מחקר זה נתמך על ידי את ההגנה איום הפחתת סוכנות (DTRA) תחת חוזה HDTRA1-14-C-0116, ואת המרכז למצוינות גנומיקה זיהום (משרד ההגנה #W911NF-11-1-0136 מקלדת).

עבודה זו בוצעה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. פרוטוקולים בעלי חיים המערבים מכרסמים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC) תחת פרוטוקול MU009(RA).
 1. להכין קטטר לקנה מחוון, פ tularensis Inoculum <ol><li>להכין קטטר (20 G x 2 ב) <ol><li>לחתוך את 20 G x 2 ב המחט ולטחון קצה המחט של בלאנט, חלקה לסיים עם כלי רוטרי. 
		הערה: אורך המחט קהות צריך לאפשר את הטיפ מתכת לבטל כ 3 מ מ לתוך שרוול קטטר כשהוא מתיישב על המחט קהות. המחט קהות נותן את הקטטר קשיחות מבנית כדי לאפשר מיקום של הקטטר לקנה, העדר של קצה המחט קהות המגיחה מתוך שרוול קטטר מונע פגיעה לקנה הנשימה.</li>
		<li>לנקות את המחטים קהות, קטטרים באמצעות אתנול 70% ולחטא תחת אור UV במשך 15 דקות</li>
	</ol></li> <li>להכין את קנה הנשימה מחוון <ol><li>לקצץ טיפ פיפטה 1,000 µL כדי לאפשר את הטיפ לשבת לתוך חור קטטר, טופס של החותם לאוויר.</li>
		<li>להסיר מסנן µL תרסיס מכשול פיפטה טיפ 200, המקום בפנים הטיפ פיפטה החתוך בעבר µL 1,000-</li>
		<li>להבטיח המסנן יכול לנוע בחופשיות בתוך קצה פיפטה 1,000 µL כאשר הטיפ הוא הצביע טיפ למטה.</li>
	</ol></li> <li>Inoculum tularensis פ <ol><li>לגדול tularensis פ עומס בן לילה על צלחת אגר המתאימה ב- 37 ° שריטה ג כ 100 µL של הדשא חיידקים מהצלחת אגר עם סטרילי מזריקים לולאה ולהשתמש לחסן 500 מ"ל Erlenmeyer בקבוק המכיל 250 מ של מדיום הגידול נוזלי המתאים (עבור Fn: ציר סויה tryptic (TSB) בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) דגירה רועד בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס. 
		הערה: novicida פ משמש הוידאו גדל על צלחת אגר (TSA) tryptic סויה בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה נוזלי מבוגר ב g 4,221 x בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר חיידקים. 
		התראה: פעל המוסד &#39; המלצות אבטחה s כדי למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>בעדינות מחדש להשעות בגדר חיידקי 25 מ של מדיום נוזלי המתאים (Fn: TSB בתוספת 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט) המכיל 10% גליצרול, באמצעות פיפטה 25 מ ל.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, aliquot התרבות חיידקי resuspended לתוך 500 aliquots µL, בקבוקים, להקפיא באמבט קרח יבש/אתנול, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>כדי לקבוע את כייל של הבקבוקונים תרבות קפוא, להסיר שתי מבחנות קפוא המאוחסנים ב- 80 ° C, להפשיר על קרח, ולבצע דילולים טורי, באגירה פוספט מלוחים (PBS) ואחריו ציפוי על מדיום הגידול המתאים (Fn: TSA המכיל 0.1% L-ציסטאין הידרוכלוריד). צלחות הן מודגרות h 24-48-37 מעלות צלזיוס, יחידות ויוצרים מושבה (CFU) ממוספרים כדי לחשב את מספר תאים חיידקיים בתוך הבקבוקונים תרבות קפואים (ממוצע של שתי מבחנות).</li>
		<li>להכין את inoculum חיידקים על ידי מפשיר בקבוקון קפוא בקרח ולאחר מכן לדלל את התרבות עם PBS הריכוז הסופי של 10 7 CFU/100 µL. Inoculum צריך להיות בריכוז שיניבו את CFU הרצוי ב- 100 µL (הריכוז הסופי של גליצרול בתוך inoculum לא יכול להיות יותר מ- % 3, כדי למנוע חנק של העכברוש). תרבות קפוא הבקבוקונים מאוחסנים ב- 80 ° C יכול לשמש עד שישה חודשים לאחר הכנה-</li>
	</ol></li></ol> 2. עכברוש הרדמה <ol><li>להתחבר לחדר הרדמה מכשיר אידוי הפעלה כראוי איזופלוריין של מכונת הרדמה.</li>
	<li>חיבור הגז ניקוי צינור על תא הרדמה לגז ניקוי המערכת.</li>
	<li>פתח את זרימת החמצן על מכונת הרדמה כדי 4 ליטרים לדקה</li>
	<li>להגדיר את מאדה איזופלוריין 5%-</li>
	<li>למקם את החולדה בבית הבליעה הרדמה. 
	הערה: אנו בדרך כלל מנצלים חולדות בין 8-10 שבועות (130-180 גרם); עכברים צעירים שקשה לחסן באמצעות טכניקה זו בשל גודלו הקטן של חלל הפה.</li>
	<li>כאשר תנאי הגיוס של הרדמה התרחש, לשמר את החולדה-איזופלוריין 5%, 2 ל'/min חמצן אפקט. זה לוקח בערך 3-10 דקות</li>
	<li>לקבוע את העומק של הרדמה על ידי האיכות ואת קצב הנשימה פעימות הלב, ואת תגובת רפלקס גירוי כמו במבחן קמצוץ הבוהן. אידיאלי עומק ההרדמה שציין רוזן s 1-1.5 בין כל נשימה.</li>
</ol> 3. חיסון Intratracheal <ol><li>להסיר את החולדה מן החדר הרדמה ולמקם את העכברוש dorsally על הדוכן צנרור מכרסמים. לצרף את השיניים הקדמיות של עכברוש המחזיק כדי לשמור עכברוש במקום. 
	הערה: אם החולדה מתחיל להתעורר במהלך ההליך, ניתן להסיר את הקטטר, החולדה חזר לחדר הרדמה כדי להגיע למטוס עמוק יותר של הרדמה.</li>
	<li>להשתמש ביד הדומיננטית לעבור באותו צד של תמיכה יד הלשון עם נקודה רחבה ההלבשה האגודל מלקחיים.</li>
	<li>שימוש תומכת יד ובטוח הלשון laryngoscope נגד העכברוש, &#39; s להוריד את הלסת, ולהמחיש את קנה הנשימה והושט של החיה. קנה הנשימה לפתוח ולסגור כמו החולדה נושם.</li>
