Os autores agradecer T. Palmer e H. Barbosa (Stanford neurocirurgia) para fornecer murino NPCs. vetoriais na Figura 4 foi utilizada e adaptada da arte médica Servier sob licença Creative Commons Attribution 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte deste trabalho foi realizada no Stanford Nano compartilhado instalações (SNSF), apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prémio ECCS-1542152. N.A.S. reconhece o apoio do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. reconhece apoio de um NRSA NIH doutorandos fellowship (F31 EB020502) e o programa de estudiosos do Siebel. S.C.H. reconhece apoio do National Institutes of Health (AI116484 de Sub-19 e R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) e o Instituto de Califórnia para a medicina regenerativa (RT3-07948). Esta pesquisa recebeu financiamento da Aliança para pesquisa de reabilitação regenerativa & treinamento (AR3T), que é apoiada pela Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES), Instituto Nacional de Distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) e do Instituto Nacional de imagem biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde, sob número P2CHD086843 Award. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões do institutos nacionais da saúde.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Purificação e expressão da proteína recombinante é uma ferramenta poderosa para sintetizar biomateriais com alta reprodutibilidade. Devido em grande parte para o advento da clonagem molecular comercializado, plasmídeo recombinante personalizado pode ser adquirido de vários fornecedores, que reduz significativamente o tempo para trabalhar com materiais como o ELPs. Da mesma forma, plasmídeos podem ser solicitados diretamente do laboratório de origem, quando o trabalho original foi apoiado por um contrato federal e trabalho futuro será para uso sem fins lucrativos. A sequência completa de aminoácidos ELP foi anteriormente publicada por várias variantes ELP31. No entanto, o processo de expressão para eventual purificação de proteínas recombinantes envolve uma série de passos críticos que comumente podem levar a rendimentos reduzidos ou um produto de qualidade inferior. Algumas das questões mais comuns para a preparação de ELP surgirem em um dos seguintes: (1) qualidade de populações bacterianas armazenadas, (2) o congelamento-descongelamento primeiro ciclo para romper a membrana bacteriana e purificação de proteínas (3) através de ciclagem térmica.
Uma diferença importante entre a expressão da proteína e outros meios não-biológicos de produção de materiais é que nós estão aproveitando a maquinaria biológica de hosts recombinantes para sintetizar os polímeros. Posteriormente, essa técnica vem com uma única limitação: morte celular ou danos. Morte celular mais comumente manifesta-se como um reduzido número de colônias bacterianas após estrias uma placa ou anormalmente pequenas colônias que crescem relativamente lentamente. Populações bacterianas, se mantido cuidadosamente, podem permanecer estáveis durante anos; no entanto, ciclos de congelamento-descongelamento sucessivos devido a falha repetida de uso ou congelador podem reduzir a viabilidade celular ou levar a danos no DNA. Estoques de bactéria BL21 típicos usam entre 10% e 40% de glicerol em volume misturado com células suspensas. O objetivo do glicerol é reduzir danos de membrana de nucleação de cristais de gelo durante o congelamento. Portanto, usando baixas concentrações (< % de 10) pode levar a uma membrana comprometida, enquanto altas concentrações (> 40%) pode suprimir o ponto de congelamento suficientemente para onde o estoque nunca congela levando à morte celular. No entanto, mesmo dentro dos níveis de glicerol ideal, populações bacterianas não poderão totalmente degelo como uma combinação de membrana danos causados por efeitos citotóxicos e re-congelamento do glicerol pode levar a reduzida viabilidade das ações e danos no DNA. Portanto, se observa-se que uma ação bacteriana resulta em uma contagem baixa de colônia ou que as células se dividem a uma taxa lenta consistentemente (manifestada como uma taxa de rampa de600 OD lenta durante a expressão), re-transformar o plasmídeo e fazer um novo stock são um simples primeira abordagem para solucionar este problema. Com isto em mente, para garantir a manutenção a longo prazo das populações bacterianas e integridade do DNA, é melhor armazenar as cópias de seu plasmídeo como DNA purificado congelado em água e não dentro das células. Armazenar o DNA desta forma irá garantir que imprevistos como uma falha de estoque ou falha do congelador, uma fonte confiável do DNA original pode ser usada para transformação.
