Os autores agradecem a todos os atuais e antigos membros do laboratório Cobb pelo valioso trabalho e discussões, e Dionne Ware pela assistência administrativa. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 para MHC

1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade 6 . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possível. <ol><li> Adicionar 2 μL de 1 mg / mL de anticorpo a 200 μL de lisados ​​celulares (geralmente ~ 1 mg / mL de concentração total de proteína) e incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balança. </li><li> Lavar as esferas de proteína Sepharose 2-3 vezes com tampão de lise (ver abaixo) por centrifugação breve a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg (&quot;spin toque&quot;), remoção do sobrenadante com uma pipeta e resuspensão de esferas em tampão . <ol><li> Preparar tampão de lise: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, ortovanadato de sï¿½io 0,2 mM, fluoreto de sï¿½io 100 mM, p-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 a 0,1% ou NP-40 a 0,1%. </li></ol></li><li> Adicionar 30 μL de pasta de 50% de pérolas de sepharose de proteína A em tampão de lise a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balançando. </li><li> Toque a centrifugação a 4 ° C para sedimentar as esferas e remova o sobrenadante. </li><li> Lavar 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem de pérolas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4). </li><li> Lavar uma vez com tampão de reacção 1x quinase (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl 2 10 mM). Remova o máximo possível de tampão sem remover as contas. </li></ol> 2. Inicializando Reações de Quinase NOTA: Para ensaios de cinase IP, ~ 15 μL de contas não suspensas é uma amostra inicial típica. Para ensaios de proteína quinase recombinante, as quantidades de partida típicas variam de 0,1-1,0 μg em 1-10 para 25-50 μL de volumes de reacção final. Ajustar os volumes da amostra de proteína recombinanteS para serem iguais com o tampão que são armazenados antes da inicialização do ensaio. Quando se utilizam quantidades elevadas de quinase, incluir uma proteína transportadora tal como BSA para auxiliar na manutenção da estabilidade da proteína durante a duração do ensaio. <ol><li> Preparar o tampão de reacção quinase 5x indicado abaixo: HEPES 50 mM pH 8,0 MgCl2 50 mM 50 mM de Benzamidina (inibidor de protease) DTT 50 mM (agente de redução) 250 μM de ATP (não marcado, ou &quot;frio&quot;) </li><li> Manter amostras de cinase em gelo em tubos de 1,5 mL. Preparar a seguinte mistura reaccional em tubos separados de 1,5 mL arrefecidos: 21 μL de H2O 6 μL de tampão de reacção quinase 5x 1 μL de ATP marcado radioactivamente (&quot;quente&quot;) 2 μL de substrato (~ 5 mg / mL) NOTA: Para ensaios de cinase recombinante, o volume pode ser ajustado para acomodar a proteína purificada. Calcular tal que o volume final da reacção seja de 30 μL. Use esta receita para preparar um mestremisturar. Após a recepção do ATP marcado, diluir o stock em H2O para uma actividade específica de 0,01 mCi / mL antes da adição à mistura reaccional. </li><li> Para inicializar o ensaio, adicionar toda a mistura de reacção à amostra de quinase e incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependendo da actividade da quinase a ser ensaiada. NOTA: Quando se trabalha com uma quinase cuja actividade não foi previamente ensaiada, execute um curso de tempo de actividade de quinase com intervalos de 5 minutos entre os pontos de tempo. </li></ol> 3. Terminação da Reação e SDS-PAGE <ol><li> Parar a reacção colocando em gelo e adicionando 7,5 μL de tampão de amostra Laemmli 5x 6 . </li><li> Aquecer a 100 ° C durante 30 s a 2 min em bloco de calor. </li><li> Toque em rotação e carregue 20 μL por poço em gel SDS-PAGE a 10-15%. Executar o gel o tempo suficiente para separar a cinase eo substrato (tipicamente 1 h a potência