	<li>הוסף הצנתר המכיל 20 גאייג-קהה-מחט, מוכן בשלב 1.1, לתוך קנה הנשימה. אולי יש התנגדות קלה, וייתכן הכניסה לתוך קנה הנשימה &#34; באמפי &#34; עקב הקטטר לשפשף את הסחוסים בקנה הנשימה. בשל לחות או נשימה רדודה, קנה הנשימה יכול להיות מכוסה האפיגלוטיס המונע ויזואליזציה של קנה הנשימה. בעדינות לגעת בקצה של הסחוס האפיגלוטיס יגרום הכנף סחוס לפתוח ולחשוף את קנה הנשימה.</li>
	<li>הסר קהה-המחט של הקטטר תוך הקפדה על הקטטר נשאר לקנה.</li>
	<li>לאפשר כמה שניות לעבור העכברוש להיות מסוגל לנשום סביב קטטר מוכנס לתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>מושב בחוזקה מחוון קנה הנשימה אל הקטטר פתיחה. תנועה של המכשול תרסיס יציין הצנתר הוכנס כהלכה לתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>להבטיח כי החולדה שוכבת על הדוכן צנרור כך בחזה של החיה פונה בניצב למישור של העמדה צנרור.</li>
	<li>להסיר את מחוון קנה הנשימה ולספק 100 µL (10 7 CFU) של inoculum המכיל tularensis פ באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, בחוזקה ישיבה הטיפ כנגד הפתח קטטר.</li>
	<li>לצרף 1 מ"ל slip עצה טוברקולין מזרק מלא אוויר ולספק 300 µL של אוויר כדי לוודא inoculum יגיע לריאות של העכברוש.</li>
	<li>להסיר את הצנתר קנה הנשימה ולהסיר את החולדה פלטפורמת כירורגי.</li>
	<li>לאפשר את החולדה לעורר ולהחזיר לכלוב. ודא כי הנשימה חזר לשגרה.</li>
	<li>לקבוע את CFU ב tularensis פ inoculum כפי שמתואר בשלב 1.3.5 כדי לאשר את CFU יועבר. בתוך קנה הנשימה.</li>
	<li>חזור על השלבים 3.1-3.9 על חוסנו (תמים) חיות PBS µL 100 במקום inoculum.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Natural+History+of+Pneumonic+Tularemia+in+Female+Fischer+344+Rats+after+Inhalational+Exposure+to+Aerosolized+Francisella+tularensis+subspecies+tularensis+Strain+Schu+S4.">The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4.</a> Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).</li><li>Ray, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fischer+344+rat+reflects+human+susceptibility+to+Francisella+pulmonary+challenge+and+provides+a+new+platform+for+virulence+and+protection+studies.">The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies.</a> PloS one. 5, e9952 (2010).</li><li>Jemski, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tularemia:+comparison+of+selected+routes+of+vaccination+in+Fischer+344+rats.">Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats.</a> Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).</li><li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+of+Fischer+344+rats+against+pulmonary+infections+by+Francisella+tularensis+type+A+strains.">Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains.</a> Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).</li><li>Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+contribute+to+effective+vaccination+against+respiratory+infection+by+type+A+Francisella+tularensis+strains.">Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains.</a> Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).</li><li>Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularaemia:+bioterrorism+defence+renews+interest+in+Francisella+tularensis.">Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).</li><li>Kingry, L. C., Petersen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+review+of+Francisella+tularensis+and+Francisella+novicida.">Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).</li><li>Rohmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Francisella+tularensis+genomes+reveals+evolutionary+events+associated+with+the+emergence+of+human+pathogenic+strains.">Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains.</a> Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).</li><li>Chu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+Francisella+novicida+vaccine+protects+against+Francisella+tularensis+pulmonary+challenge+in+rats+and+non-human+primates.">Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).</li><li>Signarovitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Immunization+with+Live+Attenuated+Francisella+novicida+U112&#916;iglB+Protects+against+Pulmonary+F.+tularensis+SCHU+S4+in+the+Fischer+344+Rat+Model.">Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112&#916;iglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model.</a> PloS one. 7 (10), e47639 (2012).</li><li>Cunningham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+vaccine+efficacy+by+expression+of+a+TLR5+ligand+in+the+defined+live+attenuated+Francisella+tularensis+subsp.+novicida+strain+U112DiglB::fljB.">Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB.</a> Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

