Il Career Development Award dal Department of Veterans Affairs [BX002797] supportati L.E.W. e il National Institutes of Health [R01-DK095867] e American Heart Association [15GRNT25700209] supportati J.C. Il National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] e centro del Vanderbilt per la malattia renale supportati M.H.W. Questo materiale è il risultato di lavoro sostenuto con risorse e utilizzo di servizi VA Tennessee Valley Healthcare System.

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent.">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li><li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles.">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li><li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery:+conclusion+of+a+comparative+study.">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla di divulgare e non dichiarare alcun conflitto di interessi.

In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per la realizzazione di espressione genica riproducibile in particolare nel rene. Nelle mani di un chirurgo esperto moderatamente abbiamo trovato la percentuale dei topi transfettati con questa tecnica per essere nella gamma di 50-100%, a seconda dell'età del mouse e la sensibilità di lettura del transgene. Il livello di espressione di gene della luciferasi era sopra priorità bassa per parecchi mesi in topi che ricevono piggyBac trasposoni e completamente mantenuta per diverse settimane in topi immunocompromessi che ricevono la stessa trasposoni11. Mentre molte cellule hanno macchiato brillantemente per il transgene in aree vicino al sito di iniezione, l'efficienza di trasfezione complessiva era relativamente basso (Figura 3D). Il materiale più importante per ottenere il risultato desiderato è la siringa di iniezione stessa. Deve trattarsi di una siringa da insulina 29 x ½" con un ago attaccato e nessuna sicurezza per ostacolare l'iniezione. L'iniezione deve essere veloce, all'interno di tre s. La preparazione di DNA plasmidico dovrebbe essere pura, con bassissima endotossina e batteriche genomic DNA livelli19.
È concepibile che le iniezioni di altre sostanze, quali virus, RNA o proteine, possono essere fatto in un modo simile. Pelvi renale era superiore come una via di ingresso ad altri siti di iniezione testato, come la vena renale o iniezione diretta del parenchima renale. Tali iniezioni hanno portato a sanguinamento e inferiore di espressione genica11. Poiché la pelvi renale è una struttura elastica per tenere il riflusso di urina a volte necessaria, può essere meglio in grado di allungare e ospitare l'ago. Perdita di urina dal buco creato dalla siringa di insulina o di soluzione di DNA non è stato osservato, suggerendo che la pelvi renale è riparata rapidamente. L'esatto meccanismo mediante il quale il liquido iniettato transfects del rene non è stato studiato in profondità, come ha fatto per il fegato, per esempio. Studi di microscopia elettronica futuro possono delucidare ulteriormente questo meccanismo. La natura retrograda dell'iniezione ha la precedenza in quanto il metodo di iniezione della vena della coda idrodinamica inverte il flusso della vena epatica20 e altri metodi di successo di transfezione di rene hanno iniettato attraverso la vena renale12, 13 , 14 , 21. danno del rene è probabilmente necessaria per un'efficienza ottimale di transfezione quindi supponiamo che la transfezione si verifica tramite danni alla membrana cellulare causata tramite l'iniezione veloce, ad alto volume. I podociti, tubuli e condotti di raccolta hanno interfaccia diretta con lo spazio urinario come loro principale funzione è di filtrare e concentrare l'urina.
Sebbene riproducibile e rene-specifico, questo metodo è limitato dall'efficienza di trasfezione relativamente bassa osservata (Figura 3D). Iniezione idrodinamica pelvi renale non è un sostituto per la creazione di un animale transgenico guidando il transgene da un promotore di rene-specifico, in cui ogni cellula di un certo sottotipo nell'animale avrebbe espresso il gene di interesse. Piuttosto, questo metodo è più adatto agli approcci di trasferimento del gene per le malattie in cui un piccolo numero di cellule corrette avrebbe un effetto drammatico sul fenotipo, per la secrezione di ormoni o altre sostanze normalmente prodotte dal rene o per la creazione di un popolazione di cellule rare che esercitare qualche effetto positivo sul rene di riparare o rigenerarlo. In alternativa, potrebbe essere utilizzato anche in modo opposto a sviluppare un nuovo modello di lesione del rene con l'introduzione di un transgene con un'influenza negativa.

