Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области анализа крови биологических полей о генных кандидатов, вирусов или экологических токсинов, которые могут повлиять на функцию барьера крови-тестиса или целостности. За три дня до операции, лечить по крайней мере три восьминедельных C57Black/6 мышей мужского пола ежедневно с пятью миллиграммами на килограмм хлорида кадмия массы тела через внутриперитонеамерную инъекцию. В день операции поместите чистую ткань на 75%-стерилизованную этанолом хирургическую зону и установите термостатический обогреватель до 37 градусов по Цельсию.
Поместите анестезированную мышь на ткань, а затем подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша. Бритье брюшной волосы бритвой, и дезинфицировать открытые кожи с 75%этанола. Сделайте один сантиметр разреза кожи над препутальными железами, чтобы разоблачить брюшной стенки, и использовать небольшие миппы, чтобы поднять кожу, чтобы сделать 0,5-сантиметровый разрез в брюшной полости.
Используйте типсы для поиска жира колодки вокруг эпидидимиса и яичка, тщательно потянув жира колодки, чтобы разоблачить один прилагается яичка. Поместите девятисемейметровый лист бумаги под жировые прокладки и яички и загрузите микроинъекцию пипеткой со свежеприготовленным раствором инулин-ФИТК. Подключите пипетку к блоку микроманипулятора и используйте рассеченный микроскоп, чтобы аккуратно вставить наконечник микроинъекции пипетки под туника альбугинеа.
Медленно поверните операционный рычаг, чтобы доставить 20 микролитров инулина-FITC в интерстиций яичка. Если доставка будет успешной, яичка превратят ярко-зелено-желтого цвета. Немедленно верните яички в брюшную полость и ввилите контралатеральный яичк с помощью 20 микролитров PBS, затем закройте кожу хирургическим швом.
И поместите мышь на тепловую панель термостатического обогревателя. Через 40 минут после инъекции используйте острые ножницы, чтобы собрать яички с каждой мыши, и мыть ткани в один миллилитр ледяной PBS. Далее, исправить яички в 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов, а затем три моет в 1,5 миллилитров 1%PBS за стирку.
После 30% обезвоживания сахарозы на ночь, передать образцы в отдельных встраивания кадров, и покрыть ткани с оптимальным резки температурного соединения. Установите температуру криостата до отрицательных 20 градусов по Цельсию и поместите кадры в криостат в течение примерно 10 минут, пока OCT не замерз. Затем заполните каждый встраиваемый каркас свежим ОКТ до тех пор, пока весь яичк не будет покрыт каждой формой.
Когда второй слой OCT замерз, приобрести пять микрометров толщиной поперечных сечений каждого яичка, захватив ткани разделы на стеклянный микроскоп слайды, как они получены. Для изображения образцов сначала нагревают горки во влажной коробке при комнатной температуре. Через 10 минут, мыть слайды три раза в свежем Tris-буферный солевой раствор для мытья и дайте разделам высохнуть в течение пяти минут защищены от света.
Используйте бумагу без пыли, чтобы удалить остаточный солевой раствор и смонтировать образцы с помощью крепления DAPI-дополненной среды. Затем накройте каждый образец перевернутым крышкой скольжения, и изображение образцов под 20X цель конфокального микроскопа. Три дня лечения хлоридом кадмия приводит к повреждению гембиозного барьера, позволяющего диффузию инулина-FITC из базального отсека в апиальный отсек семенного эпителия.
В отличие от этого, эта диффузия блокируется в контрольных тестах, обработанных PBS. Степень повреждения гемового барьера определяется путем расчета соотношения расстояния диффузии инулин-ФИТК к радиусу той же семенной трубочки. Кроме того, нетронутый гемовой барьер у гетерозиготных мышей Rictor floxed блокирует диффузию инулина через барьер в апиальный отсек, в то время как условные мыши Rictor knockout обладают скомпрометированным гемовензелитным барьером, который позволяет диффузию инулина.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы доставить инулин-FITC подготовлены в день эксперимента и сохранить ткани защищены от света, поскольку FITC является светочувствительным молекулы. Последствия этого метода распространяются на терапию нарушения сперматогенеза, потому что функция гематотейного барьера заключается в том, чтобы обеспечить иммунно-привилегированную микроокноронику для завершения мейоза при сперматогенезе. После своего развития, этот метод обеспечивает путь для исследователей в поле воспроизводственной микстуры исследовать subfertility и неплодородность в мышах.
Не забывайте, что работа с параформальдехиды может быть чрезвычайно опасным и что меры предосторожности, такие как ношение одежды и маски для лица всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