constante de 5 W) Certifique-se de manter o aparelho de gel blindado para limitar a exposição a 32 </suP&gt; P. <ol><li> Aqui, use aparelhos de gel caseiros, mas mini-géis padrão comercialmente disponíveis são perfeitamente adequados. Use as dimensões da seguinte forma: Géis: 8 cm de largura, 5,5 cm de comprimento (resolução), 1,5 mm de espessura. Combs: 15 poços, espessura de 1,5 mm, 2,9 mm de largura, 16 mm de profundidade </li></ol></li></ol> 4. Gel de coloração e secagem Cuidado: Para todas as etapas, certifique-se de reduzir a exposição pessoal a 32 P usando blindagem radioativa e usando equipamento de proteção pessoal. Para obter mais informações sobre etapas específicas, algumas referências úteis são incluídas. <ol><li> Remover o gel das placas de vidro / alumina e colocar em 50 mL de mancha de Coomassie (10% de ácido acético glacial, 50% de metanol, 0,25% de corante R-250) durante 1 h num agitador orbital ajustado para 50 rpm. Para este passo use um recipiente que é ligeiramente maior do que o próprio gel. 8 </li><li> Mova o gel da mancha para a solução fixadora (10% de ácido acético glacialD, 20% de metanol) a fim de desidratação. Rocha do gel em 600-700 mL de solução de fixação durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm. Coloque pedaços de espuma ou toalhetes de laboratório atados no recipiente com o gel para absorver o corante Coomassie 8 , 9 . </li><li> Remover o gel da solução de fixação e mergulhar em 200 ml de metanol durante 1-2 minutos com agitação suave até que o gel se torne branco leitoso. Isto ajudará a evitar a fissuração durante o passo de secagem. </li><li> Molhar um pedaço de 14 cm x 14 cm de papel de filtro qualitativo com metanol e colocar em secador de vácuo de gel de laje. Coloque o gel para baixo na face frontal do papel de filtro voltada para cima. </li><li> Cubra o gel com filme plástico cuidadosamente para evitar rugas e bolhas de ar. Executar o secador durante 1,5 h a 80 ° C. Depois que o vácuo foi alcançado abra a tampa e role para fora todas as bolhas de ar se necessário com um brayer macio da borracha. </li></ol> 5. Autoradiograma e contagens de cintilação <ol><li> RemovaEd gel e anexar um marcador autorad, régua fosforescente ou pontos para o papel de filtro no lado do gel. Se estiver usando pontos, certifique-se de que eles estejam em um padrão assimétrico. Isto irá alinhar o gel com o filme após exposição e desenvolvimento. </li><li> Use um contador Geiger para verificar a intensidade do sinal. Para sinais mais fracos, a exposição a -70 ° C a -80 ° C com um ecrã de intensificação aumentará a densidade da banda do filme. </li><li> Em uma sala escura, coloque o gel seco em uma cassete de filme com filme e uma tela intensificadora na seguinte ordem de cima para baixo: gel, filme, tela intensificadora. </li><li> Conecte a tela de intensificação à tampa da cassete e fita o gel no lugar para fazer este passo mais fácil. A tela de intensificação emite luz quando irradiada pelas partículas beta das 32 P. Estas emissões de luz penetram a película mais eficientemente do que as partículas beta. <ol><li> Certifique-se de que o comprimento de onda emitido peloLagoas para um comprimento de onda o filme é mais sensível a. </li><li> Use um contador Geiger para determinar quanto tempo para deixar a exposição para: se contagem cpm é ~ 100 ou abaixo, tente durante a noite a -70 ° C. Se a contagem for ~ 10.000, comece com uma exposição de 1 h e otimize a partir daí. </li></ol></li><li> No final da exposição remova a película e desenvolva-se em um processador de filme médico / de raios-X. Se a exposição foi realizada a -70 a -80 ° C, deixe a cassete aquecer até à temperatura ambiente para minimizar a condensação na película ou remover a película imediatamente antes da formação da condensação 10 . </li><li> Colocar o filme sobre o gel / papel de filtro seco e alinhar a imagem do marcador / pontos