American Heart Association [15GRNT25700209] suporte J.C. e com um prêmio de desenvolvimento de carreira do departamento de assuntos de veteranos [BX002797] suporte L.E.W. e o National Institutes of Health [R01-DK095867] O National Institutes of Health [DK093660], departamento de assuntos de veteranos [BX002190] e o centro de Vanderbilt para doença renal com suporte M.H.W. Este material é o resultado de trabalho apoiado com recursos e utilização das instalações do sistema de cuidados de saúde VA Tennessee Valley.

<ol>
	<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li><li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent.">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li><li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles.">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li><li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery:+conclusion+of+a+comparative+study.">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar e não declarar nenhum conflito de interesses.

Neste protocolo é descrito um método robusto para atingir a expressão do gene pode ser reproduzido especificamente no rim. Nas mãos de um cirurgião experiente moderadamente encontramos a porcentagem de ratos transfectadas por esta técnica para estar na faixa de 50-100%, dependendo da idade do rato e a sensibilidade da leitura do transgene. O nível de expressão do gene do luciferase foi acima do fundo por vários meses em ratos recebendo piggyBac transposões e completamente mantido por várias semanas em ratos imunodeprimidos, recebendo a mesma transposões11. Enquanto muitas células coradas brilhantemente para o transgene em áreas perto do local da injeção, a eficiência global de transfecção foi relativamente baixa (Figura 3D). O material mais importante para alcançar o resultado desejado é a seringa de injeção em si. Isto deve ser uma seringa de insulina 29 x ½" com uma agulha fixa e nenhum segurança para impedir a injeção. A injeção deve ser rápida, dentro de três s. A preparação de DNA de plasmídeo deve ser pura, com baixíssima endotoxinas e DNA genômico bacteriano níveis19.
É concebível que injeções de outras substâncias, tais como vírus, RNA ou proteína, podem ser feitas de maneira semelhante. A pelve renal era superior como uma rota de entrada para outros sites de injeção testada, como a veia renal ou injeção direta do parênquima renal. Aquelas injeções levaram ao sangramento e menor expressão de gene11. Porque a pelve renal é uma estrutura elástica que às vezes exigida para manter o refluxo de urina, pode ser melhor capaz de esticar e acomodar a agulha. Vazamento de urina do buraco criado pela seringa de insulina ou de solução de DNA não foi observado, sugerindo que a pelve renal é reparada rapidamente. O mecanismo exato pelo qual o fluido injetado transfects o rim não tem sido estudado em profundidade, como tem para o fígado, por exemplo. Estudos de microscopia de elétron futuro podem elucidar este mecanismo ainda mais. A natureza retrógrada da injeção tem precedência, em que o método de injeção de veia de cauda hidrodinâmica inverte o fluxo da veia hepática20 e outros métodos bem sucedidos do transfection rim tem injetado através da veia renal12, 13 , 14 , 21. lesão renal é provavelmente necessário para eficiência ideal do transfection então nós hypothesize que transfeccao ocorre através de danos à membrana celular causada pela injeção rápida, alto volume. Os podócitos, túbulos e dutos de coletando têm interface direta com o espaço urinário como sua principal função é filtrar e concentrar a urina.
Embora reproduzíveis e específicas do rim, este método é limitado pela eficiência do transfection relativamente baixo observada (Figura 3D). Injeção hidrodinâmica pelve renal não é um substituto para a criação de um animal transgênico, dirigindo o transgene de um promotor de rim-específico, em que cada célula de um determinado subtipo no animal expressaria o gene de interesse. Prefiro este método é melhor adaptado para abordagens de transferência do gene para as doenças em que um pequeno número de células corrigidas teria um efeito dramático sobre o fenótipo, por secreção de hormônios ou outras substâncias normalmente produzidas pelos rins ou para a criação de um população de células raras que irá exercer algum efeito positivo sobre o rim para reparar ou regenerar isso. Como alternativa, ele também pode ser usado no caminho oposto para desenvolver um novo modelo de lesão renal através da introdução de um transgene com uma influência negativa.

