이 연구는 계약 HDTRA1-14-C-0116, 방위 위협 감소 기관 (DTRA) 감염 유전체학 (국방부 #W911NF-11-1-0136)에 우수를 위한 센터에 의해 지원 되었다.

이 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장에 따라 수행 되었다. 설치류와 관련 된 동물 프로토콜 프로토콜 MU009(RA) 텍사스 대학 샌 안토니오 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다.
 1. 카 테 터 준비, 기도 표시기와 F. tularensis Inoculum <ol><li>준비 테 (20 G x 2에서) <ol><li>잘라 바늘에 무딘 하 고 부드러운 바늘의 팁으로 마무리 갈기 20 G x 2는 로타리 도구. 
		참고: 무딘된 바늘의 길이 완전히 무딘된 바늘에 장착 하는 경우 카 테 터 소매에 약 3 mm를 폐지 하는 금속 팁을 허용 해야 합니다. 무딘된 바늘 카 테 터 구조 강성 기도에 카 테 테 르의 배치 허용을 제공 하 고 카 테 테 르 소매에서 튀어나와 무딘된 바늘 팁의 부재 기도에 부상 방지.</li>
		<li>무딘된 바늘과 70% 에탄올을 사용 하 여 카 테 터를 청소 하 고 15 분의 자외선 아래 소독</li>
	</ol></li> <li>준비 기도 표시기 <ol><li>트림 테 오프닝에 앉아서는 공기 단단한 물개를 형성 하는 팁을 수 있도록 1000 µ L 피 펫 팁.</li>
		<li>200 µ L 졸 장벽 피 펫 팁 및 장소 이전 트림된 1000 µ L 피 펫 팁 내부에서 필터 제거.</li>
		<li>팁 팁 다운 지적 이다 때 필터 1000 µ L 피 펫 팁 안에 자유롭게 이동할 수 있도록.</li>
	</ol></li> <li>F. tularensis Inoculum <ol><li>37에 적절 한 천 배지에서 하룻밤 성장 F. tularensis 스트레인 ° C. 다쳤어요 약 100 µ L로는 살 균 한 천 배지에서 세균성 잔디의 접종 루프를 사용 하 여 포함 하는 적절 한 액체 성장 매체의 250 mL 삼각 플라스 크 500ml 접종 (Fn에 대 한: tryptic 간장 국물 (TSB) 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충)와 37에서 밤새 흔들어 품 어 ° c. 
		참고: F. novicida는 비디오에 사용 되는 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 접시에 성장 했다.</li>
		<li>하룻밤 성장된 액체 문화 10 분 동안 실 온에서 4,221 x g에서 원심 및 박테리아 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 제거. 
		주의: 따르십시오 기관 &#39; s biosafety 권장 사항 폐기 상쾌한.</li>
		<li>부드럽게 다시 일시 중지 적절 한 액체 매체의 25 mL와 함께 세균 펠 릿 (Fn: 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 하는 TSB) 25 mL 피 펫을 사용 하 여 10% 글리세롤을 포함.</li>
		<li>1 mL 피 펫, 약 병에 500 µ L aliquots에 resuspended 세균성 문화 수를 사용 하 여 드라이 아이스 또는 에타 놀 목욕에서 동결 하 고-80에서 저장 ° c.</li>