com os marcadores / pontos no gel seco. Marcar no filme as bandas correspondentes aos padrões de proteína. Rotular os padrões de proteína e quais pistas as reações são para referência futura. </li><li> Excise as faixas do gel que correspondem às bandas de interesse no filme e colocá-losEm 7 mL de frascos de cintilação. Adicionar 4 mL de fluido de cintilação e contar com contador de cintilação líquida. Confirme se o contador está configurado para monitorar a janela correta do espectro de energia para 32 P. NOTA: Certifique-se também de excluir a banda correspondente ao substrato da pista de controle de não quinase. Isto será utilizado para calcular a radiação de fundo que será subtraída de todas as contagens de cintilação da amostra. </li></ol> 6. Análise dos Resultados NOTA: O autorradiograma fornece uma visualização qualitativa dos resultados. Para uma quantificação precisa, a incorporação de 32 P pode ser medida com um contador de cintilação. Os dados são usualmente expressos em termos de actividade relativa, como mostrado na Figura 1B . Enquanto as condições uniformes forem mantidas para todas as amostras, medições relativas de actividade específica são suficientes para comparar tratamentos. <ol><li> Ao calcular valores absolutos de atividade específica, execute um rigorOtimização de todas as condições de reação, incluindo cinase, substrato e concentrações de ATP fria, a fim de assegurar um intervalo linear de atividade ao longo do tempo ( ex. 2 x [quinase] = 2 x atividade específica). Para quinases com elevada actividade específica, efectuar ensaios com aumento da concentração de substrato, caso a actividade de quinase seja limitada pela quantidade de substrato. </li><li> Calcular a actividade específica da quinase de interesse em unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de cinase. <ol><li> Subtraia os espaços em branco das cpm nas faixas contadas. </li><li> Calcula a decaimento do ATP quente: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0,95 onde t é o número de dias desde a data de referência (deve ser fornecido pelo fornecedor), t 1/2 é o Meia-vida de 32 P, que é de 14,3 dias, e 0,95 reflecte a eficiência do contador de cintilação. Exemplo: se estiver usando ATP quente com 28 dias de idade, o valor de decaimento deve ser 0,245. </li><li> Calc(Pmol) de ATP total no ensaio (usualmente isto é igual à quantidade de ATP frio na reacção): volume de ensaio (μL) x [ATP fria] (μM) = ATP total (pmols). Exemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> Calcular cpm / pmol ATP: [μL de ATP quente x (2,2 x 10 7 ) x factor de decaimento] / pmol de ATP frio. NOTA: O valor de 2,2 x 10 7 converte 0,01 mCi / μL de ATP em cpm. </li><li> Calcular a quantidade de cinase no ensaio em mg. Para quinases recombinantes e quinases imunoprecipitadas, os métodos padrão tais como os ensaios BCA são adequados para determinar as concentrações iniciais. Exemplo: wtERK2 0,0002 μg / μL numa reacção de cinase de 50 μL é 0,01 μg, ou 1 x 10 -5 mg. </li><li> Calcular o cpm total no ensaio. Reúna 30 μL de reações e administre 20 μL de cada reação em um gel. Multiplicar as cpm contadas (após subtracção em branco) por um factor de volume total de ensaio / volume carregado. Continuando oExemplo, multiplique todas as contagens por 1,5 ou 30/20. </li><li> Calcular a actividade específica da cinase ensaiada: Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo de ensaio em minutos) / (quantidade de quinase em mg) NOTA: A divisão do valor acima em 1000 produz a actividade específica em nanomoles / minuto / mg </li></ol></li><li> Calcular quantos mols de fosfato são incorporados num substrato (desde que o seu peso molecular seja conhecido). Isto é usado para determinar o número de fosfositos numa proteína particular depois de a reacção ter terminado. Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantidade de substrato em pmoles) </li></ol>

