Este estudo foi suportado pela Agência de defesa ameaça redução (DTRA) sob contrato HDTRA1-14-C-0116 e o centro de excelência em Genômica de infecção (DOD #W911NF-11-1-0136).

este trabalho foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde. Animais protocolos envolvendo roedores foram aprovados pela Universidade do Texas em San Antonio institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC) sob o protocolo MU009(RA).
 1. preparar o cateter, indicador de traqueia e inóculo de F. tularensis <ol><li>Preparar o cateter (20 x 2 polegadas) <ol><li>corta a 20 x 2 na agulha e moer a ponta da agulha para um blunt e suave terminar com um ferramenta rotativa. 
		Nota: O comprimento da agulha cega deve permitir que a ponta de metal rescindir cerca de 3 mm na manga cateter quando assentado sobre a agulha cega. A agulha cega dá a rigidez estrutural do cateter para permitir a colocação do cateter na traqueia, e a ausência da ponta da agulha cega salientes da manga do cateter evita prejuízo para a traqueia.</li>
		<li>Limpar as agulhas embotadas e cateteres usando 70% de etanol e esterilizar sob luz UV de 15 min.</li>
	</ol></li> <li>Indicador de traqueia preparar <ol><li>Aparar uma ponta da pipeta 1.000 µ l para permitir que a ponta sentar-se em uma abertura do cateter e formar uma vedação estanque ao ar.</li>
		<li>Remover um filtro de um 200 µ l aerosol barreira pipeta ponta e lugar dentro a ponta da pipeta previamente aparado µ 1.000 l.</li>
		<li>Garantir o filtro pode mover-se livremente dentro a ponta da pipeta 1.000 µ l quando a ponta está apontada para baixo ponta.</li>
	</ol></li> <li>Inóculo de F. tularensis <ol><li>Grow F. tularensis tensão durante a noite em placa de ágar apropriado em 37 ° C. Scrape aproximadamente 100 µ l do gramado bacteriano da placa de ágar com um estéril Inocular loop e usar para inocular um frasco de Erlenmeyer contendo 250 mL do meio de cultura líquido apropriado de 500 mL (para Fn: caldo tryptic soja (TSB) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) e incube a tremer durante a noite a 37 ° C. 
		Nota: F. novicida usada no vídeo foi cultivado em um prato de tryptic soy agar (TSA) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado.</li>
		<li>Centrifugar a cultura líquida cresceu durante a noite a 4.221 x g em temperatura ambiente por 10 min e retire o sobrenadante sem perturbar o sedimento bactérias. 
		Atenção: Por favor, siga a instituição &#39; recomendações de biossegurança s para descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Suavemente Ressuspender o pellet bacteriano com 25 mL de meio líquido adequado (Fn: TSB suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) contendo 10% de glicerol, usando uma pipeta de 25 mL.</li>
		<li>Usando uma pipeta de 1 mL, alíquota a ressuspensa cultura bacteriana em 500 alíquotas µ l em frascos, congelar em um banho de gelo seco (etanol) e armazene a -80 ° C.</li>
		<li>Para determinar o título dos frascos de cultura congelada, retire dois frascos congelados armazenados a-80 ° C, descongelar no gelo e realizar diluições em série em tampão fosfato salino (PBS) seguido de chapeamento no meio de cultura apropriado (Fn: TSA contendo 0,1% L-cisteína cloridrato de). As placas são incubada 24-48 h a 37 ° C, e unidades formadora de Colônia (UFC) são enumeradas para calcular o número de células bacterianas dentro os frascos de cultura congelada (média de dois frascos).</li>
		<li>Preparar o inóculo bacteriano, descongelar um frasco congelado no gelo e em seguida diluir a cultura com PBS para a concentração final de 10 7 UFC/100 µ l. O inóculo deve ser em uma concentração que produzirá a desejada CFU em 100 µ l (a concentração final de glicerol dentro o inóculo não pode ser superior a 3%, para evitar asfixia do rato). Frascos de cultura congelado armazenados a-80 ° C podem ser usados por até seis meses após o preparo.</li>
	</ol></li></ol> 2. Rato de anestesia <ol><li>conectar-se a câmara de anestesia para o vaporizador de isoflurano corretamente o funcionamento de uma máquina de anestesia.</li>
	<li>Conectar o tubo sobre a câmara de anestesia para o sistema de gás gás.</li>
	<li>Abrir o fluxo de oxigênio sobre a máquina de anestesia para 4 L/min.</li>
	<li>Definir o vaporizador de isoflurano para 5%.</li>
	<li>Colocar o rato na câmara de anestesia. 
	Nota: Normalmente utilizamos ratos entre 8-10 semanas de idade (130-180 g); ratos mais jovens são difíceis inocular através desta técnica devido ao pequeno tamanho da cavidade da boca.</li>
	<li>Quando a indução da anestesia tem tomado lugar, manter o rato no 5% de isoflurano, 2 L/min de oxigênio para o efeito. Isso leva cerca de 3-10 min.</li>
	<li>Determinar a profundidade da anestesia, a qualidade e a taxa de respiração e batimento cardíaco e a reação à estimulação reflexa, como o teste do beliscão do dedo do pé. Profundidade ideal da anestesia é indicada pela contagem de 1-1,5 s entre cada respiração.</li>
</ol> 3. Intratraqueal inoculação <ol><li>remover o rato da câmara de anestesia e coloque o rato dorsalmente no stand roedores intubação. Anexar os dentes da frente do rato para o titular para manter o rato no local. 
