of recipient abdominal aorta with the donor s ascending aorta, then using 11-0 suture for anastomosis on both side of aorta with continuing sutures. The stay sutures make the anastomosis easier and 11-0 is an ideal suture size to avoid bleeding and thrombosis.
When making anastomosis of pulmonary artery and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s pulmonary artery. The left wall of the inferior vena cava and donor s pulmonary artery is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s pulmonary artery are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis. In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse heterotopic heart transplantation model has been proven by many investigators to be an important method for studying mechanisms of rejection and immune response. However, the techniques involved are still challenging. By modifying standard techniques we have had success with more than 1000 transplants.

Transplante cardíaco heterotópico em ratos

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable ...

Small Bowel Transplantation In Mice

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive medications, infection prophylaxis, and suitable patient selection helped improve actuarial graft and patient survival rates for all types of intestine transplantation. Patients with irreversible intestinal failure and complications of parenteral nutrition should now be routinely considered for small intestine transplantation. However, Survival rates for small intestinal transplantation have been slow to improve compares increasingly favorably with renal, liver, heart and lung. The small bowel transplantation is still unsatisfactory compared with other organs. Further progress may depend on better understanding of immunology and physiology of the graft and can be greatly facilitated by animal models. A wider use of mouse small bowel transplantation model is needed in the study of immunology and physiology of the transplantation gut as well as efficient methods in diagnosing early rejection. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenging. We have developed a modified technique. When making anastomosis of portal vein and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s portal vein. The left wall of the inferior vena cava and donor s portal vein is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, after one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s portal vein are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis.  In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse small bowel transplantation model has been recognized as an important tool to study mechanismes of immune rejection and screen new immunosuppressive drugs. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenge. Now we introduce the modified technique.

Transplante de intestino delgado em ratos

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the pathophysiology, treatment and prevention of OAD, different animal models of tracheal transplantation in rodents have been developed (1-7). Here, we use two established models of trachea transplantation, the heterotopic and orthotopic model and demonstrate their advantages and limitations.
For the heterotopic model, the donor trachea is wrapped into the greater omentum of the recipient, whereas the donor trachea is anastomosed by end-to-end anastomosis in the orthotopic model.
In both models, the development of obliterative lesions histological similar to clinical OAD has been demonstrated (1-7).
This video shows how to perform both, the heterotopic as well as the orthotopic tracheal transplantation technique in mice, and compares the time course of OAD development in both models using histology.

This video shows and compares two experimental models to study the development of obliterative airway disease (OAD) in mice, the heterotopic and orthotopic tracheal transplantation model.

Heterotópico e Transplante ortotópico traqueal em ratos usados ​​como modelos para estudar o desenvolvimento de doenças das vias aéreas obliterante

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...