Outro passo fundamental na fabricação do ELP é a purificação da proteína alvo do host de expressão. Extração de proteínas de e. coli é conseguida quebrando a parede de pilha usando nucleação cristais de gelo que se formam em toda o suspensão lisado celular total sobre congelamento, que é ainda mais agravado com ciclos de congelamento e descongelamento sucessivos. Métodos alternativos para romper a parede celular podem ser utilizados como sonication ou uma prensa. Em particular, consecutivo congelamento-descongelamento do lisado é vantajoso, pois requer apenas um freezer e nenhum outro equipamento de especialidade. No entanto, este procedimento libera nonspecifically o DNA, RNA e proteínas contaminantes, além de proteases que têm o potencial de degradar a proteína do alvo. Portanto, para evitar contaminação e redução de rendimento, desoxirribonuclease I (DNase) e fluoreto de phenylmethanesulfonyl (PMSF) são adicionados à célula lisada para degradar o DNA e inibir proteases, respectivamente. A presença de DNA antes da adição de DNase pode ser observada visualmente como uma aparência 'pegajoso' em toda a célula re-suspensa lisada seguindo o primeiro degelo. DNase ativamente degrada o DNA e, portanto, reduz a viscosidade da célula lisada facilitando a purificar através de centrifugação. Optimal quebra de DNA pode ser confirmada visualmente, garantindo que o lisado celular parece ser inteiramente líquido e que a aparência fibrosa não é mais visível. Temos observado na prática que a adição de ~0.1 mg de DNase por lisado celular de mL é suficiente para alcançar a necessária degradação. No entanto, se a presença de DNA ainda é observada, DNase mais pode ser adicionado seguido por um adicional de duas a três horas de agitação. Um problema semelhante também pode surgir se DNase é adicionado prematuramente, antes de qualquer um do lisado teve o potencial para descongelar suficientemente. Neste caso, as temperaturas mais frias podem limitar a eficiência da degradação do DNA devido à inactivação prematura de DNase. Para evitar esse problema, muitas vezes é prática recomendada para permitir a re-suspensa pelota descongelar por aproximadamente 8 horas antes do tratamento com DNase. Além disso, se são relatados rendimentos de baixa proteína e degradação do DNA tem sido suficiente, a adição de mais PMSF para ajudar a reduzir ainda mais o potencial degradação proteica de proteases pode ser necessária.
Considerações adicionais para garantir a expressão ideal da ELPs incluem uma compreensão cuidadosa dos benefícios e limitações de um antibiótico escolhido. Aqui, vetores de pET15b contendo um gene de resistência de ampicilina foram usados para a expressão da proteína. Funcionalmente, a série de vetor de animais permite significativa na expressão de proteínas com tanto quanto 50% de expressão de proteínas de uma bactéria dedicado à proteína alvo após uma bem sucedida indução32,33. No entanto, ampicilina como um antibiótico seleção vem com algumas limitações que podem interferir com a expressão ideal. Primeiro, degradação de ampicilina na presença de Escherichia coli pode ocorrer rapidamente devido à liberação de beta-lactamase. Se uma quantidade suficiente da ampicilina é degradada, o plasmídeo codificação de ampicilina (ou seja, o plasmídeo ELP-codificação) pode ser perdido inteiramente. Como resultado, quando expressar ELPs para durações mais longas, os níveis de expressão da proteína devem ser monitorados cuidadosamente em pontos sucessivos de tempo para garantir que uma quantidade suficiente do gene ELP-codificação permitir a expressão desejável. Métodos possíveis para solução de problemas o acúmulo de beta-lactamases incluem girando para baixo a cultura starter e re-suspender as células em meio sem antibióticos antes de inocular o meio de expressão. Este processo efetivamente limita a transferência de enzimas degradantes de antibiótico e garante uma maior parcela de células contêm o vetor alvo-proteína-codificação. Além disso, a ampicilina tem uma vida útil limitada de cerca de duas a três semanas. Portanto, placas de cultura para a expressão da proteína devem ser armazenadas a 4 ° C por um período máximo de duas semanas antes de usar. Finalmente, para garantir a eficácia da ampicilina dentro do starter e expressão de mídia, a solução estoque de ampicilina deve ser fresco produzido imediatamente antes da utilização, como o armazenamento a longo prazo pode levar a um antibiótico menos eficaz.