	Nota: Se o rato começa a despertar durante o procedimento, o cateter pode ser removido e o rato voltou para a câmara de anestesia para atingir um plano mais profundo da anestesia.</li>
	<li>Usar a mão dominante para mover a língua para o mesmo lado que a mão de apoio com ponto largo Pinca polegar.</li>
	<li>Uso apoiar a mão e segura a língua com o laringoscópio contra o rato &#39; s abaixar a mandíbula e visualizar a traqueia e o esôfago do animal. A traqueia vai abrir e fechar como o rato respira.</li>
	<li>Inserir o cateter contendo uma 20 embotados-agulha, preparado na etapa 1.1, na traqueia. Pode haver resistência ligeira, e inserção na traqueia pode ser &#34; acidentado &#34; devido o cateter esfregando as cartilagens traqueais. Devido à umidade ou respiração superficial, a traqueia pode ser coberta pela epiglote que impede a visualização da traqueia. Suavemente, tocando a borda da cartilagem epiglote fará com que a aba de cartilagem abrir e descobrir a traqueia.</li>
	<li>Remover a embotados-agulha do cateter, garantindo o cateter permanece na traqueia.</li>
	<li>Permitir que alguns segundos passar para o rato para poderes respirar em torno do cateter inserido na traqueia.</li>
	<li>Assente firmemente o indicador de traqueia ao cateter de abertura. Movimento da barreira aerossol indicará o cateter é inserido corretamente na traqueia.</li>
	<li>Garantir que o rato está deitada no stand intubação tal que o peito do animal está enfrentando perpendicular ao plano do estande da intubação.</li>
	<li>Remover o indicador de traqueia e entregar 100 µ l (10 7 UFC) do inóculo contendo F. tularensis usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, de estar firmemente a ponta contra a abertura do cateter.</li>
	<li>Anexar uma seringa de tuberculina ponta de deslizamento 1 mL cheia de ar e entregar 300 µ l de ar para assegurar o inóculo chega aos pulmões do rato.</li>
	<li>Remover o cateter da traqueia e remover o rato da plataforma cirúrgica.</li>
	<li>Permitir o rato despertar e voltar para a gaiola. Certifique-se de que a respiração voltou ao normal.</li>
	<li>Determinar o UFC na F. tularensis inóculo conforme descrito na etapa 1.3.5 para confirmar o CFU entregues na traqueia.</li>
	<li>Repita os passos 3.1-3,9 em animais não vacinados (ingênua) com 100 µ l PBS, no lugar de inóculo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O rato Fischer 344 está se tornando um importante modelo para tularemia vacina desenvolvimento3. Exposição a F. tularensis através da rota pulmonar é fundamental para demonstrar a eficácia contra formas como arma de F. tularensis, porque estas são entregues como aerossóis. Intratraqueal de inoculação do rato facilita a exposição dos pulmões rato a F. tularensis sem a necessidade de aerossol grande, caro e complicado, gerando o equipamento. Todos os experimentos utilizando agente selecionar formas de F. tularensis adicionalmente exigem BSL3 contenção, que normalmente ocorre no espaço severamente restrito. Assim, esta técnica minimiza a quantidade de equipamento adicional que precisa ser alojado dentro desse ambiente de trabalho.
Porque Fn foi a variedade de F. tularensis utilizada para produção de vídeo, todas as técnicas foram realizadas sob BSL2 contenção. Adaptação desta técnica para o ambiente de BSL3 inclui todos os procedimentos realizados dentro de uma armário de biossegurança por pessoal usava equipamentos de segurança biológica (capô completo, respirador purificador de ar alimentado (PAPR), capa protetora, todos com capa dupla luvas, botas), e essas adaptações reduzem a mobilidade, destreza e visibilidade. O indicador de traqueia é um importante componente que permite a confirmação de que o cateter foi colocado corretamente dentro da traqueia, Considerando que muitas vezes é difícil tornar essa determinação caso contrário quando trabalhando sob condições BSL3.
Há rato anatomicamente correto "simuladores" que têm uma traqueia e o esôfago, e estes são úteis para aperfeiçoar a técnica antes de trabalhar com animais vivos. No entanto, trabalhar com o simulador não é idêntico ao trabalhar com um rato vivo. Um dos meios para determinar se esta técnica é realizada corretamente no animal vivo é utilizar corante Trypan azul a inocular um rato anestesiados e após o procedimento de eutanásia imediatamente o animal. Dissecação do tecido do pulmão e estômago irá revelar se o corante foi entregue para os pulmões e não o esôfago. Um rato que tem sido vacinado com Fn/Ft por esta técnica pode também ser sacrificado logo após a inoculação e o tecido de pulmão chapeado para determinar o real depoimento dentro do pulmão.
Intratraqueal correta inoculação será importante para avaliação da eficácia de vacina tularemia em ratos Fischer 344, mas também pode ser útil para outras vacinas e/ou aplicações terapêuticas em ratos, incluindo biodefense. Assim, esta técnica pode ser adaptável a uma variedade de aplicações pulmonares, utilizando o modelo de rato. Enquanto entrega por um aerossol, o gerador pode ser mais semelhante a um cenário de ameaça biológica, a inoculação intratraqueal de F. tularensis representa uma alternativa relativamente simples e econômica para desenvolvimento de vacinas de tularemia.