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	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As quinases são uma família diversificada de proteínas que desenvolveram extensa funcionalidade em numerosos contextos e os ensaios de quinase têm sido extremamente úteis no estudo de várias proteínas de sinalização e têm contribuído muito para a nossa compreensão atual da comunicação celular. Notavelmente, o mesmo ensaio básico foi utilizado na caracterização de duas cinases diferentes, apesar das grandes diferenças de estrutura e actividade. A quinase WNK1 contém uma bolsa catalítica atípica em que a lisina crítica se deslocou para uma posição única e é conhecida por desempenhar papéis na regulação de cotransportadores de catião-cloreto através de funções de cinase e andaimes. A actividade de quinase de WNK1 é conhecida por ter um número de rotação baixo, mesmo nos seus substratos melhor caracterizados, a quinases ricos em alanina de prolina (SPAK) relacionada com o SPS / STE20, que responde ao stress oxidativo 1 (OSR1) e proteína cinases. Em contraste, ERK2, juntamente com a estreitamente relacionada cinase ERK1, exibe atividade de quinase robusto quando ativado <eM&gt; in vitro e é conhecido por fosforilar sobre cem substratos nas células 13 , 14 . O aspecto mais crítico do ensaio é a montagem da reacção. A fim de fazer medições precisas ponto de tempo, deve ser dada especial atenção à inicialização de reações de quinase. Existem quatro requisitos básicos para um ensaio de cinase proceder: cinase, substrato, ATP e um ião metálico. Para este protocolo, que é utilizado principalmente para cinases eucarióticas, MgCl2 é utilizado como uma fonte de magnésio. Tanto as preparações de proteína quinase recombinante como as de quinase IP contêm tipicamente magnésio, tornando MgCl2 insuficiente como iniciador de reacção. Do mesmo modo, a adição de ATP não marcado (&quot;frio&quot;) antes da adição de ATP marcado (&quot;quente&quot;) pode iniciar uma reacção inadequadamente precoce. Recomenda-se a preparação de reacções utilizando um tampão de reacção de quinase concentrada que facilita a adição simultânea de MgCl <suB&gt; 2, ATP quente e frio e substrato. No caso da medição da actividade de autofosforilação, a adição combinada de magnésio e ATP pode ser utilizada para iniciar reacções. Em todos os casos, as amostras devem ser preparadas em gelo e imediatamente transferidas para um banho de água a 30 ° C, uma vez que as reacções são montadas. É também importante incluir uma reacção de controlo sem quinase para determinar se o sinal de fundo interferirá com os resultados. Pode ser necessário solucionar vários parâmetros do ensaio, incluindo tempo, temperatura e conteúdo do tampão. O número de amostras que podem ser processadas de uma só vez é limitado ao número de poços SDS-PAGE géis, que é suficientemente elevado para eficazmente tela condições diferentes. Conforme mencionado anteriormente no protocolo, recomendamos iniciar experiências piloto com um período de tempo antes de passar para testar outras condições de reação. Embora exista alguma distinção entre ensaios de quinase IP e ensaios de proteína quinase recombinante, tO paradigma experimental comum a ambos demonstra quão versátil este ensaio pode ser. De facto, existem casos em que as características de ambos os tipos de ensaio de cinase podem ser misturadas, tal como com estudos sobre a via de sinalização de proteína quinase activada por mitogénio / sinal de quinases reguladas por sinal extracelular (MAPK / ERK). Nesta via, ERK1 / 2 são activados por dupla fosforilação pelo factor de montante MAPK / ERK quinase 1 (MEK1). Estudos anteriores demonstraram que enquanto MEK1, bem como um mutante constitutivamente activo denominado MEK1R4F, é capaz de activar ERK1 / 2, que possui uma actividade muito baixa em relação a MBP. Consequentemente, o ERK1 / 2 purificado a partir de células bacterianas exibe actividade de quinase limitada em relação a MBP, a menos que tratado com MEK1R4F, criando uma plataforma robusta para comparar a actividade de quinase de ERK1 / 2 de tipo selvagem a construções mutantes, como mostrado na Figura 2 . A inclusão de componentes imunoprecipitados pode adicionar ainda mais nuance, destacando o ensaio de cinase como um método altamente adaptável para sondar o nDessas importantes moléculas de sinalização. Embora alguns possam achar que o trabalho com materiais radioativos é incómodo, a capacidade de análise quantitativa do ensaio de cinase radiomarcado é uma de suas principais vantagens. No entanto, avanços recentes nos campos da química de produtos naturais, genômica e espectrometria de massa criaram uma demanda por ensaios de quinase modificada Com leituras mais passíveis de aplicações de alto rendimento 15 . Uma vez que estes ensaios tiram vantagens de diferentes materiais de marcação, são feitos compromissos em termos de precisão, mas estes podem ser superados utilizando um ensaio radiomarcado para validar os resultados da pesquisa. À medida que nossa compreensão da sinalização de proteína quinase aumenta, permanece claro que as técnicas capazes de extrair os detalhes das funções de regulação de quinase continuarão a auxiliar no desenvolvimento de ferramentas e terapias.