A presença de um LCST permite a purificação simples de ELPs através de ciclagem térmica. Especificamente, a uma temperatura mais elevada e na presença de sais, forças entrópica causam ELPs tornar-se menos solúvel e posteriormente formam uma fase coacervate ricos em polímero. Por outro lado, a baixas temperaturas, ELPs permanecem solúveis e facilmente dissolvem na solução. Andar de bicicleta entre esses regimes de dois temperatura juntamente com etapas de centrifugação para recolher e descartar a fase não-ELP-contendo sucessivamente concentra-se a proteína e simultaneamente reduz a existência de contaminantes não-ELP.
No entanto, há um número de estágios onde ELPs podem ser perdidos neste processo de purificação. Primeiro, antes de cada rodada de fria, a solução contendo proteína é alcalinizada a um pH de 9.0. Este pH superior serve para deprotonar certos aminoácidos sobre a espinha dorsal da proteína, efetivamente, deixando-os em um estado de carga e aumentando ainda mais a sua solubilidade. Consequentemente, esta etapa que precede ou não, deixando tempo suficiente para dissolução de proteína pode levar a uma redução no rendimento como proteínas não-solubilizado serão peletizadas durante a centrifugação e descartadas.
Da mesma forma, as proteínas alvo podem ser perdidas durante o procedimento de centrifugação quente quando o ELP é peletizado. Inicialmente, NaCl é adicionado para o sobrenadante rico em proteínas para reduzir a solubilidade do ELP. Os sais trabalham para proteger interações eletrostáticas entre as moléculas de proteína e água, fazendo com que a proteína separar a fase aquosa. Este efeito é amplificado por aquecimento a solução, que, devido aos efeitos Entrópico, ainda mais se decompõe hidratada 'gaiola' em torno ELPs e obriga a agregação das proteínas. Em concentrações menores de proteína (i. e., o primeiro ciclo térmico), a adição de sais sozinhos muitas vezes é insuficiente para causar essa separação de fases. No entanto, como a concentração de proteína aumenta (i. e., depois os ciclos térmicos) e há menos contaminantes secundários para interagir com os sais, o ELP mais prontamente irá precipitar. Como resultado, se sais são adicionados também rapidamente, eles podem tornar-se fisicamente presos da agregação de proteínas, que efetivamente reduz a concentração de sal da solução e limita mais precipitação de proteínas. Assim, o sal deve ser adicionado em três pequenos lotes para garantir que eles tenham tempo suficiente para distribuir homogênea através da solução. Como uma nota final, ou variações para a espinha dorsal do ELP, por meio de adicional modificações para o resíduo de comentários da região de elastina, como alterações na região de bio-ativo significativamente podem afetar o comportamento LCST. Consequentemente, para garantir o rendimento de proteína ideal em variantes de proteína, é fundamental otimizar o pH, concentração de sal e sal tipo (ex., monovalente ou divalentes) para as rotações de frias e quentes.
SDS-PAGE em execução após a conclusão do protocolo é recomendada, pois pode ser usada para determinar facilmente se perda significativa do ELP ocorre durante qualquer uma das etapas da purificação. Brevemente, se ELP é detectado no sobrenadante após uma rodada quente, então a proteína não é ser efetivamente precipitada. Da mesma forma, se ELPs são identificados em uma amostra de sedimento solubilizado após uma rotação de fria, então a proteína não é ser efetivamente dissolvida.
