Este trabalho foi financiado em parte pelo DP2OD008470 concessão NIH. Além disso, RAM foi apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Notre Dame Graduate School. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, o Centro de Zebrafish Research, e do Centro de Células Estaminais e Medicina Regenerativa na Universidade de Notre Dame. Agradecemos especialmente os membros do laboratório para envolver discussões sobre a biologia rim e seu feedback útil sobre este trabalho.

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Notre Dame. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Adicione uma solução de estoque de 50x E3 meios embrião por mistura de 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2, e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada, e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilui-se a solução 50x estoque de E3 estoque meios embrião para uma solução de trabalho de 1 x com água destilada, depois adicionar 200 mL de 0,05% de azul de metileno para cada uma L de 1x E3 para actuar como um fungicida, e armazenar a RT. </li><li> Adicione uma solução de bloqueio de pigmentação E3 meios embrião com 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) através da combinação de 40 ml de solução stock 50x E3 com 0,06 mg PTU. Em seguida, levar o volume a um total de 2 L com água destilada. </li><li> Agita-se a O E3 / PTU / N à temperatura ambiente para obter o pó PTU na solução. Em seguida, armazenar o E3 / PTU naRT. Nota: O E3 / PTU possui uma vida útil de aproximadamente uma semana, e as soluções mais antigas vai ser menos eficaz em bloquear o desenvolvimento de pigmentação em larvas de peixe-zebra. </li><li> Adicione uma solução anestésica de 0,2% tricaina (MS-222) por adição de 1 g de tricaina a 500 ml de água destilada e ajustar o pH a 7,2 com Tris 1 M, pH 9,5. </li><li> Prepare-se para fazer uma solução de metilcelulose a 2% para imagiologia por colocação de uma solução de 1x E3 (sem azul de metileno), com 1/10 do volume de 0,2% tricaina adicionado a 4 ° C. Nota: A solução de metilcelulose é uma solução de espessura, claro que é usado para estabilizar suavemente embriões vivos para microscopia. Depois de manipulações são realizados os embriões podem ser lavados em 1x E3 para dissolver a metilcelulose sem ferir o animal e permitindo a microscopia em fases posteriores na mesma amostra. </li><li> Quando arrefecida a 4 ° C, agita-se a solução 1x E3 / tricaina vigorosamente numa placa de agitação e adicionar gradualmente a quantidade apropriada de cloridrato depó de celulose, continuando a agitar vigorosamente. Gradualmente adicionar o pó à solução para prevenir a formação de agregados insolúveis de metilcelulose. </li><li> Depois que todo o pó é misturado na solução de metilcelulose / E3 / tricaina 2%, agita-se a solução de composto em 4 ° C, a sala de frio S / N. Nota: A temperatura fria é melhor para dissolver completamente o pó. Se a solução não for límpida após uma noite, agita-se durante um dia de trabalho adicional e / ou um segundo S / N. </li><li> Para remover as bolhas de ar a metilcelulose a 2% / solução / tricaina E3, aliquota-se a mistura em tubos de 1,5 ml e giram a alta velocidade (12.000 xg) a 4 ° C durante 30 min ou até 2 horas. </li><li> Coloque a solução / E3 / tricaina metilcelulose a 2% a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Nota: Antes do uso, alíquotas deve ser pré-aquecido até à temperatura ambiente para trabalhar com os espécimes de peixe-zebra. </li></ol> 2. Preparação de Ferramentas <ol><li> Prepare uma ferramenta embrião manipulador, usado para positioning embriões para microinjecção, anexando uma ponta de carga do gel na ponta de uma &quot;agulha de dissecação 5 linear e seguro com fita ou supercola. </li><li> Prepare agulhas microinjeção usando um extrator de agulhas, colocando primeiro um fogo polido 10 centímetros de vidro de borosilicato com filamento no instrumento e fixe o vidro de borosilicato, apertando os punhos. </li><li> Puxe o vidro de borosilicato de moda finas agulhas-cônicos. Utilize as seguintes definições: aquecer 540, puxe 245, velocidade 200 e 125 tempo. </li><li> Coloque as agulhas dentro de uma placa de Petri, suspendendo-os em uma tira de massa de modelar para proteger as pontas das agulhas, e manter o prato coberto para evitar o acúmulo de poeira. </li><li> Para terminar de preparar a agulha para microinjeções, use uma borda lâmina de barbear ou