העכברוש פישר 344 הופך להיות מודל חשוב עבור פיתוח חיסון tularemia3. חשיפה tularensis פ דרך המסלול ריאתי הוא קריטי עבור הוכחת יעילות כנגד צורות שהוסבה לכלי נשק של tularensis פ, כי אלה יימסרו אירוסולים. חיסון Intratracheal של העכברוש מקלה על חשיפה של הריאות עכברוש tularensis פ ללא צורך גדול, יקר ומסובך תרסיס יצירת ציוד. כל הניסויים ניצול הסוכן בחר צורות של פ tularensis בנוסף דורשים בלימה BSL3, אשר בדרך כלל מתרחשת בחלל הוגבלה בצורה קשה. לפיכך, טכניקה זו מקטינה את כמות ציוד נוסף שצריך להיות שוכן בתוך סביבת העבודה הזה.
בגלל Fn היה המתח tularensis פ מנוצל עבור צילום וידאו, כל הטכניקות בוצעו תחת בלימה BSL2. עיבוד של טכניקה זו לסביבה BSL3 כולל כל ההליכים מבוצעים על אבטחה הקבינט על ידי אנשי ללבוש ציוד אבטחה (מלא הוד, מכונת ההנשמה מטהר אוויר מופעל (PAPR), לכיסוי כל עם המנוע, כפול כפפות, מגפונים), ולהפחית עיבודים אלה ניידות, מיומנות, ואת ניראות. מחוון קנה הנשימה הוא מרכיב חשוב המאפשר את האישור כי הקטטר בוצעה כהלכה בתוך קנה הנשימה, בהתחשב שלעיתים קרובות קשה לעשות אחרת קביעה זו בעת עבודה בתנאים BSL3.
ישנם עכברים אנטומית "סימולטורים" של קנה הנשימה ואת הושט, ואלה שימושי לשפר את הטכניקה עובדים עם בעלי חיים. עם זאת, עבודה עם הסימולטור אינה זהה לעבודה עם עכברוש חי. אחד האמצעים כדי לקבוע אם טכניקה זו מבוצעת כהלכה החי היא לנצל Trypan blue לצבוע גם inoculum על עכברוש anesthetized, לאחר ההליך מיד להרדימו. דיסקציה של רקמת הריאה, הבטן תחשוף אם לצבוע נמסרה לתוך הריאות לא הוושט. עכברוש זה יש חוסן עם Fn (מטר) באמצעות הטכניקה הזו יכולה להרדימם גם זמן קצר לאחר חיסון, רקמת הריאה מצופה כדי לקבוע התצהיר בפועל בתוך הריאות.
חיסון intratracheal הנכון יהיה חשוב להערכת יעילות החיסון tularemia העכברוש פישר 344, אבל זה יכול להיות גם שימושי עבור חיסון אחרות ו/או יישומים טיפוליים בחולדות, כולל biodefense. לפיכך, טכניקה זו ייתכן להתאמה למגוון רחב של יישומים ריאתי ניצול המודל עכברוש. בעוד משלוח באמצעות תרסיס יוצר המכשיר עשוי להיות דומה יותר תרחיש biothreat, חיסון intratracheal של tularensis פ מייצג חלופה פשוטה יחסית, חסכונית לפיתוח חיסון tularemia.