ELP hidrogel oferece muitas vantagens sobre materiais sintéticos ou derivados naturalmente. Especificamente, o uso da amina reativos crosslinker THPC proporciona um mecanismo de baixo custo, simples e ajustável de reticulação de proteína. No entanto, existem limitações distintas dentro do protocolo de reticulação que deve-se notar. THPC é sensível de oxigênio, e se armazenados em condições impróprias, isso pode rapidamente se deteriorar na eficiência da reação. Além disso, devido a sua reatividade com aminas primárias, THPC pode reagir com em torno de proteínas em mídia ou aqueles na superfície das células que são ricas em aminas. Portanto, quando o formando hidrogel ELP, é recomendável para evitar a contaminação de mídia com o centrifugado para reduzir a reatividade cruzada de proteína exógena possível e, portanto, uma redução na eficiência de reticulação. Finalmente, este mecanismo de reticulação opõe-se a sequência de região de bio-ativo para aqueles que contêm sem resíduos de lisina e assim, limita o potencial integração de alguns motivos de célula-adesivo (EG., IKVAV,34). Para resolver essas limitações, modificações ao backbone ELP com azida sódica e bicyclononyne (BCN) parceiros de reação permite a reticulação bio-ortogonais, como descrito anteriormente,27.
Note-se que o comportamento do ELP LCST desempenha um papel importante em ditar a microestrutura de hidrogel. Em regimes de temperatura acima da LCST, ELPs precipitam fora da solução, levando a formação de fases ricas em proteínas e deficiência de proteína que pode influenciar a porosidade da matriz e eficiência de reticulação da matriz9. Porque a maioria das experiências de cultura de pilha são realizadas em temperaturas fisiologicamente relevantes (~ 37 ° C) acima do ELP LCST, esses efeitos devem ser considerados. Para o hidrogel para efetivamente crosslink e forma uma rede interconectada de proteína, a amina primária da lisina deve ser fisicamente acessível para o agente reticulante THPC. Se a agregação de ELP ocorre antes de chegar a reticulação suficiente, ELPs presos no âmbito da fase rica em proteínas podem ser inacessível e, portanto, incapaz de participar de reticulação. Para resolver essa limitação, o nosso protocolo requer um período de reticulação inicial 15 min à temperatura ambiente, que permite a reticulação preliminar do hidrogel antes o ELP sofre sua transição de fase térmica. Esta temperatura de incubação é seguida por uma incubação adicional 15 min a 37 ° C para finalizar reticulação de hidrogel. Este procedimento é fundamental para reticulação suficiente e robusta, reprodutível gelificação do material ELP.
Em conclusão, proteína recombinante hidrogel fabricado usando ELP oferece excepcional pré-definido da sequência da proteína e, portanto, o microambiente celular 3D. Polímeros ELP tem sido mostrado ser expressáveis em rendimentos elevados, facilmente purificados devido a seu comportamento LCST e biocompatível em uma ampla variedade de sistemas in vitro e in vivo . O uso de e. coli como um host recombinante fornece um procedimento simples e barato que dá origem a quase perfeito controle de peso molecular de polímeros e funcionalidade. Em conjunto, esta técnica permite robusto pré-definido e reprodutibilidade da plataforma de hidrogel, permitindo para a cultura de uma vasta gama de tipos de células em 3D. Finalmente, esta plataforma de hidrogel ELP é passível de muitos ensaios bioquímicos a jusante, incluindo qRT-PCR, Western blot, extração de DNA e célula immunostaining9.

Durante o século passado, cultura de tecidos bidimensional (2D) desenvolveu-se em um conjunto de ferramentas integral para estudar a célula fundamental biologia em vitro. Além disso, os protocolos relativamente barata e simples para cultura de células 2D conduziram a sua adopção em muitas disciplinas biológicas e médicas. No entanto, passado pesquisa tem mostrado que as plataformas 2D tradicionais podem levar a resultados que desviam acentuadamente aqueles recolhidos na vivo, causando o tempo precioso e financiamento desperdiçaram para pesquisa clinicamente orientada1,2, 3. Nós e os outros a hipótese que esta discrepância pode ser atribuída à falta de pistas de bioquímicas e biofísicas nativas fornecido para as células cultivadas em superfícies 2D, que podem ser necessárias para ideal proliferação e maturação dos vários tipos de células.