uma pinça fina para cortar o final puxou da agulha para criar uma ponta de injecção angular afiada com um diâmetro de cerca de 0,05-0,1 mm. </li><li> Para fazer com que o tabuleiro de microinjecção, preparar uma solução de 1,5% de agarose / E3 em um 100 ml frasco Erlenmeyer e dissolver a agarose por aquecimento a E3 a uma fervura num forno de microondas, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Verter a solução de agarose / E3 arrefecida para uma placa de Petri de fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Quando isso tiver solidificado derramar uma segunda camada com uma profundidade de aproximadamente 0,3 cm, e inserir o molde pré-fabricado e embrião bem permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente. Nota: Quando da inserção do molde para a camada / E3 de agar de topo, colocando o molde em agar em um ângulo para diminuir o número de bolhas de ar. </li><li> Quando a bandeja toda a microinjecção definiu, levante o embrião pré-fabricada bem moldar para fora lentamente e com cuidado usando um scoopula, em seguida, encher o prato com solução E3 e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação de Embriões <ol><li> Configurar tanques de acasalamento de peixe-zebra, colocando divisórias em câmaras de acasalamento e encha com água do sistema. </li><li> Coloque um peixe de cada lado da divisória such que cada câmara de acasalamento contém uma fêmea e um macho peixes, e cubra cada uma das câmaras de acasalamento. </li><li> Na manhã seguinte, retire os divisores para permitir a desova. </li><li> Verifique o peixe depois de aproximadamente 30 minutos, e depois de voltar os adultos para o aquário, recolher os seus embriões, passando a água do tanque de acasalamento por meio de uma ferramenta de filtro fino de arame. </li><li> Inverter a peneira sobre uma placa de Petri e enxaguar com E3 para recolher os embriões. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando os embriões atingiram o estádio de 24-26 somito 26, decanta-se a maior parte dos meios de comunicação e, em seguida, E3 dechorionate por adição de 100 ul de 50 mg / mL de pronase para cada prato de embriões e incubando o prato à TA (23 ° C) durante aproximadamente 15 min. Nota: Vai levar cerca de 24-25 horas a partir do momento da fertilização para os embriões para chegar à fase 24-26 somite se forem recolhidas através do método descrito e incubadas O / N a 28,5 ° C. </li><li> Encha o prato comE3 e, em seguida, agite cuidadosamente para desalojar os córions dos embriões. </li><li> Decantar o E3 / pronase e lavar o prato com 25 ml de E3 fresco. Repita etapa de lavagem para remover toda a pronase. </li><li> Para bloquear o desenvolvimento da pigmentação, decantar o E3 e substituir com 25 ml de fresco E3 / PTU quando os embriões tenham atingido 24 horas após a fertilização. Nota: Para experiências abrangendo vários dias, substitua a solução E3 / PTU com meios frescos uma vez por dia para manter o prato limpo. </li></ol> 4. Solução de Microinjeção nefrotoxina <ol><li> No dia da injecção, preparar a solução nefrotoxina desejado, juntamente com o controlo de veículo apropriado. </li><li> Vortex ou misturar suavemente para assegurar a droga (s) é / são em solução, verificando os lados do tubo e o topo da coluna de água. Nota: As soluções nefrotoxina pode estar preparado para conter pequenas quantidades de dextrano conjugado fluorescente para monitorar a eficiência de microinjeção e também avaliar a depuração renal em subseqtempo uentes aponta 20,28. </li><li> Carregar uma agulha de microinjecção aparado com ~ 2-3 ul da nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fina na parte de trás da agulha e suspender a agulha na vertical, com um pedaço de fita para permitir que a solução para encher a extremidade da agulha cortada por gravidade. </li><li> Uma vez que a ponta da agulha está cheio, fixar a agulha carregada no micromanipulador. </li><li> Testar o volume microinjecção, colocando uma gota de óleo mineral para uma lâmina de micrómetro e injectar no óleo a avaliar o tamanho de gotícula. Um volume de injecção de 500 pl tem um diâmetro de 0,1 mm. </li><li> Remover o prato de embriões a partir do incubador, e anestesiar por adição de cerca de 5 ml de 0,2% tricaina ao prato embrião. </li><li> Para garantir anesthetization completa, tocar suavemente embrião com a ponta da ferramenta embrião manipulador. A falta de movimento indica anesthetization