		<li>언된 문화 튜브의 titer를 확인 하려면 두 언된 튜브-80 ° C에 저장 된 제거, 얼음에 녹여 및 직렬 희석에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 성장 매체에 도금 하 여 다음을 수행 (Fn: 0.1%를 포함 하는 TSA L-시스테인 염 산 염)입니다. 격판덮개는 37 ° C에서 incubated 24-48 h 및 콜로 니 형성 단위 (CFU) 냉동된 문화 튜브 (두 병의 평균) 내의 세균 세포의 수를 계산 하려면 열거 됩니다.</li>
		<li>녹고 얼음, 냉동된 유리병으로 세균 inoculum을 준비 하 고 10 7 CFU/100 µ L의 최종 농도에 PBS 가진 문화를 희석. inoculum 100 µ L에서 원하는 CFU 보장할 농도에 있어야 한다 (는 inoculum 내 글리세롤의 최종 농도 쥐의 질을 방지 하기 위해 이상 3%, 수 없습니다). -80 ° C에 저장 하는 냉동된 문화 튜브 준비 후 최대 6 개월까지 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 마 취를 쥐 <ol><li>제대로 운영 isoflurane 기화 기는 마 취 기계 마 취 실 연결.</li>
	<li>연결 시스템을 청소 하는 가스 마 취 챔버에 튜브를 청소 하는 가스.</li>
	<li>4 L/분에 마 취 기계에 산소 흐름을 엽니다</li>
	<li>Isoflurane 기화 기 5%로 설정.</li>
	<li>마 취 약 실에 있는 쥐를 놓습니다. 
	참고: 우리는 일반적으로 8-10 주 오래 된 (130-180 g); 사이 쥐 활용 젊은 쥐는 입 구멍의 작은 크기 때문에이 기술을 통해 접종 어렵다.</li>
	<li>마 취의 유도, 자리를 차지 하는 경우 5 %isoflurane 쥐, 2 L/min에 산소 효과를 유지 합니다. 이 대해 3-10 분 걸립니다</li>
	<li>품질 및 호흡 및 심장 박동, 그리고 발가락 꼬 집 음 시험에서 반사 자극에 반응의 속도 의해 마 취의 깊이 결정합니다. 마 취의 이상적인 깊이 각 호흡 사이 1-1.5의 수로 표시 됩니다.</li>
</ol> 3. Intratracheal 접종 <ol><li>마 취 약 실에서 쥐를 제거 하 고 쥐 삽 관 법에는 쥐를 dorsally 장소. 쥐의 앞 니 자리에 쥐를 잡으려고 홀더 연결. 
	참고: 쥐 절차 동안 자각을 시작, 카 테 터를 제거할 수 있습니다 고 쥐에 마 취의 깊이 비행기를 도달 하는 마 취 챔버.</li>
	<li>지배적인 손을 지원 손 같은 쪽에 넓은 포인트 드레싱 집게 손가락으로 혀를 사용 하 여.</li>
	<li>사용 손 지원 하 고 쥐에 대 한 후 두 경으로 혀를 보안 &#39; s 낮은 턱 및 기관지와 식도 동물의 시각화. 기도 열리고 쥐 통풍으로 닫습니다.</li>
	<li>삽입 카 테 테 르 바늘-20 게이지 무딘를 포함 하는 단계 1.1, 기관에서에서 준비 하 고. 약간의 저항이 있을 수 있습니다 및 기관지로 삽입 될 수 있습니다 &#34; 울 퉁 불 퉁 &#34; 테 바르고 tracheal 연골 때문. 습기 또는 얕은 호흡, 기도 기도의 시각화를 방지 하는 후두개에 의해 덮여 수 있습니다. 열고 기도 밝히기 연골 플랩 하면 후두개 연골의 가장자리를 부드럽게 만지고.</li>
	<li>제거 하면서 테 테에서 무딘 바늘 기도에 남아 있다.</li>
	<li>쥐를 기관지에 삽입 된 카 테 터 주위 호흡 수를 전달 하는 몇 초 수.</li>
	<li>단단히 여 카 테 터에 기관 표시기 좌석. 졸 방 벽의 운동 테 기도에 올바르게 삽입 하는 것을 나타냅니다.</li>
	<li>동물의 가슴 삽 관 법의 평면에 수직으로 직면 하 고 그런 쥐 삽 관 법 대에 누워 있다 확인 하십시오.</li>
	<li>기관 표시기를 제거 하 고 100 µ L를 제공 (10 7 CFU) F. tularensis 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 포함 된 inoculum의 단단히 석 카 테 터 오프닝에 대 한 팁.</li>