Para resolver essas limitações e ajuda ponte a lacuna entre 2D estudos in vitro e in vivo , os pesquisadores têm desenvolvido tridimensional (3D) hidrogel plataformas para celular-encapsulamento1,4,5 ,6. Hidrogel é materiais ideais para recapitular o microambiente endógeno da matriz extracelular (ECM) na vivo devido a suas propriedades mecânicas, como tecido e água-inchada estrutura que permite o transporte rápido de nutrientes e sinalização de fatores7,8. Além disso, 3D hidrogel pode ser projetado para ter controle independente sobre as propriedades mecânicas e bioquímicas do cadafalso. Tanto matriz mecânica9,10,11,12 e célula-adesivo ligantes13,14,15 são bem conhecidos para influenciar a célula comportamento em vitro e in vivo. Assim, 3D hidrogel com propriedades ajustáveis oferece uma plataforma para estudar as relações causais entre as células e seu microambiente. Critérios para uma matriz de hidrogel 3D ideal incluem simples, não citotóxicas célula-encapsulamento bem como pré-definido independente das propriedades mecânicas fisiologicamente relevantes e imita de motivos de célula-adesivo nativos.
Ambos sintético (EG., polietilenoglicol, ácido polilático, poli (ácido glicólico)) e naturalmente derivados (ex., alginato, colágeno, Matrigel) hidrogel têm vantagens sobre 2D em vitro plataformas de cultura; no entanto, eles também têm deficiências significativas que limitam a sua aplicabilidade. Primeiro, muitas plataformas sintéticas e naturalmente derivados exigem reticulação duras condições que podem ser potencialmente tóxicas para as células dos mamíferos, levando à diminuição de viabilidade celular7. Além disso, muitas plataformas sintéticas faltam Bioatividade nativa e precisam ser acrescida através de reações químicas secundárias, que podem adicionar o aumento de custo e complexidade16. Finalmente, enquanto materiais naturalmente derivados normalmente contêm domínios de bio-ativos intrínsecos, eles muitas vezes são atormentados pela alta variabilidade para lotes e muitas vezes limitam-se à formação de géis relativamente fraco7,17.
Engenharia de proteína recombinante apresenta um único conjunto de ferramentas para design de materiais, permitindo o controle explícito sobre a sequência da proteína e, por extensão, as propriedades mecânicas e bioquímicas potenciais de hidrogel o final do andaime18. Além disso, aproveitando as máquinas biológicas conhecidas de Escherichia coli (e. coli) que expressam proteínas, materiais podem ser produzidos a custos reduzidos e consistentemente com variabilidade limitada intere intralote. A elastina, como proteína (ELP) apresentada aqui tem três domínios de engenharia: (1) uma tag T7 e His6 que permite através de rotulagem fluorescente etiquetado anticorpos, (2) uma região 'elastina-like' que confere propriedades mecânicas elásticas e permite a química reticulação e (3) uma região 'bio-ativos' que codifica para celular-adesivo motivos.
Nossa região de elastina, como se baseia a sequência canônica de elastina5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) onde quatro do 'Xaa' sites de aminoácidos são isoleucina (Ile), mas podem ser projetado para ser qualquer aminoácido excepto prolina. Esta sequência dota ELPs recombinantes com comportamento de temperatura (LCST) solução crítica inferior que pode ser explorada para pós-expressão de purificação simples via térmica ciclismo19,20. Esta propriedade LCST pode ser ajustada para termicamente agregadas em diferentes temperaturas, modificando os comentários 'Xaa' resíduo21,22.
Aqui, a posição de 'Xaa' em uma das cinco repetições elastina-como foi substituída com o amina-apresentando lisina (Lys) aminoácido, que é utilizado para reticulação de hidrogel. Nosso trabalho anterior demonstrou não citotóxicas e robusto ligando via reação com a amina reativos crosslinker tetrakis (hidroximetil) do phosphonium cloreto (THPC)23. Pela variação total concentração da proteína conteúdo e agente reticulante, somos capazes de produzir hidrogel que pode ser ajustados para abranger uma rigidez fisiologicamente relevantes gama (~0.5-50 kPa)9,23,24. Além do ajuste de propriedades mecânicas, aderência de célula dentro o hidrogel resulta da integração dos domínios de célula-adesivo canônicas dentro a espinha dorsal da proteína ELP. Por exemplo, a incorporação da sequência de aminoácidos de 'RGDS' derivado de fibronectina estendida permite a aderência de célula e flexibilidade conformacional, enquanto os ovos mexidos, variante de 'RDGS' não-vinculativa restringe de adesão célula-matriz24. Modulando a proporção de células-adesivo para proteínas não adesivas, bem como a concentração de proteínas totais, somos capazes de produzir efetivamente hidrogel que abrangem uma vasta gama de concentração de ligante. Resultantly, desenvolvemos uma plataforma de hidrogel com propriedades bioquímicas e biofísicas dissociadas, que pode ser ajustado independentemente para cultura 3D ideal de vários tipos de células.
Além de matriz de rigidez e pré-definido de ligante adesivo, hidrogel recombinante oferece a capacidade de perfis de degradação material específico do projeto, que é necessária para a célula se espalhando, proliferação e migração dentro de um contexto 3D4 , 9. esta degradação é conferida pela secreção da célula de proteases que visam especificamente o estendido 'RGDS'9 ou sequência elastina25. Hidrogel ELP também foram mostrados para suportar os ensaios bioquímicos subsequentes que são necessários para o estudo de viabilidade celular e função incluindo imunocitoquímica, bem como a extração de DNA/RNA/proteína para reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase-transcrição (qRT-PCR) e Western blot-9. Variantes do ELP também têm sido usadas em um número de modelos na vivo e são conhecidas por ser bem tolerada pelo sistema imunológico26.
Tomados em conjunto, ELP como uma plataforma de material para estudos de célula-encapsulamento possui uma ampla variedade de benefícios em comparação com plataformas materiais sintéticas ou natural-derivado, que muitas vezes não têm o mesmo grau de bioquímico e biofísico pré-definido e reprodutibilidade. Além disso, não citotóxicas uma do ELP utilização simples e com uma grande variedade de tipos de células (por exemplo., garota raiz dorsal gânglio14,24, murino progenitoras neurais células9, tronco mesenquimal humano células27, bovinos condrócitos neonatal28, humanos endoteliais células29,30) permite a um modelo mais fisiologicamente relevante de ECM 3D endógena em comparação com a cultura de pilha 2D. Neste documento, apresentamos um protocolo para a expressão de recombinantes derivados, encapsulamento de células ELPs para o uso como uma plataforma de hidrogel ajustáveis para 3D. Ainda mais, apresentamos a metodologia para a rotulagem fluorescente de jusante e microscopia confocal de células encapsuladas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

Bidimensional (2D) cultura do tecido técnicas têm sido essenciais para o nosso entendimento da biologia das células fundamentais. No entanto, a falta de sistemas de cultura de tecido tradicional 2D uma matriz tridimensional de (3D), resultando em um significativo desconexão entre resultados coletados in vitro e in vivo. Para resolver essa limitação, os pesquisadores têm engenharia plataformas de cultura de tecidos de hidrogel 3D que podem imitar as propriedades bioquímicas e biofísicas do microambiente celular na vivo . Esta pesquisa tem motivado a necessidade de desenvolver materiais plataformas que oferecem suporte a 3D celular encapsulamento e ensaios bioquímicos a jusante. Engenharia de proteínas recombinantes oferece um único conjunto de ferramentas para design material de hidrogel 3D e desenvolvimento, permitindo o controle específico da sequência da proteína e, portanto, por extensão, as propriedades mecânicas e bioquímicas potenciais a resultante matriz. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão de recombinantes derivados como elastina proteína (ELP), que pode ser usado de forma hidrogel com propriedades mecânicas independentemente ajustáveis e concentração de ligante de célula-adesivo. Ainda mais, apresentamos uma metodologia para encapsulamento de célula dentro de hidrogel ELP e coloração imunofluorescente subsequentes de embutidos células para análise a jusante e quantificação.