La tecnica di iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un modo comunemente usato per raggiungere elevati livelli di espressione genica nei mouse del fegato1,2. I reni sono anche trasfettati con questa tecnica ad un livello più basso, circa 100 volte meno3. L'iniezione idrodinamica pelvi renale descritto qui fornisce un modo semplice per controllare la specificità di espressione organo attraverso mezzi fisici utilizzando gli stessi principi idrodinamici che sono stati stabiliti in precedenza nel fegato4,5 , muscolo6e altri organi7,8. Questo metodo transfects cellule in animali vivi in vivo mediante pressione e velocità per forzare il fluido contenente DNA nelle cellule, allo stesso tempo inducendo danni all'organo che è rapidamente risolto9. Usando le tecniche chirurgiche consolidate per visualizzare il rene attraverso un' incisione di fianco10 insieme con una singola iniezione con una siringa di insulina, abbiamo trovato successo transfezione di vari tipi di cellule renali, principalmente interstiziale fibroblasti, tubuli e raccolta del condotto11. Dissezione di questi topi ha dimostrato che altri organi non transfected a livelli abbastanza in alto per visualizzare di luciferasi11di tecniche di imaging. Poiché la tecnica è non-virale, uso del DNA del plasmide per la transfezione permette facile e veloce preparazione dei reagenti necessari per l'iniezione.
Abbiamo usato iniezioni localizzate di idrodinamiche per esprimere l'antiossidante glutatione S-transferasi A4, il recettore del fattore di crescita 1 insulino-simile e l'eritropoietina dell'ormone nel rene, tutte dotate di effetti biologici previsti11, 12 , 13. valutazione dettagliata della via di somministrazione, volume di iniezione, dosaggio di DNA e la scelta del promotore è stata effettuata11. Inoltre, entrambi i piggyBac trasposone sistema trattamento e/o ciclofosfamide per sopprimere la reazione immunitaria per il transgene hanno dimostrato di migliorare i risultati a lungo termine espressione di gene11. Altri ricercatori hanno utilizzato un approccio della vena renale nel ratto con successo, raggiungere la transfezione alta efficienza per periodi di tempo superiori a un mese14. Tuttavia, correzione genetica dei fenotipi che imita la malattia umana vengono solitamente eseguiti in topi prima come un proof-of-concept poiché modelli genetici più mammiferi sono modelli murini. Abbiamo confrontato ad iniezione della vena renale alla pelvi renale iniezione e trovato che iniezione nella pelvi renale era superiore alla vena renale per l'espressione genica (circa dieci volte superiore) e sopravvivenza11. La pelvi renale è un percorso ideale di entrata nel rene, perché è abbastanza flessibile da tollerare fluttuazioni della produzione di urina e spesso è in grado di mantenere la sua integrità strutturale anche quando dilatato durante idronefrosi. Inoltre, iniezione nella pelvi renale consentito l'accesso al rene senza perforare la capsula del rene, permettendo il visibilmente trattenuto dal rene meglio di intraparenchymal iniezione del fluido iniettato. Altri organi del mouse non si dispone di un percorso di ingresso diverso da quello del sistema vascolare, ma lo spazio urinario del rene è un sito di iniezione ideale. Inoltre, iniezione nella vena renale ha provocato perdite di sangue nella cavità addominale. Il volume totale del rene dei reni di selvaggio-tipo di mouse è stato stimato dalla risonanza magnetica per essere circa 0,2 cm3, quindi il volume di un singolo rene è approssimativamente uguale alla quantità di liquido iniettato dal bacino renale idrodinamico iniezione (100 µ l)15. Qui, abbiamo messo a disposizione tutte le sfumature dettagliate del protocollo iniezione idrodinamica pelvi renale per raggiungere transfezione riproducibile del rene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AnaSed Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td>Anesthetic - Not controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>309306</td>
			<td>Required syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td>Pharmacist/Veterinarian</td>
			<td></td>
			<td>Analgesia - Controlled Substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Disposable Towel Drape</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19-310-671</td>
			<td>Place over heat pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Use only endotoxin-free plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>PC200</td>
			<td>Positive control for endotoxin test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>R13500</td>
			<td>Endotoxin test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-51</td>
			<td>For autoclaving surgical tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar Heat Pump</td>
			<td>Paragon Medical</td>
			<td>TP-700</td>
			<td>Water-circulating heat pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>DS-401</td>
			<td>To reuse surgical tools during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Tissue Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder, 5&#34; Length</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-7841</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pads - 15&#34; x 21&#34; - need at least 3</td>
			<td>Paragon Medical</td>
			<td>TP22G</td>
			<td>For use with Gaymar Heat Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott Animal Health</td>
			<td>5260-04-05</td>
			<td>For imaging and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>VCT3K2</td>
			<td>For imaging and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pharmacist/Veterinarian</td>
			<td></td>
			<td>Anesthetic - Controlled Substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122796</td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000-US-CAN</td>
			<td>Spectrophotometer for DNA measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prevantics Swabs</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23-100-110</td>
			<td>For skin surgery prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0 sutures Taper 30&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0256891</td>
			<td>Non-absorbable sutures for skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Brand Opthalmic Ointment</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-888-2572</td>
			<td>To keep eyes moist during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution</td>
			<td>Mirus Bio</td>
			<td>MIR-5240</td>
			<td>Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 Sutures J303H</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9816710</td>
			<td>Absorbable sutures for muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Mini Arco Clipper</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>8787-1550</td>
			<td>Shaver for skin prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For live animal imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney

Iniezione idrodinamica crea un ambiente locale, ad alta pressione di transfect vari tessuti con il DNA del plasmide ed altre sostanze. Iniezione della vena della coda idrodinamica, ad esempio, è un metodo ben stabilito che il fegato può essere transfected. Questo manoscritto descrive un'applicazione di principi idrodinamici per iniezione del rene del mouse direttamente con il DNA del plasmide per l'espressione genica del rene-specifica. Topi sono anestetizzati e rene è esposto da un'incisione del fianco seguita da una rapida iniezione di una soluzione contenente DNA plasmidico direttamente nella pelvi renale. L'ago è mantenuto sul posto per dieci secondi e il sito di incisione viene suturato. Il giorno seguente, immagini animali dal vivo, Western blot, o immunohistochemistry può essere usato per analisi di espressione genica o altri dosaggi adatti per il transgene di scelta vengono utilizzati per il rilevamento della proteina di interesse. Metodi pubblicati per prolungare l'espressione genica comprendono trattamento di integrazione e ciclofosfamide transgene transposon-mediata per inibire la risposta immunitaria per il transgene.

La tecnica di iniezione e chirurgia sono semplici da eseguire una volta masterizzato, che non richiede grandi attrezzature o materiali costosi. Se nuovo in chirurgia renale incisione a fianco, una giornata di formazione su diversi topi prevista per l'eutanasia dovrebbe essere consentita in cui i topi non sono recuperata dopo chirurgia perché il primo tentativo di questo tipo di chirurgia può richiedere molto più tempo rispetto al normale. In alternativa, gli investigatori hanno familiari con tecniche simili possono risultare abbastanza semplice. Seguire attentamente l'immagine nella Figura 1 e le indicazioni illustrate in Figura 2. Per posizionare correttamente l'incisione, il chirurgo può utilizzare le dita per spingere sullo stomaco del mouse mentre depone sul suo lato. Il rene è visualizzato da un piccolo nodulo che sorge vicino alla spina dorsale con una leggera pressione addominale, e l'incisione deve essere fatta sopra questa zona (Figura 1 e Figura 2). È importante effettuare l'incisione attraverso gli strati di pelle e il muscolo la dimensione corretta (Figura 1). Se l'incisione è troppo grande, il rene scivolerà indietro nella cavità addominale facilmente, rendendo difficile la iniezione. Se l'incisione è troppo piccolo, sarà difficile spingere il rene fuori della cavità addominale e potrebbero verificarsi danni d'organo. Un altro punto importante è il posizionamento dell'ago nella pelvi renale. Il chirurgo dovrebbe spingere il rene con pinze chiuse, quindi inserire l'ago nella pelvi renale ad un angolo parallela alla superficie di lavoro tale che la maggior parte del volume iniezione va direttamente nel parenchima del rene (Figura 2). È importante che l'iniezione essere eseguita più rapidamente possibile per indurre la pressione idrodinamica necessaria per la transfezione di rene.
Topi di diversi ceppi, età, peso e sesso avrà differenze nella posizione del rene e della quantità di grasso che circonda il rene, quindi alcune modifiche potrebbero essere necessarie lavorare con i topi di interesse. Se possibile, il primo tentativo chirurgico da cui vengono recuperati i topi dovrebbe includere una lettura immediata di espressione genica del rene-specifica, ad esempio luciferasi imaging (Figura 3A). Se giovani topi sono utilizzati, il risultato previsto è che tutti i topi avrà una luminosità che è all'interno di un ordine di grandezza (Figura 3B). Occasionalmente, anche dopo una seconda iniezione di luciferina, è apparente di imaging che una o più mouse non è riuscito a diventare trasfettate ad un livello paragonabile agli altri o che alcuni topi iniettati sono addirittura completamente prive di espressione genica. Tali topi possono essere esclusi dallo studio