	<li>공기 가득한 1 mL 슬립 팁 투베르쿨린 주사기를 연결 하 고 inoculum 쥐의 폐에 도달 되도록 공기의 300 µ L 제공.</li>
	<li>기도에서 카 테 터를 제거 하 고 수술 플랫폼에서 쥐를 제거.</li>
	<li>자각 하는 감 금 소도 돌아갑니다 쥐를 수 있습니다. 호흡이 정상으로 돌아왔다는 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>결정에 F. tularensis CFU 기도에 inoculum 1.3.5 CFU 확인 단계에서 설명한 대로 배달.</li>
	<li>는 inoculum 대신 100 µ L PBS 가진 unvaccinated (순 진) 동물에 3.1 3.9 단계를 반복.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3에 대 한 중요 한 모델이 되 고 있다. F. tularensis 폐 경로 통해 노출은 이러한에 어로 졸으로 전달 하는 때문에 F. tularensis의 무기 형태에 대 한 효능을 보여주는 중요 합니다. 쥐의 Intratracheal 접종 생성 장비, 비싼, 크고 복잡 한에 어로 졸에 대 한 필요 없이 F. tularensis 쥐 폐의 노출을 수 있습니다. 또한 F. tularensis 형태의 선택 에이전트를 활용 하 여 모든 실험 BSL3 제약, 일반적으로 심각 하 게 제한 된 공간에서 발생 하는 필요 합니다. 따라서,이 기술은 그 작업 환경 내에서 유 숙 하는 추가 장비의 양을 최소화 합니다.
Fn videography 활용 F. tularensis 긴장 때문에, 모든 기술 BSL2 제약에서 수행 했다. Biosafety 장비 (전체 후드, 전원된 공기 정화 호흡기 (PAPR), 보호 커버 후드 이중 장갑, 옷)을 입고 담당자 biosafety 내각 내에서 수행 하는 모든 절차를 포함 하는이 기술은 BSL3 환경에의 적응 그리고 이러한 적응 감소 이동성, 손 재주, 그리고 시정. 기도 표시기 테 기도, 그것은 종종 BSL3 조건에서 작업할 때이 결정 하 게 어려운 고려 내에서 올바르게 배치 했다 확인 수 있도록 하는 중요 한 구성 요소입니다.
해부학 적인 몸의 올바른 쥐 "시뮬레이터" 기도 식도, 있으며 이들은 살아있는 동물을 사용 하는 이전 기술을 완벽 하 게 유용한. 그러나, 시뮬레이터 사용 라이브 쥐와 함께 작동 하는 동일한 되지 않습니다. 이 기술은 살아있는 동물에서 올바르게 수행 됩니다 확인 하려면 한 방법은 마 취 쥐에 inoculum으로 Trypan blue 염료를 이용 하 여 수술 후 즉시 동물 안락사 이다. 폐 조직 및 복 부의 절 개 경우 염료 폐와 식도 하지로 전달 했다 발표할 예정 이다. 이 기술에 의해 Fn/피트와 예방 접종은 쥐도 접종과 폐 조직 결정 폐 내 실제 증 착 도금 직후 안락사 수 있습니다.
올바른 intratracheal 접종 tularemia 백신 효능 Fischer 344 쥐에서의 평가 대 한 중요 한 될 것입니다 하지만 그것은 또한 다른 백신 또는 biodefense 포함 쥐 뿐만 아니라, 치료 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 따라서,이 기술은 다양 한 쥐 모델을 활용 하 여 폐 응용 프로그램에 있을 수 있습니다. 장치를 생성 하는 어로 졸에 의해 배달 수도 있지만 biothreat 시나리오와 더 비슷합니다, F. tularensis 의 intratracheal 접종 tularemia 백신 개발을 위한 비교적 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 나타냅니다.