Os ELPs usados no presente protocolo são compostas por cinco regiões: uma marca de T7, marca His6, local de clivagem enterokinase (EK), uma região de bio-ativo e uma região elastina (Figura 1). As tags T7 e His6 permitem fácil identificação através de técnicas de padrão ocidental do borrão. Introdução do site EK clivagem permite a remoção enzimática da região de marca, se necessário. A região de bio-ativos codifica para a estendida, derivado de fibronectina celular-adesivo ('RGDS') ou sequências não-adesivas ('RDGS'). Por último, a repetição central da região de elastina, como contém um grupo de lisina no local de resíduo de comentários que permite reticulação através de THPC enquanto as repetições flanqueando contêm isoleucina para alcançar um LCST de ~ 32 ° C31.
Expressão de post, SDS-PAGE ou borrão ocidental pode ser usado para visualizar o peso molecular e confirmar a identidade do ELPs que contêm marcas de anticorpo, como T7 (MASMTGGQQMG) ou His6 (HHHHHH) (Figura 2). Expressão bem sucedido sob condições controladas produz um produto altamente homogêneo representado pela presença de uma única banda escura com o peso molecular aproximado (~ 37 kDa) destas proteínas usando ambos os SDS-PAGE (Figura 2A) e Western blot ( Figura 2B).
Em condições não controladas, a presença de bandas de peso molecular inferiores em um Western blot sugere que alguma fração das proteínas não foi completamente traduzido e/ou foram degradadas depois da expressão (Figura 2). Especificamente, as massas aqui são espaçadas por kDa ~ 9 que corresponde, aproximadamente o peso de uma região de bio-ativo e três regiões semelhantes a elastina (uma ' Repetir'), ou aproximadamente um quarto da proteína alvo. Estes pequenos fragmentos de proteína estão geralmente presentes quando a expressão é realizada a uma temperatura mais elevada (> 32 ° C) como na Figura 2. A presença destas proteínas de peso molecular inferior pode conduzir a imprevisíveis propriedades mecânicas. Assim, rastreio regular expressão do post é recomendado para garantir um produto final de alta qualidade.
A rigidez mecânica do ELP-baseado de hidrogel pode ser modificada manipulando-se a concentração de ELP ou a relação de aminas primárias de THPC grupos reativos: ELP. Simultaneamente, a concentração de ligantes de célula-adesivo pode ser ajustada alterando-se a proporção de variantes ELP com a célula-adesivo (RGDS) para sequências de (RDGS) não-adesivas em qualquer regime de rigidez. Manipulando essas duas variáveis, nós podemos produzir géis que têm um espectro de propriedades mecânicas e concentrações de ligante (Figura 3).
Para encapsular células dentro 3D hidrogel ELP, o número desejado de células é suspensos no meio e centrifugado para produzir uma pelota de célula (Figura 4A). O meio é aspirado do tubo, e as células são re-suspensas uniformemente na solução ELP da concentração desejada. Em seguida, solução THPC é adicionada à suspensão celular/ELP e pipetada cuidadosamente para formar uma mistura homogênea. Esta solução é rapidamente transferida para moldes de silicone estéril dentro de uma placa de 24 usando uma pipeta e permitida crosslink em temperatura ambiente e 37 ° C por 15 min cada (Figura 4B). Finalmente, o meio é adicionado ao prato bem e incubado a 37 ° C no experimento.