suficiente. </li><li> Após anestesia com sucesso, transferir embriões para o molde de injecção com um transfpipeta er. </li><li> Manobrar cada embrião dentro de um poço diferente do molde colocando a cabeça na área mais profunda do poço de tal forma que o tronco repousa ao longo da depressão e da cauda fura acima fora da depressão. </li><li> Inserir a agulha introduzida no micromanipulador e posicionar a ponta da agulha ao lado de um embrião. </li><li> Gentilmente inserir a agulha para dentro do vaso cauda movendo o joystick para a frente e pressionar o pedal para entregar a microinjecção. Nota: injeção de sucesso pode ser medido observando o líquido entra na circulação. Além disso, a co-injecção do nephrotoxicant com dextrano conjugado por fluorescência permite que o pesquisador para verificar a injecção subsequente de sucesso para o procedimento. </li><li> Gentilmente puxe o joystick para remover a agulha do embrião. </li><li> Após a injeção, transferir os embriões para um prato limpo e lavar para remover o tricaina e substituir com frescos E3 / PTU. </li><li> Incubar o embrião para o ponto de tempo desejado para avaliars morfologia, a qual pode ser documentadas por fotografia em meios de montagem de metilcelulose, ou um processo para a análise experimental como desejado. Nota: Recuperação de embriões devem ser avaliadas para determinar a percentagem de indivíduos com edema, que normalmente indica lesão renal. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA 29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido 30 e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado 31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas drogas afectar negativamente os pacientes, especialmente aqueles em populações de alto risco, tais como aqueles em ambientes de cuidados críticos e idosos 29. Assim, modelos que permitem que novos estudos baseados celulares sobre os efeitos do LRA induzida por drogas servir um papel importante na melhoria da detecção desta condição e apreciar interações medicamentosas dinâmicos. Trabalhar com modelos de mamíferos como ratos e ratinhos têm sido parte integrante para estabelecer as alterações celulares no rim seguintes AKI, but uma limitação com estes sistemas é que a observação, em tempo real directa é limitada devido à complexidade de arquitectura e localização interna do órgão. Simplificando, o rim não está disponível para observação directa, o que exige que os indivíduos ser sacrificado para analisar o rim. Essas limitações podem ser combatidos através da utilização de embriões de peixe-zebra, que formam um rim simples de dois néfrons que têm uma estrutura segmento conservado com outros vertebrados, incluindo seres humanos 33. Desenvolvimento Zebrafish ocorre ex utero e com menor pigmentação, permitindo a observação direta de organogénese e monitorização das respostas renal a estímulos externos 34. Ferramentas para análise molecular, tais como a expressão do gene 35-37, têm sido utilizados com alta resolução para determinar as características de nefrogênese 38-40. manipulações experimentais para o ensaio de moléculas pequenas através da genética químicas estão bem estabelecidas no peixe-zebra e aplicável ao kidney 41-43. Com efeito, nos últimos anos, peixe-zebra foram aplicados para modelar a nefrotoxicidade de agentes que vão de acetominofeno com micotoxinas e ácido aristolochic 44-48. É importante notar que também existem limitações significativas à modelagem LRA no embrião do peixe-zebra, por causa da própria simplicidade da estrutura renal, nesta fase do desenvolvimento. Por exemplo, peixe-zebra não são adequados para tratamento das interacções multifactoriais no tecido renal que está densamente com nefrónios que estão rodeadas por um estroma complexo que contém vários tipos de células intersticiais, como é o caso no roedor ou metanefros humanos. Assim, peixe-zebra são mais adequados para a visualização de alterações celulares e moleculares autônomos no néfron durante AKI. O método de microinjeção aqui descrito, ao ter uma curva de aprendizagem, é muito útil para o estudo de ambos os estados de desenvolvimento e doença, incluindo nefrotoxinas. Esta técnica pode ser usada para de tedrogas st isolados ou em combinação. Além disso, as injecções podem ser realizadas durante uma larga gama de pontos do tempo de desenvolvimento. Um método semelhante, igualmente viável para a realização de micro-injecções intravenosas em larvas de