F. tularensis (피트) 인간의 질병의 원인 tularemia. 박테리아는 폐 경로 통해 획득 하는 경우는 높은 사망률 및 사망1폐 렴 성 tularemia을이 끈다. F. tularensis aerosolized 형태와 관련 된 위험으로 인해 biothreat 에이전트 간주 됩니다 그리고 현재 미국에서 인간 사용을 위해 승인 없는 백신 집중 노력 백신 및 치료 대책이 세균성 biothreat의 불법 사용에 대 한 인간의 인구를 보호 하기 위해 폐 렴 성 tularemia 개발 진행 현재입니다.
Tularemia 연구의 많은 마우스 모델의 F. tularensis 감염, 생쥐의 극단적인 감도 및 시 약의 보급에 집중 했다. 그러나, 쥐가 모델2백신 효능을 입증의 어려움으로 인해 백신 개발에 대 한 어려운 모델을 입증 했다. 최근, Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3모델로 개발 되었습니다. 다양 한 F. tularensis 종에 Fischer 344 쥐의 감도 인간의 감도4, 모방 및 쥐 보호 될 수 있다 F. tularensis 폐 문제에 대 한 예방 접종에 의해 보호 하기 위해 알려진 라이브 백신 긴장으로 인간5,,67. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염의 일부 기능 모델, 폐 F. tularensis 으로부터 보호 하는 백신의 개발에 대 한 매우 유용한 모델 수 있습니다 노출.
효과적인 백신 F. tularensis폐 노출에 대 한 인간을 보호 하기 위해 필요 합니다. 무기 F. tularensis 에서 대부분 폐 노출 aerosolized 박테리아 폐8에 흡입 될 것 이다. 그러나, F. tularensis 의 어로 졸 생성 위험 하 고 복잡 하며 전문된 장비 및 포함. 대체 경로 아마도 더 쥐에서 폐 노출의 여러 실험실에 대 한 적응력이 부족 한 전문된 장비는 intratracheal 접종6통해. 이 기술은 마 취 쥐의 기관지 내 카 테 터의 올바른 배치에 대 한 후 두 경을 사용합니다. 기도, 식도, 보다는 오히려 내의 배치는 폐에서 공기를 시각화 하는 간단한 장치에 의해 확인 됩니다. F. tularensis 는 이후 주사기, 카 테 터는 박테리아의 폐 전달 되도록에 공기의 도입 선행으로 관리 하 여 카 테 터를 통해 폐로 전달. Jemski5 이전 그 F. tularensis intranasal 노선을 통해 Fischer 344 쥐에 주사 수 없습니다 수 교양 폐에서 3 일 후 접종까지 보고, 쥐에서 그 intranasal 접종을 나타내는지 않습니다 하는 반면, 하지 직접 전달에서의 결과 폐에 박테리아.
F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) 형태의 선택 에이전트 Biosafety 수준 3 (BSL3) 견제 절차, videography 방지 하는 필요 합니다. 그러나, F. novicida (Fn) 선택 에이전트 상태 건강 한 인간, 그것의 avirulence 때문에 면제 이며 Biosafety 수준 2 (BSL2) 조건9,10에서 안전 하 게 이용 될 수 있다. 또한, Fn F. tularensis 폐 노출 intratracheal 접종11,,1213를 통해 전달 하는 경우에 대하여 보호할 수 있는 라이브 감쇠 백신에 대 한 기준 역할을 합니다. 여기에 제시 된 기술은 인간을 위한 모델 쥐를 이용 하 여 폐 경로 통해 발생 하는 감염의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 특수에 어로 졸 생성 장비에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. Fn는 여기 촬영 기술을 위해 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>GreenLine fiber optic blade size 0</td><td>Carefusion</td><td>5-5231-00</td><td>Macintosh American profile</td></tr><tr><td>GreenLight system laryngoscope handle</td><td>Carefusion</td><td>4559GSP</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet I.V. Catheter</td><td>EXEL INTERNATIONAL</td><td>26743</td><td></td></tr><tr><td>Slip Tip Sterile Syringes 1mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Broad Point Dressing Thumb Forceps</td><td>Thermo Scientific</td><td>76-302</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L barrier tip</td><td>GeneseeScientific</td><td>24-142</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L pipette tip</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-173</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td><td>Dremel</td><td>3000228</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Rodent anesthesia machine</td><td>Surgivet</td><td>VTC302 Classic T3</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Anesthesia chamber</td><td>Braintree Scientific</td><td>AB 1</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