Ao vivo/morto coloração pode ser usado para avaliar a viabilidade celular e encapsulamento de célula bem sucedido dentro ELP hidrogel. Conforme ilustrado na Figura 5, células progenitoras neurais murino adulto (NPCs) mostram a viabilidade celular alta durante 7 dias dentro de um hidrogel ELP de 3% (p/v).
Hidrogel 3D do ELP foram mostrados anteriormente para apoiar a manutenção NPC haste medida através da expressão de marcadores de proteína canônicos NPC SRY (sex-determinando a região Y)-caixa 2 (Sox2) e nestin9. NPCs encapsulados em 3% (p/v) ELP hidrogel com baixa THPC reticulação mostrar alta expressão nuclear-localizada Sox2 e filamentos citoplasmáticos de nestin via imunocoloração e imagem latente confocal (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> Figura 1 : Uma representação esquemática do ELP e sequências de aminoácido correspondente. O ELP utilizado neste estudo contém uma tag T7 e His6 para geração de imagens baseada em anticorpos, uma região Bioativo para introdução de célula-adesivo domínios e uma região de elastina, como que confere propriedades mecânicas elásticas e permite a reticulação química. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> Figura 2 : Expressão da proteína-alvo pode ser validado com SDS-PAGE e Western blot, para confirmar o peso molecular e a identidade do produto liofilizado final. ELP completo puro é executado em um peso molecular de 37 kDa, conforme relatado por SDS-PAGE (A) e Western blot utilizando o T7 (MASMTGGQQMG) ou histidina 6 marca (HHHHHH) b. (C). impuros lotes de ELP devido os desvios no protocolo expressão ELP podem levar à expressão de ELPs com menor peso molecular. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> Figura 3: Teor de ligante RGDS pode ser ajustado independentemente de propriedades mecânicas dentro ELP hidrogel. 5% (p/v) e 3% (p/v) ELP hidrogel tem módulo de cisalhamento de ~ 800 Pa e 400 ~ Pa, respectivamente. Hidrogel com uma proporção de 1:1 de aminas primárias de THPC grupos reativos: ELP foram quitosana em temperatura ambiente por 15 min, aquecido a 37 ° C e permitido equilibrar por 5 min antes da medição. Dados são média ± d.p., *p < 0,001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> Figura 4: Esquemático de encapsulamento de célula em hidrogel ELP. (A). as células são inicialmente dissociadas em uma suspensão de célula única a médio e peletizadas utilizando uma centrífuga. O meio é aspirado do tubo, e as células são re-suspensas na solução do ELP na concentração desejada e bem misturadas. Finalmente, a solução de reticulação THPC é adicionada e misturada bem. (B). imediatamente após a adição de THPC, a solução é convertida em um molde de silicone com uma pipeta. A solução é permitida crosslink em temperatura ambiente por 15 min, seguido por uma segunda incubação de 15 min a 37 ° C. O meio é então adicionado à cultura bem para a duração do experimento. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> Figura 5: Células progenitoras neurais mantêm alta viabilidade em hidrogel ELP. Imagem representativa de células progenitoras neurais encapsulado em 3% (p/v) ELP hidrogel com reticulação de 1:1 (aminas primárias de THPC grupos reativos: ELP) após 7 dias em cultura. Verde: viver coloração (calceína-AM); Vermelho: mortos coloração (homodímero de etídio). Barra de escala = 100 µm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> Figura 6 : Suporte a 3D ELP hidrogel expressão de fabricante progenitoras neurais célula tronco. Imagem de imunofluorescência de células progenitoras neurais expressando Sox2 e nestin proteínas após 7 dias de cultura em hidrogel ELP. Imagens mostram células encapsuladas em géis de 3% (p/v) ELP com 0.5:1 reticulação (aminas primárias de THPC grupos reativos: ELP). Azul: DAPI (núcleos); Vermelho: Sox2; Verde: nestin. Barra de escala = 25 µm. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K visualizações.  Stanford University. Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.

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Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Bioengenharia

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentando hidrogéis a granel e processando em hidrogéis granulares para aplicações biomédicas

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...