No meu laboratório, estamos projetando terapias celulares de próxima geração, combinando engenharia de proteínas com engenharia celular. Então, projetamos componentes de proteínas para obter novas funções ou melhorar as existentes e, em seguida, incorporamos essas proteínas nulas na terapêutica celular. Desenvolvemos ainda mais a exibição de superfície de uso para aplicações especializadas, incluindo engenharia de estabilidade de proteínas, engenharia de interruptores de proteínas reguladas por moléculas pequenas e direcionamento específico de confirmações de receptores ativados associados ao câncer.
A vantagem da exibição da superfície da levedura em comparação com outras tecnologias de exibição, como exibição de fagos ou ribossomos, é a visualização da citometria de fluxo da biblioteca durante o processo de classificação e o controle preciso das condições de seleção, como concentração de antígeno e rigor da porta de classificação. Para começar, prepare as esferas para a primeira seleção de contas ressuspendendo 10 microlitros de esferas magnéticas de aglutinante de biotina em 990 microlitros de PBSA. Para lavar, coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos com a tampa aberta.
Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as esferas lavadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro em um mililitro de PBSA com 6,7 a 33 picomoles de antígeno biotinilado. Após a incubação, coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos com a tampa aberta, remova o sobrenadante e lave as esferas carregadas de antígeno com um mililitro de PBSA.
Assim que as contas assentarem, remova o PBSA. Em seguida, ressuspenda os grânulos carregados de antígeno em 50 microlitros de PBSA. Prepare as células, grânulos de antígeno e uma solução de grânulos de urso para seleções negativas.
Após a lavagem, ressuspenda os grânulos de antígeno em 50 microlitros de PBSA e ressuspenda os grânulos de urso em 150 microlitros de PBSA. Para a primeira seleção negativa, adicione 50 microlitros de contas nuas lavadas a 950 microlitros de células lavadas em PBSA e incube a mistura por 1,5 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque os tubos contendo as suspensões de células de contas de urso em um rack magnético com a tampa aberta.
Pipete qualquer líquido da tampa para o tubo e aguarde dois minutos. Em seguida, transfira as células não ligadas para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 50 microlitros de contas de urso lavadas. Após três rodadas de seleção negativa, adicione 50 microlitros de solução de grânulo carregada de antígeno às células.
Incube por duas horas a quatro graus Celsius. Agora coloque as células que contêm as esferas carregadas de antígeno em um rack magnético com a tampa aberta. Pipete qualquer líquido que esteja na tampa para dentro do tubo.
Aguarde dois minutos antes de descartar as células não ligadas. Execute todas as etapas restantes conforme descrito para a primeira seleção do grânulo de antígeno. Após três seleções negativas e uma positiva, ressuspender as células rapidamente em um mililitro de SDCAA e transferir para um frasco agitador contendo um volume maior de SDCAA.
Após a indução noturna da expressão superficial de proteínas em SGCAA em bibliotecas de leveduras, granular células suficientes para cobrir 10 vezes a diversidade e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em PBSA e transfira-o para tubos de microcentrífuga. Use 30 milhões de células para coloração em cada tubo.
Prepare quantos tubos forem necessários com base na diversidade, incluindo um tubo de controle sem o antígeno. Em seguida, centrifugue os tubos a 2000 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBSA contendo o antígeno e incube por uma hora a quatro graus Celsius.
Depois de realizar a centrifugação mais uma vez, remova o PBSA do pellet. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de PBSA frio contendo anticorpos para coloração de exibição e detecção de antígeno. Incube por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação, centrifugue as células a 2000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Adicione um mililitro de PBSA ao pellet e repita a centrifugação. Em seguida, remova a maior parte do sobrenadante, deixando apenas 20 a 30 microlitros para evitar que o pellet seque.
Ressuspenda o pellet em PBSA frio antes de classificar. Agora classifique as células diretamente em SDCAA, um meio. Após a classificação, transferir as células para um frasco agitador contendo um volume maior de meio SDCAA e incubar a 30 graus Celsius com agitação a 180 RPM.