폐 감염 박테리아 Francisella tularensis 심각 하 고 잠재적으로 치명적인 질병, tularemia, 인간에서 발생할 수 있습니다. 인 간에 대 한 승인된 tularemia 백신의 현재 부족, 연구는 적절 한 동물 모델을 활용 하 여 백신 개발에 집중 된다. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염 민감성을 반영 하 고 따라서 tularemia 백신 개발을 위한 매력적인 모델 하는 모델로 떠오르고 있다. F. tularensis 와 Fischer 344 쥐의 Intratracheal 접종 모방 인간에서 폐 노출 합니다. 쥐 기관지에 성공적인 배달 폐 배달을 위해 중요 하다. 조명으로 후 두 경 제대로 마 취 쥐;의 기관을 넣어야 하는 데 사용 됩니다. 기관 내에서 정확한 위치 호흡을 감지 하는 간단한 장치에 의해 결정 됩니다. 삽 관 법, 따라 F. tularensis 문화는 주사기를 통해 측정 된 복용량에 전달 됩니다. 이 기술은 표준화 백신 효능 평가 하 쥐 기관지 내 F. tularensis 의 폐 전달 합니다.

쥐에 F. tularensis 의 intratracheal 접종에 체액 반응 UV 활동 되지 않 ㄴ 박테리아에 대 한 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 결정 될 수 있다11위에서 설명한 대로. 사 전체 셀 박테리아 Fischer 344 쥐의 총 면역 글로불린 G (IgG) 응답은 Fn의 감쇠 긴장 평가 게시물-intratracheal 접종 (107 CFU inoculum) 14 일과 하루 28 (그림 1)에서. Mock 접종 쥐 PBS intratracheally를 받았다. 순진한 모의 예방 접종 동물 기준으로 Fn 후 접종에 대 한 혈 청 항 체 titers 증가 intratracheal 백신 효능을 나타냅니다. 낮은 혈 청 반응 잘못 된 intratracheal 배치를 나타낼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56123/56123fig1.jpg"> 
그림 1: 총 IgG F344 쥐에 살고 있는 감쇠 Fn Intratracheal 접종에 대 한 응답. F344 쥐에서 세라 (n = 5) 라이브와 함께 접종된 intratracheally 감쇠 Fn 스트레인 (107 CFU) 14 일과 28 일 후 접종에서 총 IgG 레벨 전체 셀 Fn과 반응성에 대 한 분석 했다. Mock 예방 접종 (순) 쥐 (n = 5) PBS와 접종된 intratracheally 했다. 빨간 지역 순 세라 (F344 쥐 PBS와 모의 예방 접종)의 반응성을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM. 대표 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56123/56123fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

이 프로토콜 설명으로 Fischer 344 쥐의 예방 접종 intratracheal Francisella tularensis. 이 이렇게 모방이 잠재적인 biothreat 에이전트에 인간의 폐 노출 백신과 폐 tularemia에 대 한 치료 효능을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

Intratracheal 접종의 Fischer 344 쥐 Francisella tularensis 와

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K 조회수.  University of Texas San Antonio. 이 프로토콜 설명으로 Fischer 344 쥐의 예방 접종 intratracheal Francisella tularensis. 이 이렇게 모방이 잠재적인 biothreat 에이전트에 인간의 폐 노출 백신과 폐 tularemia에 대 한 치료 효능을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

연구

면역학 및 감염병학

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

비 침습적 기관 내 삽관 마우스 폐의 병리학 및 생리학을 연구하는

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

의학

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

의 분리를위한 방법 Francisella tularensis 아웃터 세포막

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

생물학

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Intratracheal 접종의 Fischer 344 쥐 Francisella tularensis 와

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