פ tularensis (Ft) גורם המחלה האנושית, tularemia. כאשר החיידק נרכשים דרך המסלול ריאתי, זה מוביל tularemia pneumonic, אשר יש תחלואה גבוהה התמותה1. פ tularensis נחשב סוכן biothreat בשל הסכנה הקשורים לטפסים שידורה, ויש כיום אין חיסון שאושרו לשימוש בני אדם בארה ב מאמץ אינטנסיבי נמצא בעיצומו בימים אלה לפתח חיסונים, צעדים טיפוליים נגד tularemia pneumonic, כדי להגן על האוכלוסייה האנושית נגד השימוש הפסול הזה biothreat חיידקי
רוב המחקר tularemia התמקדה המודל העכבר, בשל הרגישות של עכברים לזיהום פ tularensis , השכיחות של נוגדנים. עם זאת, עכברים הוכיחו להיות דוגמנית קשה לפיתוח חיסון, בשל הקושי של הוכחת יעילות החיסון זה מודל2. לאחרונה, העכברוש פישר 344 פותחה כמודל עבור פיתוח חיסון tularemia3. הרגישות של החולדה פישר 344 תת השונים פ tularensis מחקה רגישות אנושית4, חולדות יכול להיות מוגן נגד אתגר ריאתי פ tularensis על ידי חיסון באמצעות זן תרכיב חי ידוע של הגנה בני5,6,7. כי החולדה פישר 344 מודלים תכונות מסוימות של זיהום פ tularensis של בני אדם, זה יכול להיות מודל מאוד שימושי עבור הפיתוח של חיסון המגן מפני ריאתי tularensis פ חשיפה.
חיסון יעיל צריך להגן. על בני האדם מפני חשיפה ריאתי tularensis פ. החשיפה ריאתי סביר של שהוסבה לכלי נשק tularensis פ יהיה aerosolized חיידקים בשאיפה לתוך הריאות8. עם זאת, תרסיס מהדור tularensis פ הוא מסוכן ובלתי מסורבלת, דורש ציוד מיוחד הבלימה. מסלול חלופי של חשיפה ריאתי בחולדה שהוא אולי יותר להתאמה עבור מספר מעבדות חסר ציוד מיוחד היא דרך חיסון intratracheal6. טכניקה זו מנצל laryngoscope את המיקום הנכון של צנתר בתוך קנה הנשימה של עכברוש anesthetized. מיקומה בתוך קנה הנשימה, יותר מאשר את הוושט, מאומת על ידי מכשיר פשוט מדמיין זרימת האוויר מהריאות. פ tularensis מועברת לאחר מכן לריאות דרך הצנתר על ידי המינהל עם מזרק, ואחריו החדרת אוויר לתוך הצנתר על מנת להבטיח משלוח ריאתי של החיידקים. לעומת זאת, Jemski5 דיווח בעבר כי tularensis פ מחוסן לתוך פישר 344 חולדות דרך המסלול תוך-אפי יכול לא להיות תרבותי מן הריאות עד 3 ימים לאחר חיסון, המציין את חיסון תוך-אפי בחולדות אינה לא תוצאה ישירה של חיידקים לתוך הריאות.
הסוכן בחר צורות של tularensis פ (פ tularensis subsp. tularensis, subsp. tularensis פ holarctica) מחייבים הליכים הבלימה אבטחה ברמה 3 (BSL3), אשר תמנע צילום וידאו. עם זאת, פ novicida (Fn) פטור הסוכן בחר מצב עקב שלה avirulence בבני אדם בריאים, יכול להיות מנוצל בבטחה תחת אבטחה ברמה 2 (BSL2) תנאים9,10. יתר על כן, Fn משמש כבסיס עבור חיסונים הקלוש בשידור חי יכול להגן מפני חשיפה ריאתי tularensis פ כאשר מתבצעת דרך חיסון intratracheal11,12,13. הטכניקה המובאת כאן מאפשר הלימוד של זיהומים המתרחשים דרך המסלול ריאתי ניצול חולדות כמודל לבני. טכניקה זו יכולה להתבצע ללא צורך ציוד מניבות תרסיס מיוחד. Fn שימש את הטכניקות הבוליוודי.