A técnica de injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se uma forma comumente usada para alcançar altos níveis de expressão gênica em rato fígado1,2. Os rins também são transfectados por esta técnica em um nível muito inferior, aproximadamente 100 vezes menos3. A injeção hidrodinâmica pelve renal descrita aqui fornece uma maneira simples de controlar a especificidade da expressão do órgão através de meios físicos, usando os mesmos princípios hidrodinâmicos que foram criados anteriormente no fígado4,5 , músculo6e outros órgãos de7,8. Esse método transfects células em animais vivos na vivo por meio de pressão e velocidade para forçar o fluido contendo DNA dentro das células, induzindo simultaneamente danos ao órgão que é rapidamente resolvido9. Usando técnicas cirúrgicas bem estabelecidas para visualizar o rim através de uma incisão de flanco10 juntamente com uma única injeção por seringa de insulina, temos encontrado sucesso transfeccao de vários tipos de células de rim, principalmente fibroblastos intersticiais, túbulos e coleta de duto de11. Dissecação destes ratos mostrou que outros órgãos não são transfectados em níveis altos o suficiente para visualizar por luciferase de imagem técnicas11. Uma vez que a técnica é não-virais, uso do plasmídeo para transfeccao permite rápida e fácil a preparação dos reagentes necessários para a injeção.
Nós usamos injeções localizadas de hidrodinâmicas para expressar a antioxidante Glutationa S-transferase A4, o receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina e a eritropoetina hormônio nos rins, tudo com os esperados efeitos biológicos11, 12 , 13. uma avaliação detalhada da via de administração, o volume de injeção, dosagem de DNA e escolha do promotor tem sido realizadas11. Além disso, ambos o piggyBac transposon sistema e/ou ciclofosfamida tratamento para suprimir a reação imune para o transgene foram mostrados para melhorar a longo prazo gene expressão resultados11. Outros pesquisadores usaram uma abordagem da veia renal em ratos com sucesso, alcançar a eficiência elevada do transfection por períodos de tempo superiores a um mês14. No entanto, correção genética dos fenótipos imitando doenças humanas geralmente são realizadas em ratos primeiro como um prova de conceito desde modelos genéticos mais mamíferos são modelos de rato. Nós em comparação a veia renal de injeção para injeção da pelve renal e descobriu que a injeção na pelve renal era superior da veia renal para expressão gênica (aproximadamente dez vezes maior) e sobrevivência11. A pelve renal é uma rota ideal de entrada para o rim porque é flexível o suficiente para tolerar variações de produção de urina e muitas vezes é capaz de manter sua integridade estrutural, mesmo quando dilatadas durante hidronefrose. Além disso, injeção na pelve renal permitiu acesso ao rim sem perfurar a cápsula renal, permitindo que o fluido injetado ser visivelmente mantido pelo rim melhor que injeção difuso. Outros órgãos do rato não tem uma rota de entrada diferente da vasculatura, mas o espaço urinário do rim é um local de injeção ideal. Além disso, a injeção na veia renal resultou em vazamento de sangue na cavidade abdominal. Estimou-se o volume total do rim dos rins do selvagem-tipo rato por ressonância magnética para ser aproximadamente 0,2 cm3, então o volume de um único rim é aproximadamente igual à quantidade de fluido injetado pela pelve renal hidrodinâmico injeção (100 µ l)15. Aqui, disponibilizamos todas as nuances detalhadas do protocolo de injeção hidrodinâmica pelve renal para alcançar a transfeccao reprodutível do rim.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AnaSed Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td>Anesthetic - Not controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>309306</td>
			<td>Required syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td>Pharmacist/Veterinarian</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia - Controlled Substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Disposable Towel Drape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19-310-671</td>
			<td>Place over heat pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Use only endotoxin-free plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>PC200</td>
			<td>Positive control for endotoxin test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>R13500</td>
			<td>Endotoxin test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-51</td>
			<td>For autoclaving surgical tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar Heat Pump</td>
			<td>Paragon Medical</td>
			<td>TP-700</td>
			<td>Water-circulating heat pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>DS-401</td>
			<td>To reuse surgical tools during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Tissue Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder, 5&#34; Length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-7841</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pads - 15&#34; x 21&#34; - need at least 3</td>
			<td>Paragon Medical</td>
			<td>TP22G</td>
			<td>For use with Gaymar Heat Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott Animal Health</td>
			<td>5260-04-05</td>
			<td>For imaging and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>VCT3K2</td>
			<td>For imaging and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pharmacist/Veterinarian</td>
			<td></td>
			<td>Anesthetic - Controlled Substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122796</td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000-US-CAN</td>
			<td>Spectrophotometer for DNA measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prevantics Swabs</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-100-110</td>
			<td>For skin surgery prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0 sutures Taper 30&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0256891</td>
			<td>Non-absorbable sutures for skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Brand Opthalmic Ointment</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-888-2572</td>
			<td>To keep eyes moist during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR-5240</td>
			<td>Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 Sutures J303H</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9816710</td>
			<td>Absorbable sutures for muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Mini Arco Clipper</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>8787-1550</td>
			<td>Shaver for skin prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney

Injeção hidrodinâmica cria um ambiente local, de alta pressão para transfect vários tecidos com o Plasmídeo e outras substâncias. Injeção de veia de cauda hidrodinâmica, por exemplo, é um método bem estabelecido, pelo qual o fígado pode ser transfectado. Este manuscrito descreve uma aplicação dos princípios hidrodinâmicos pela injeção do rim do mouse diretamente com plasmídeo para expressão de genes específicos do rim. Os ratos são anestesiados e o rim é exposto através de uma incisão de flanco, seguida por uma injeção rápida de um plasmídeo que contém ADN solução diretamente na pelve renal. A agulha é mantida no lugar por 10 segundos e o local da incisão é suturado. No dia seguinte, ao vivo de imagem animal, borrão ocidental, ou imuno-histoquímica pode ser utilizado para ensaiar a expressão do gene ou outros ensaios adequados para o transgene de escolha são utilizados para a detecção da proteína de interesse. Métodos publicados para prolongar a expressão gênica incluem tratamento de integração e ciclofosfamida mediada por transposon transgene para inibir a resposta imune para o transgene.

A técnica de cirurgia e injeção são simples para executar uma vez dominado, exigindo sem grandes equipamentos ou materiais caros. Se novo para cirurgia de rim de flanco-incisão, um dia de treinamento em vários ratos agendada para eutanásia devem em que os ratos não são recuperados de cirurgia seguir porque a primeira tentativa desta cirurgia pode levar muito mais tempo do que o normal. Alternativamente, os investigadores familiarizados com técnicas similares podem achar bastante simples. Siga atentamente a ilustração na Figura 1 e as direções pictóricas na Figura 2. Para colocar correctamente a incisão, o cirurgião pode usar os dedos para empurrar no estômago do rato enquanto põe de lado. O rim é visualizado por um pequeno caroço que nasce próximo a coluna vertebral com ligeira pressão abdominal, e a incisão deve ser feita sobre esta área (Figura 1 e Figura 2). É importante fazer a incisão através das camadas de pele e músculo, o tamanho correto (Figura 1). Se a incisão for muito grande, o rim irá deslizar volta na cavidade abdominal facilmente, dificultando a injeção. Se a incisão for muito pequena, será difícil empurrar o rim fora da cavidade abdominal e podem ocorrer danos nos órgãos. Outro ponto importante é a colocação da agulha na pelve renal. O cirurgião deve empurrar o rim para baixo com a pinça fechada, em seguida, insira a agulha na pelve renal em um ângulo paralela à superfície de trabalho tais que a maior parte do volume de injeção vai directamente para o parênquima renal (Figura 2). É importante que a injeção seja realizado o mais rapidamente possível para induzir a pressão hidrodinâmica necessária para transfeccao de rim.
Ratos de estirpes diferentes, idades, pesos e/ou sexo terá diferenças na posição do rim e quantidade de gordura ao redor do rim, assim alguns ajustes podem ser necessários para trabalhar com os ratos de interesse. A primeira tentativa cirúrgica do qual são recuperados os ratos deve conter, se possível, uma leitura imediata da expressão de genes específicos do rim, como luciferase de imagem (Figura 3A). Se forem utilizados ratos jovens, o resultado esperado é que todos os ratos terá um brilho que está dentro de uma ordem de magnitude (Figura 3B). Ocasionalmente, mesmo depois de uma segunda injeção de luciferina, é aparente por imagem que um mouse ou ratos não conseguiram se tornar transfectadas a um nível comparável aos outros ou que alguns ratos injetados são completamente carentes de expressão gênica. Esses ratos podem ser excluídos do estudo devido a falha do transgene entrega. Se muitos dos ratos não têm expressão gênica, em seguida, o cirurgião deve diminuir o tempo de injeção da solução de DNA. Falha para induzir os danos necessários através da alta pressão da injeção é o culpado mais provável para consistente falta de expressão gênica. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizada cirurgia seguir para potenciais problemas de saúde (ver tabela 1 para potenciais problemas de saúde com soluções de acompanhamento e consulta com a equipe de veterinários da instituição, se necessário). Após um período de formação inicial, a cirurgia em si deve levar menos de 10 min. O período cirúrgico deve ser feito tão curto quanto possível, operando em um mouse ao mesmo tempo para evitar a desidratação dos tecidos durante a cirurgia. Maior parte do investimento de tempo neste procedimento é devido à indução de e recuperação a partir da anestésica cetamina/xilazina. Dois profissionais experientes trabalhando como um time devem esperar para realizar cirurgias até dez por dia, com quinze anos como um máximo razoável.
Os investigadores devem esperar um baixo número de células a mancha altamente positiva para o transgene dentro os primeiros dias após a injeção. Estas células positivas serão localizadas em patches adjacentes a áreas onde o fluido de injeção se infiltrou o rim (Figura 3-D). Algumas partes do rim será completamente negativos para células transfectadas. Tais áreas negativas também será desprovido de hemácias e tem histologia completamente normal, desde que a injeção não chegou a estas áreas. Promotores e protocolos de coloração deve ser otimizada com cuidado para capturar a expressão gênica. Os investigadores devem esperar que a célula tipos transfectados será variável, os níveis de expressão de gene dentro a baixa percentagem de células transfectadas são elevados, e a localização das proteínas dentro das células não pode ser como esperado devido aos altos níveis de expressão (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56324/56324fig3.jpg"> Figura 3. Injeção hidrodinâmica pelve renal resulta na expressão de genes específicos do rim de luciferase e TdTomato. (A) FVB 7-8 semana velhos camundongos machos receberam injeções de hidrodinâmica pelve renal de 20 µ g de pTEeL, um plasmídeo expressando reforçada luciferase de vaga-lume, o promotor EF-1 α. Ratos, 2, 3 e 5 também foram injetados com 20 µ g de plasmídeo do repórter fluorescentes. (B) trama a ponto do brilho obtido os ratos mostrados em (A). (C e D) Os ratos foram dadas ou buffer de hidrodinâmica entrega sozinho (C) ou (D) microesferas fluorescentes (pontos verdes brilhantes) e expressando o repórter fluorescente vermelha TdTomato do promotor do EF-1 α pEF1α-TdTomato. Túbulos proximais foram corados por aglutininas de tetragonolobus Lotus (LTA; verde) e células transfectadas são mostradas após coloração com anticorpos anti-RFP para amplificar o sinal de TdTomato (vermelho). Núcleos estão manchados pelo DAPI (azuis). As imagens mostradas em (C) e (D) são 13,2 mm x 17,5 mm. barras de erro representam o erro padrão da média. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56324/56324fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim

Este protocolo descreve um método para injetar plasmídeo no rim do rato através da pelve renal para produzir a expressão do transgene especificamente no rim.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.3K visualizações.  Tennessee Valley Healthcare System. Este protocolo descreve um método para injetar plasmídeo no rim do rato através da pelve renal para produzir a expressão do transgene especificamente no rim.

Vídeo: Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino Procedimento de Transplante Renal

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...