peixe-zebra foi previamente descrito por Cosentino, et ai. 21. Uma diferença significativa na sua metodologia, em comparação com os métodos descritos aqui, é que o embrião a ser injectada é imobilizado utilizando uma pipeta de 21 exploração. A utilização de uma pipeta de realização é uma alternativa viável para o molde de injecção. Pesquisadores que procuram implementar microinjeção como um método de entrega de agentes nephrotoxicant deve estar ciente desta alternativa e pode querer comparar os métodos para identificar qual é pessoalmente preferível, como aprender a manipular a pipeta de exploração de modo a não danificar o embrião vai envolver prática da mesma forma que requer prática para manobrar com sucesso e microinject usando um molde de injeção simples, com uma cavidade de depressão para o embryos. Ao realizar este procedimento, é crítico para preparar as agulhas de injecção de tamanho apropriado, e para cortar o ângulo na ponta da agulha para optimizar entrada suave e saída para a circulação embrionário. Durante o processo de injecção, é crítico para monitorizar o volume de injecção para avaliar a consistência da entrega nefrotoxina entre amostras. avaliação periódica do volume de injeção com um micrômetro pode ser realizada se o pesquisador está incerto sobre mudanças no volume durante a execução de um experimento. Por exemplo, devido à natureza da técnica, a ponta da agulha pode parcialmente ou totalmente entupir com detritos celulares. Esta complicação pode ser combatido, limpando a agulha periodicamente para assegurar a consistência do fluido ejectado. Além disso, um corante vital como vermelho de fenol pode ser adicionado à mistura para actuar como um marcador visual da injecção e ajudar a controlar a dispersão de fluido 49,50. Além disso, as injecções de moléculas marcadoras podem auxiliar navisualizando as populações de células específicas, a seguir à injecção. Para a co-injecção de dextrano porções fluorescentes, especificamente de 10 kDa de conjugados de dextrano, tem um número de aplicações 16,17. Neste caso, a avaliação da intensidade de fluorescência pode ser realizada imediatamente a seguir o procedimento para confirmar a microinjecção de sucesso com perdas mínimas. A intensidade pode ser medido usando a fotografia de captura de imagem apropriada e, em seguida, reexaminados em pontos de tempo posteriores para medir a alteração da intensidade de fluorescência de modo a medir a depuração renal 51. Além disso, a reabsorção do dextrano no túbulo proximal fornece um proxy para a funcionalidade deste segmento nefrónio 16,17. Tomados em conjunto, há muitas maneiras que microinjecção podem ser utilizados para investigar LRA com o peixe-zebra, tanto mais que este modelo proporciona uma oportunidade para dirigir farmacocinética in vivo. Assim, uma vez dominado, microinjeção de nefrotoxinasno embrião do peixe-zebra fornece um paradigma útil para estudos renais.

LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde 1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% 1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e 4 fármacos quimioterapêuticos. LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central 1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas 1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal 1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica 1. Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a 5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação 7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise 8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI 8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI. A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI 10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas 11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos 13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios 17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade 20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como 22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos 25. O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina &lt;sup&gt; 25, em que o método de microinjecção 20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf 26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Os rins são suscetíveis a danos causados ​​por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados ​​para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.

Uma estação de microinjecção configurar inclui um estereomicroscópio, micromanipulador e regulador de pressão (Figura 1A). Transiluminação da placa de injecção é preferível para visualizar amostras durante este procedimento (Figura 1B). Preparação da agulha de injecção implica puxar o vidro de borosilicato apropriado, seguida por preparação da borda de corte e, finalmente, com back-carregar a agulha. Optimamente, a ponta da agulha é chanfrado, em vez de ponta romba (Figura 1C), um corte que é feito por dobrar fortemente o bordo do instrumento de corte, tais como os fórceps finos, durante o procedimento de corte (Figura 1D). Esta borda chanfrada é crítico e irá afectar grandemente a capacidade de inserir a agulha suavemente para o peixe-zebra. No dia da injecção, os embriões foram posicionados utilizando embrião resistente, mas flexívelFerramentas de manipulação (Figura 1E). Para a injecção, os embriões foram manobrado, de modo que o tronco descansado ao longo do lado da bandeja de injecção para proporcionar força de alavanca para a etapa de injecção subsequente (Figura 1F). Enquanto a injeção, deve-se concentrar o avião de vista sobre o tronco embrionárias para visualizar o destino vascular para a inserção da agulha e, em seguida, observar o material injetado entrar na circulação (Figura 1G). A transparência do embrião do peixe-zebra facilita o procedimento de micro-injecção, e pode ser ainda melhorada através de tratamento químico PTU em 24 HPF para diminuir o desenvolvimento de pigmentação durante um curso de tempo experimental típico (Figura 2A). Aqui, as amostras de embriões foram deixados a desenvolver-se através da etapa 72 hpf, em seguida, ou foram injectados simulada, microinjectados com veículo de solução salina, ou micro-injectados com 2,5 mg / ml de gentamicina (Figura 2A).Vivo de observação subsequente foi conduzida a um e dois dias após a injecção, utilizando transiluminação de iluminação com um estereomicroscópio (Figura 2B). Em comparação com os embriões injectados simulados ou soro fisiológico, só os indivíduos injectados com gentamicina mostrou o desenvolvimento de edema (Figura 2B), neste caso o edema pericárdico, sugerindo uma revogação da funcionalidade renal normal consistente com as observações previamente publicadas 11,20,21. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig1.jpg" /> Figura 1. Aparelho de microinjeção e ferramentas. (A) Estação de injeção configurado com lupa (à esquerda), micromanipulador e suporte de agulha (meio) e regulador de pressão (à direita). (B) transiluminação da placa de injecção. (C) Esquerda: agulha de corte Blunt. Direita: chanfrada agulha de corte. (D) Ffórceps ine usada para cortar pontas de agulha. (E) ferramentas de manipulação usados ​​para inserir e posicionar os espécimes para dentro do molde de injeção. (F) Embriões dispostas no molde microinjeção. Barra de escala = 0,5 mm. (L) Posicionamento de agulha ao lado do embrião para injecção. Barra de escala = 0,15 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54241/54241fig2.jpg" /> Figura 2. ensaio cronograma e edema pós-injecção Experimental. (A) Exemplo nefrotoxina cronograma experimental no peixe-zebra, aqui aplicada a um estudo de gentamicina. Os embriões foram dechorionated e tratou-se com solução PTU às 24 horas após a fertilização (HPF). Cada dia, a solução foi decantada e o PTU substituído com meio fresco tal como indicado pela Smaller setas verdes. Às 72 hpf, anestesiaram-se os embriões, transferidos para um molde de injecção e, em seguida, tratados como se segue: simulada injectados ou injectados, quer solução salina (controlo de veículo) ou de gentamicina. Após reviver os embriões em meio fresco, os embriões foram observadas em 1 e 2 dias após a injecção (96 e 120 HPF, respectivamente) para a análise e a aquisição de imagem. (B) superior: embrião de peixe-zebra não injectados. Meio: embriões injectados às 72 HPF com a solução salina. Resumindo: embriões injectados com 2,5 mg / ml de gentamicina. Barra de escala = 0,5 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54241/54241fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K visualizações.  University of Notre Dame.  lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor. 

Vídeo: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...