<table><tbody><tr><td>GreenLine fiber optic blade size 0</td><td>Carefusion</td><td>5-5231-00</td><td>Macintosh American profile</td></tr><tr><td>GreenLight system laryngoscope handle</td><td>Carefusion</td><td>4559GSP</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet I.V. Catheter</td><td>EXEL INTERNATIONAL</td><td>26743</td><td></td></tr><tr><td>Slip Tip Sterile Syringes 1mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Broad Point Dressing Thumb Forceps</td><td>Thermo Scientific</td><td>76-302</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L barrier tip</td><td>GeneseeScientific</td><td>24-142</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L pipette tip</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-173</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td><td>Dremel</td><td>3000228</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Rodent anesthesia machine</td><td>Surgivet</td><td>VTC302 Classic T3</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Anesthesia chamber</td><td>Braintree Scientific</td><td>AB 1</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

זיהום ריאתי עם החיידק Francisella tularensis יכול לגרום למחלה רצינית וקטלניים, tularemia, אצל בני אדם. עקב המחסור הנוכחי חיסון tularemia שאושרו עבור בני אדם, המחקר מתמקדת פיתוח החיסון ניצול מודלים בעלי חיים המתאימים. העכברוש פישר 344 התפתחה מודל זה משקף את הרגישות האנושית tularensis פ זיהום, ובכך הוא מודל אטרקטיבי עבור פיתוח החיסון tularemia. חיסון Intratracheal של העכברוש 344 פישר עם פ tularensis מחקה חשיפה ריאתי אצל בני אדם. שילוח מוצלח לתוך קנה הנשימה עכברוש הוא קריטי עבור משלוח ריאתי. Laryngoscope עם תאורה משמש לצנרר כראוי את tracheae של מרדימים חולדות; המיקום הנכון בתוך קנה הנשימה נקבעת על ידי מכשיר פשוט לזהות את הנשימה. בעקבות צנרור, התרבות tularensis פ מועבר ב מנה נמדד באמצעות מזרק. טכניקה זו המשקלל ריאתי מסירת tularensis פ בתוך קנה הנשימה העכברושים להעריך את יעילות החיסון.

תגובת חיסון intratracheal של tularensis פ בחולדה ההורמונאלית יכול להיקבע על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) נגד חיידקים UV-לא פעיל, כפי שתואר לעיל11. סה כ אימונוגלובולין G (IgG) בתגובה של פישר 344 חולדות לא מופעל כל התא חיידקים היה חיסון המוערך פוסט-intratracheal עם זן הקלוש של Fn (107 CFU inoculum)-ביום 14 וביום 28 (איור 1). חולדות מוק-חיסון קיבל PBS intratracheally. עלייה titers בסרום נוגדן נגד חיסון שלאחר Fn ביחס תמים מוק-חיסון חיות מציין את יעילות החיסון intratracheal. תגובתיות בסרום נמוך עשוי להצביע על מיקום intratracheal שגוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56123/56123fig1.jpg"> 
איור 1: סה כ אג תגובות לחיות הקלוש Fn Intratracheal חיסון בחולדות F344. סרה של חולדות F344 (n = 5) intratracheally חוסנו עם חי הקלוש זן Fn (107 CFU) נותחו עבור רמות IgG סה כ תגובתי עם התא כולו Fn יום 14, חיסון לאחר 28 יום. חולדות חוסנו-מוק (תמים) (n = 5) היו intratracheally חוסנו עם PBS. האזור אדום מציין תגובתיות של sera תמימה (חולדות F344 שחוסנו ואימץ PBS). קווי השגיאה מייצגים ב- SEM <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56123/56123fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis at JoVE.com

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.

Intratracheal חיסון של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K Views.  University of Texas San Antonio. פרוטוקול זה מתאר intratracheal ההזרקות של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis. הליך זה מחקה ריאתי החשיפה של בני אדם סוכן biothreat פוטנציאל זה יכול לשמש כדי לבדוק את החיסון והיעילות הטיפולית נגד tularemia ריאתי.

Video: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medicine

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

שיטת בידוד של Francisella tularensis הקרומים החיצוניים

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Biology

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Intratracheal חיסון של פישר 344 חולדות עם Francisella tularensis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video