As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas 1 . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença 2 , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica 3 . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular 4 , um ensaio de cinase permite medir os efeitos de diferentes condições de tratamento directamente em termos da actividade enzimática de uma cinase de interesse. Embora existam várias opções para ensaios semelhantes que não utilizam materiais radioactivos 5 , continuamos a depender deste método para uma quantificação robusta dos resultados. LáSão duas aplicações típicas deste ensaio, ambas valiosas por razões diferentes: o ensaio de quinase imunoprecipitado (IP) ( Figura 1 ) e o ensaio de proteína quinase recombinante ( Figura 2 ). O ensaio de quinase de IP é tremendamente útil para identificar factores capazes de activar cinases de proteína específicas, bem como avaliar as condições de tratamento inibitório. Resumidamente, uma quinase marcada com epítopo de interesse é transfectada em células eucarióticas cultivadas, submetida a uma variedade de tratamentos, imunoprecipitada e ensaiada quanto à capacidade de incorporar fosfato radiomarcado num substrato modelo ( por exemplo, proteína básica de mielina (MBP)). O ensaio de quinase de IP pode também ser realizado sem recorrer à sobre-expressão, quer por imunoprecipitação de proteína endógena ou qualquer número de técnicas de edição genómica. Uma vez que os tratamentos são administrados em cultura, este método pode detectar estimulações transmitidas através de múltiplos factores a montanteOu paralelas por leitura in vitro . Uma grande vantagem deste método é que não requer conhecimento prévio de factores directos a montante ou a jusante ou sítios de fosforilação. Além disso, uma vez identificados substratos específicos para uma quinase de interesse, o mesmo protocolo de ensaio de cinase pode ser utilizado com componentes recombinantes para medir actividade específica em relação a substratos naturais e identificar locais de fosforilação específicos quando combinados com análise de espectrometria de massa. Os locais identificados desta maneira podem ser ainda validados com ensaios de quinase utilizando mutantes de substrato. Por último, este método também pode ser utilizado para detectar e medir a autofosforilação. O protocolo proporcionado aqui pressupõe um esquema de purificação de proteínas optimizado ou método de transfecção para expressar uma cinase marcada por afinidade de interesse em células cultivadas. Para exposições mais detalhadas de transfecção, lise, imunoprecipitação e protOcols, sugerimos referir-se a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obter mais informações sobre o desenvolvimento e modificação do ensaio, consulte a Fosforilação de Proteínas: Métodos Selecionados na Enzimologia 7 .