dovuto transgene fallita consegna. Se molti dei topi mancanza di espressione genica, il chirurgo dovrebbe diminuire il tempo di iniezione della soluzione del DNA. Fallimento per indurre il danno necessario attraverso l'alta pressione dell'iniezione è la causa più probabile per la costante mancanza di espressione genica. Topi dovrebbero essere attentamente monitorata dopo chirurgia per potenziali problemi di salute (Vedi tabella 1 per potenziali problemi di salute con soluzioni di accompagnamento e consultare con equipe veterinaria dell'istituzione come necessario). Dopo un periodo di formazione iniziale, l'intervento stesso dovrebbe prendere meno di dieci minuti. Il periodo chirurgico dovrebbe avvenire più breve possibile agendo sul uno mouse alla volta per evitare l'essiccazione dei tessuti durante l'intervento chirurgico. La maggior parte dell'investimento di tempo in questa procedura è dovuto l'induzione di recupero dalla chetamina/xilazina anestetico. Due personale esperto lavorando come una squadra dovrebbero aspettarsi di eseguire fino a dieci interventi chirurgici al giorno, con quindici anni come un massimo ragionevole.
I ricercatori dovrebbero aspettarsi un basso numero di cellule a macchiare altamente positivo per il transgene entro i primi giorni dopo l'iniezione. Queste cellule positive saranno localizzate in zone circostanti aree dove il fluido iniezione infiltrato il rene (Figura 3-D). Alcune parti del rene sarà completamente negativi per cellule trasfettate. Tali aree negative sarà carente in eritrociti e hanno completamente normale istologia poiché l'iniezione non ha raggiunto queste aree. Protocolli e promotori di colorazione deve essere ottimizzato con cura per catturare l'espressione genica. Gli investigatori dovrebbero aspettarsi che la cella tipi trasfettati sarà variabile, i livelli di espressione genica all'interno la bassa percentuale di cellule trasfettate sono alti, e la localizzazione delle proteine all'interno delle cellule non può essere come previsto a causa di alti livelli di espressione (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56324/56324fig3.jpg"> Figura 3. Iniezione idrodinamica pelvi renale si traduce in espressione genica renali-specifica di luciferase e TdTomato. (A) FVB 7-8 settimana vecchio topo maschio sono stati dati idrodinamici pelvi renale iniezioni di 20 µ g di pTEeL, esprimendo un plasmide migliorato luciferasi di lucciola dal promotore EF-1 α. Topi, 2, 3 e 5 sono stati iniettati anche con 20 µ g del plasmide del reporter fluorescente. (B) dot plot della radianza ottenuta dai topi mostrati in (A). (C e D) Topi sono stati dati o buffer di idrodinamica consegna da solo (C) o microsfere fluorescenti (D) (puntini verdi luminosi) e pEF1α-TdTomato esprimendo il reporter fluorescente rosso TdTomato dal promotore EF-1 α. Tubuli prossimali sono stati macchiati dall'agglutinina di Lotus tetragonolobus (LTA; verde) e cellule trasfettate sono mostrate dopo colorazione con anticorpo anti-RFP per amplificare il segnale di TdTomato (rosso). I nuclei sono macchiati di DAPI (blu). Le immagini mostrate in (C) e (D) sono 13,2 mm x 17,5 mm. barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56324/56324fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene

Questo protocollo descrive un metodo per iniettare DNA plasmidico in rene del mouse tramite la pelvi renale per produrre l'espressione del transgene in particolare nel rene.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.3K Views.  Tennessee Valley Healthcare System. Questo protocollo descrive un metodo per iniettare DNA plasmidico in rene del mouse tramite la pelvi renale per produrre l'espressione del transgene in particolare nel rene.

Video: Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino procedura trapianto renale

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...