F. tularensis (Ft) faz com que a doença humana, tularemia. Quando as bactérias são adquiridas através da rota pulmonar, isto leva a tularemia pneumônica, que tem alta taxa de morbidade e mortalidade1. F. tularensis é considerada um agente de ameaça biológica devido ao perigo associado com formas de aerossol e não há atualmente nenhuma vacina aprovada para uso humano nos EUA Um esforço intenso está em andamento desenvolver vacinas e medidas terapêuticas contra tularemia pneumônica, para proteger a população humana contra o uso ilícito desta ameaça biológica bacteriana.
Muita da pesquisa de tularemia centrou-se no modelo do rato, devido a extrema sensibilidade de ratos para F. tularensis infecção e a prevalência dos reagentes. No entanto, os ratos têm provado para ser um modelo difícil para desenvolvimento de vacinas, devido à dificuldade de demonstrar a eficácia da vacina neste modelo2. Recentemente, o rato Fischer 344 foi desenvolvido como um modelo para tularemia vacina desenvolvimento3. A sensibilidade do rato Fischer 344 para várias subespécies de F. tularensis imita a sensibilidade humana4, e ratos podem ser protegidos contra F. tularensis desafio pulmonar por vacinação com uma cepa de vacina viva conhecida para proteger os seres humanos5,6,7. Porque o rato Fischer 344 modelos algumas características de F. tularensis infecção dos seres humanos, pode ser um modelo extremamente útil para o desenvolvimento de uma vacina que protege contra pulmonar F. tularensis exposição.
Precisa de uma vacina eficaz para proteger os seres humanos contra a exposição pulmonar a F. tularensis. A mais provável exposição pulmonar como arma F. tularensis seria aerossol bactéria inalada para os pulmões,8. No entanto, geração de aerossol de F. tularensis é perigoso e complicado e requer equipamento especializado e contenção. Uma rota alternativa de exposição pulmonar em ratos que é talvez mais adaptável para vários laboratórios falta equipamento especializado é via intratraqueal inoculação6. Esta técnica utiliza um laringoscópio para a colocação de um cateter dentro da traqueia de um rato anestesiado. Colocação dentro da traqueia, ao invés do esôfago, é verificada por um dispositivo simples que visualiza o fluxo de ar dos pulmões. F. tularensis é posteriormente entregue aos pulmões através do cateter pela administração com uma seringa, seguida pela introdução de ar dentro do cateter para assegurar a entrega pulmonar das bactérias. Em contraste, Jemski5 anteriormente relatados que F. tularensis inoculada em ratos Fischer 344 através da rota intranasal não poderiam ser cultivadas dos pulmões até pós-inoculação de 3 dias, indicando a inoculação intranasal em ratos que Não resultado na entrega direta de bactérias para os pulmões.
Agente selecione formas de F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) requerem procedimentos de contenção de biossegurança nível 3 (BSL3), que impediriam a videografia. No entanto, F. novicida (Fn) está isenta do status de agente selecione devido a sua avirulence em seres humanos saudáveis e pode ser utilizado com segurança em condições de biossegurança nível 2 (BSL2)9,10. Além disso, a Fn serve como base para as vacinas vivas atenuadas que pode proteger contra a exposição pulmonar de F. tularensis quando entregues via intratraqueal inoculação11,12,13. A técnica apresentada aqui permite o estudo de infecções que ocorrem através da rota pulmonar utilizando ratos como um modelo para os seres humanos. Esta técnica pode ser realizada sem a necessidade de equipamento especializado de geração de aerossol. FN foi usado para as técnicas filmadas aqui.