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

As cinases proteicas são capazes de governar mudanças celulares em grande escala em resposta a complexas matrizes de estímulos, e muito esforço tem sido direcionado para descobrir detalhes alostéricos de sua regulação. As quinases compreendem redes de sinalização cujos defeitos são frequentemente marcas de múltiplas formas de cancro e doenças relacionadas, tornando uma plataforma de análise passível de manipulação de factores reguladores a montante e validação de requisitos de reacção críticos na procura de terapêuticas melhoradas. Aqui, descrevemos um ensaio de quinase básico que pode ser facilmente adaptado para se adequar a questões experimentais específicas incluindo, mas não se limitando a, testar os efeitos de agentes bioquímicos e farmacológicos, manipulações genéticas tais como mutação e deleção, bem como condições de cultura de células e tratamentos para sondar Mecanismos de sinalização celular. Este ensaio utiliza [γ- 32 P] ATP radiomarcado, que permite comparações quantitativas e uma visualização clara dos resultados, e pode ser modSe para utilização com quinase imunoprecipitada ou recombinante, substratos específicos ou tipificados, numa vasta gama de condições de reacção.

Ensaios de quinase WNK1 IP O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc 11 . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando construções marcadas com GST ( Figura 1B ). A análise do comportamento da quinase mutante relativamente ao tipo selvagem revelou resíduos críticos para a actividade óptima de WNK1. As células HEK293 foram expostas a um painel de tratamentos farmacológicos e bioquímicos. Utilizando um anticorpo criado contra um péptido WNK1 N-terminal, a actividade de quinase WNK1 endógena imunoprecipitada foi ensaiada utilizando MBP como substrato. O factor de crescimento epidérmico (EGF), umOu da sinalização ERK1 / 2, o nocodazol, um fármaco que tem como alvo a dinâmica dos microtúbulos, a anisomicina, um inibidor da tradução eucariótica eo ácido lisofosfatídico (LPA), um potente mitogénio, foram todos incapazes de provocar um aumento robusto na PAM fosforilada. Em contraste, o NaCl foi demonstrado ser um regulador da actividade da quinase WNK1. Ensaios de proteína quinase de ERK2 recombinante O ERK2 de rato portador de um marcador 6His N-terminal foi expresso em células bacterianas e purificado por afinidade com resina de níquel 12 . A proteína foi ainda purificada por cromatografia de permuta iónica numa coluna MonoQ, em que várias fracções de eluição foram testadas quanto à actividade de quinase ( Figura 2A ). Uma vez que ERK2 requer fosforilação dupla por MEK para atingir a actividade de quinase máxima, o ERK2 purificado de bactérias na ausência de MEK é largamente inactivo. Portanto, para testar frações de recomBinant ERK2 para actividade em relação a MBP, uma forma constitutivamente activa de MEK1 denominada MEK1R4F foi incluída nas reacções de quinase. Nomeadamente, o MEKR4F não possui actividade de quinase elevada na MBP ( Figura 2 ). Utilizando um ensaio semelhante ao ilustrado na Figura 2A , utilizou-se uma actividade de quinase MBP para medir a actividade de mutantes de ERK2 recombinantes purificados a partir de culturas bacterianas relativamente à proteína de tipo selvagem ( Figura 2B ). Embora o ERK2 seja capaz de fosforilar MBP quando estimulado por MEKR4F, a mutação tanto da lisina catalítica (K52R) como de uma treonina proximal aos sítios canónicos de fosforilação dupla (T188D e T188E) drasticamente abroga a actividade da quinase ERK2. ERK2-T188D e ERK2-T188E exibem actividade de quinase marginal em direcção a um péptido pequeno e flexível ( Figura 2C ), no entanto, são incapazes de fosforilar fortemente os substratos ERK2 conhecidos Nup153 e PDX1 ( Figura 2<html> D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55504/55504fig1.jpg" /> Figura 1: Ensaios de quinase de imunoprecipitação de WNK1. ( A ) as cï¿½ulas HEK293 foram transfectadas quer com pCMV5-Myc sem uma inserï¿½o ou com pCMV5-Myc-WNK1, as proteï¿½as marcadas foram imunoprecipitadas com o anticorpo anti-Myc seguido de ensaios de quinase utilizando MBP como substrato. A autorradiografia é mostrada à esquerda e uma imunotransferência dos imunoprecipitados à direita. ( B ) Foram utilizadas várias proteínas mutantes GST-WNK1 em ensaios de cinase com MBP como substrato; A fosforilação de MBP é expressa como actividade relativamente ao WNK1 de tipo selvagem. ( C ) WNK1 endógeno foi imunoprecipitado a partir de células HEK293 tratadas com vários estímulos e ensaiado quanto à autofosforilação. Esta figura foi modificada a partir de Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55504/55504fig2.jpg" /> Figura 2: Ensaios de proteína quinase recombinante de ERK2. ( A ) Utilizaram-se fracções purificadas de ERK2 de uma coluna de permuta aniónica MonoQ num ensaio de quinase com MBP na presença ou ausência de MEK1R4F, um estimulador constitutivamente activo da actividade de quinase ERK2. ( B ) Os mutantes de ERK2 foram testados quanto à actividade de quinase em MBP. ( C ) Os mutantes de laçada de activação ERK2-T188D e ERK2-T188E exibem actividade de quinase marginal em direcção a um substrato de péptido tipificado pequeno. ( D ) Comparação das actividades de cinase ERK2 ou T188D após activação por MEK1R4F com substratos ERK2 conhecidos nucleoporina-153 (Nup153) e homeobox 1 pancreática e duodenal (PDX1). Os substratos fosforilados são denotados por cunhas e fosforilaERK2 e T188 por asteriscos. Reimpresso (e modificado) com permissão de McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55504/55504fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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Nanyang Technological University

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Biochemistry

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SCIENTISTS IN ACTION

18.3K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center.  As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular. 

Vídeo: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Bioquímica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biologia

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Resumo

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