<table><tbody><tr><td>GreenLine fiber optic blade size 0</td><td>Carefusion</td><td>5-5231-00</td><td>Macintosh American profile</td></tr><tr><td>GreenLight system laryngoscope handle</td><td>Carefusion</td><td>4559GSP</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet I.V. Catheter</td><td>EXEL INTERNATIONAL</td><td>26743</td><td></td></tr><tr><td>Slip Tip Sterile Syringes 1mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Broad Point Dressing Thumb Forceps</td><td>Thermo Scientific</td><td>76-302</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L barrier tip</td><td>GeneseeScientific</td><td>24-142</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L pipette tip</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-173</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td><td>Dremel</td><td>3000228</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Rodent anesthesia machine</td><td>Surgivet</td><td>VTC302 Classic T3</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Anesthesia chamber</td><td>Braintree Scientific</td><td>AB 1</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

Infecção pulmonar com a bactéria Francisella tularensis pode levar à doença grave e potencialmente fatal, tularemia, em seres humanos. Devido à atual falta de uma vacina de tularemia aprovado para os seres humanos, pesquisa está focada no desenvolvimento de vacinas utilizando modelos animais apropriados. O rato Fischer 344 tem emergido como um modelo que reflete a susceptibilidade humana à F. tularensis infecção e, portanto, é um modelo atraente para desenvolvimento de vacinas de tularemia. Intratraqueal de inoculação do rato Fischer 344 com F. tularensis imita exposição pulmonar em humanos. A entrega bem sucedida para a traqueia de rato é crítica para entrega pulmonar. Um laringoscópio com iluminação é usado corretamente entubar o tracheae de ratos anestesiados; o correto posicionamento dentro da traqueia é determinado por um dispositivo simples para detectar a respiração. Após a intubação, a cultura de F. tularensis é entregue em uma dose medida via seringa. Esta técnica padroniza entrega pulmonar de F. tularensis dentro da traqueia de rato para avaliar a eficácia da vacina.

A resposta humoral a inoculação intratraqueal de F. tularensis em ratos pode ser determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) contra bactérias inactivados UV, conforme descrito anteriormente,11. Total imunoglobulina G (IgG) resposta de Fischer 344 ratos bactérias inactivados celular foi avaliada post-intratraqueal inoculação com uma cepa atenuada de Fn (107 de inóculo CFU) no dia 14 e dia 28 (Figura 1). Simulação-vacinados ratos receberam intratraquealmente PBS. Aumento de anticorpos de soro contra pós-inoculação de Fn em relação ingênua simulação vacinados animais indica a eficácia da vacinação intratraqueal. Reatividade de soro baixo pode indicar posicionamento incorreto intratraqueal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56123/56123fig1.jpg"> 
Figura 1: Total IgG respostas ao vivo atenuado Fn intratraqueal inoculação em ratos F344. Os soros de ratos de F344 (n = 5) intratraquealmente inoculado com um vivo atenuado estirpe Fn (107 UFC) foram analisados para níveis totais de IgG reactivos com toda célula Fn no dia 14 e dia 28 após inoculação. Simulação-vacinados (ingênuo) ratos (n = 5) foram inoculado intratraquealmente com PBS. Área vermelha denota a reatividade de soros ingênuo (ratos F344 mock-vacinados com PBS). As barras de erro representam o SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56123/56123fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis at JoVE.com

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Este protocolo descreve inoculações intratraqueal de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis. Este procedimento imita pulmonar exposição dos seres humanos a este potencial agente de ameaça biológica e pode ser usado para testar a vacina e a eficácia terapêutica contra tularemia pulmonar.

Intratraqueal inoculação de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K visualizações.  University of Texas San Antonio. Este protocolo descreve inoculações intratraqueal de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis. Este procedimento imita pulmonar exposição dos seres humanos a este potencial agente de ameaça biológica e pode ser usado para testar a vacina e a eficácia terapêutica contra tularemia pulmonar.

Vídeo: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Imunologia e Infecção

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Não invasiva Intratraqueal intubação para estudar a Patologia e Fisiologia do Rato Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medicina

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Biologia

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

Modelo experimental para avaliar a resolução da pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Intratraqueal inoculação de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo