Questo studio è stato sostenuto dall'agenzia di riduzione di minaccia di difesa (DTRA) sotto contratto HDTRA1-14-C-0116 e il centro di eccellenza nel campo della genomica di infezione (DOD n #W911NF-11-1-0136).

quest'opera è stata eseguita in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Protocolli degli animali che coinvolgono roditori sono stati approvati dall'Università del Texas a San Antonio istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) sotto protocollo MU009(RA).
 1. preparazione del catetere, indicatore di Trachea e F. tularensis inoculo <ol><li>Preparare il catetere (20 x 2 pollici) <ol><li>tagliare il 20 x 2 in ago e macinare la punta dell'ago un Blunt e liscia finitura con un utensile rotante. 
		Nota: La lunghezza dell'ago smussato dovrebbe consentire la punta di metallo di recedere circa 3 mm nel manicotto del catetere quando completamente inserito sull'ago smussato. L'ago blunted dà la rigidità strutturale del catetere per consentire il posizionamento del catetere nella trachea, e l'assenza della punta dell'ago blunted sporgenti dal manicotto del catetere evita la lesione alla trachea.</li>
		<li>Pulire il blunted aghi e cateteri con etanolo al 70% e sterilizzare per 15 minuti alla luce UV</li>
	</ol></li> <li>Preparare Trachea indicatore <ol><li>tagliare la punta di una pipetta di 1.000 µ l per permettere che la punta per sedersi in un'apertura di catetere e formare una guarnizione ermetica.</li>
		<li>Rimuovere un filtro da un 200 µ l aerosol barriera pipetta suggerimento e posto dentro la punta della pipetta precedentemente tagliati e 1.000 µ l.</li>
		<li>Garantire il filtro possa muoversi liberamente all'interno la punta della pipetta 1.000 µ l quando la punta è puntata punta a.</li>
	</ol></li> <li>F. tularensis inoculo <ol><li>Grow F. tularensis ceppo durante la notte sulla piastra di agar appropriato a 37 ° C. raschiare circa 100 µ l del prato batterico dalla piastra di agar con una sterile inoculando ciclo e utilizzare per inoculare un matraccio di Erlenmeyer contenente 250 mL di terreno di coltura liquido appropriato da 500 mL (per Fn: brodo di soia triptico (TSB) completato con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) e incubare agitazione durante la notte a 37 ° C. 
		Nota: F. novicida utilizzato nel video era cresciuta su una piastra di agar (TSA) di soia triptico completata con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato.</li>
		<li>Centrifugare la coltura liquida coltivata durante la notte a 4.221 x g a temperatura ambiente per 10 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet batteri. 
		Attenzione: Si prega di seguire istituzione &#39; consigli di biosicurezza s per eliminare il surnatante.</li>
		<li>Delicatamente risospendere il pellet batterico con 25 mL di terreno liquido appropriato (Fn: TSB completati con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) contenente 10% glicerolo, utilizzando una pipetta da mL 25.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta da 1 mL, aliquota la coltura batterica sedimento in 500 aliquote µ l in fiale, congelare in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Per determinarne il titolo dei flaconi di coltura congelata, rimuovere due flaconcini congelati conservati a-80 ° C, scongelare su ghiaccio ed eseguire diluizioni in tampone fosfato salino (PBS) seguita da placcatura su terreno di coltura appropriato (Fn: TSA contenente 0,1% L-cisteina cloridrato). Le piastre sono incubate 24-48 h a 37 ° C e unità formanti colonie (CFU) vengono enumerate per calcolare il numero di cellule batteriche all'interno i flaconi di coltura congelata (media di due flaconcini).</li>
		<li>Preparare l'inoculo batterico dallo scioglimento di un flaconcino congelato sul ghiaccio e poi diluire la cultura con PBS alla concentrazione finale di 10 7 CFU/100 µ l. L'inoculo deve essere ad una concentrazione che consentiranno di ottenere il desiderato CFU in 100 µ l (la concentrazione finale di glicerolo all'interno dell'inoculo non può essere superiore al 3%, per evitare asfissia del ratto). Flaconi di coltura congelati conservati a-80 ° C possono essere utilizzati per fino a sei mesi dopo la preparazione.</li>
	</ol></li></ol> 2. Anestesia di ratto <ol><li>collegare la camera di anestesia per il vaporizzatore di isoflurane correttamente operativo di una macchina di anestesia.</li>
	<li>Collegare il tubo sulla camera di anestesia per il sistema di evacuazione dei gas di evacuazione dei gas.</li>
	<li>Aprire il flusso di ossigeno sulla macchina di anestesia a 4 L/min.</li>
	<li>Impostare il vaporizzatore di isoflurane al 5%.</li>
	<li>Porre il ratto nella camera anestesia. 
	Nota: In genere utilizziamo ratti tra 8-10 settimane di età (130-180 g); più giovani ratti sono difficili da inoculare tramite questa tecnica a causa delle piccole dimensioni della cavità di bocca.</li>
	<li>Quando l'induzione dell'anestesia ha avuto luogo, mantenere il ratto al 5% isoflurane, 2 L/min di ossigeno per effetto. Questa operazione richiede circa 3-10 min</li>
	<li>Determinare la profondità dell'anestesia per la qualità e il tasso di respirazione e battito cardiaco e la reazione alla stimolazione riflessa come nella prova di pizzico di punta. Ideale profondità dell'anestesia è indicato da 1-1.5 s totali tra ogni respiro.</li>
</ol> 3. Intratracheale inoculazione <ol><li>rimuovere il ratto dalla camera di anestesia e posiziona il ratto dorsalmente sul cavalletto intubazione del roditore. Allegare i denti anteriori del ratto al titolare per mantenere ratto sul posto. 
	Nota: Se il topo comincia a risvegliarsi durante la procedura, il catetere può essere rimosso e il ratto restituito alla camera di anestesia per raggiungere un piano più profondo dell'anestesia.</li>
	<li>Utilizzare mano dominante per muovere la lingua stesso lato come mano di sostegno con forcipe punto ampia medicazione pollice.</li>
	<li>Uso mano di supporto e fissare la linguetta con il laringoscopio contro il ratto &#39; s mandibola e visualizzare la trachea e l'esofago dell'animale. La trachea si aprirà o chiuderà come ratto respira.</li>
	<li>Inserire il catetere contenente un ottuso calibro 20-ago, preparata al punto 1.1, nella trachea. Potrebbe esserci una leggera resistenza e inserimento nella trachea può essere &#34; su strada sconnessa &#34; dovuto il catetere strofinando le cartilagini tracheale. Dovuti a umidità o respirazione superficiale, la trachea può essere coperto dall'epiglottide che impedisce la visualizzazione della trachea. Toccando delicatamente il bordo della cartilagine epiglottide causerà il lembo di cartilagine aprire e scoprire la trachea.</li>
	<li>Rimuovere l'ago smussato dal catetere, garantendo nel contempo il catetere rimane nella trachea.</li>
	<li>Attendere alcuni secondi passare per ratto per poter respirare intorno catetere inserito nella trachea.</li>
	<li>Saldamente l'indicatore di trachea sul catetere di apertura. Movimento della barriera aerosol indicherà il catetere è inserito correttamente nella trachea.</li>
	<li>Garantire che il ratto è posa nello stand di intubazione tale che il petto dell'animale si trova di fronte perpendicolare al piano dello stand intubazione.</li>
	<li>Rimuovere l'indicatore di trachea e 100 µ l (10 7 CFU) dell'inoculo contenente utilizzando una punta di pipetta 200 µ l di F. tularensis, posti a sedere saldamente la punta contro l'apertura di catetere.</li>
	<li>Applicare una siringa per tubercolina 1ml antiscivolo punta riempita d'aria e consegnare 300 µ l di aria per garantire l'inoculo raggiunge i polmoni del ratto.</li>
	<li>Rimuovere il catetere dalla trachea e rimuovere il ratto dalla piattaforma chirurgica.</li>
	<li>Consentire il topo a risvegliare e tornare alla gabbia. Assicurarsi che la respirazione è tornato alla normalità.</li>
	<li>Determinare il CFU in F. tularensis inoculo come descritto al punto 1.3.5 per confermare il CFU consegnato nella trachea.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1-3.9 su animali non vaccinati (ingenuo) con 100 µ l PBS al posto dell'inoculo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tularemia.">Tularemia.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).</li><li>Lyons, C. R., Wu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Francisella+tularensis+infection.">Animal models of Francisella tularensis infection.</a> Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).</li><li>Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il ratto di Fischer 344 sta diventando un importante modello per tularemia vaccino sviluppo3. L'esposizione a F. tularensis attraverso la via polmonare è fondamentale per dimostrare l'efficacia contro weaponized forme di F. tularensis, perché questi sono trasportati sotto forma di aerosol. Intratracheale inoculazione del ratto facilita l'esposizione dei polmoni del ratto di F. tularensis senza la necessità di aerosol grande, costoso e complicato dispositivo di generazione. Tutti gli esperimenti che utilizzano moduli selezionare agente di F. tularensis inoltre richiedono BSL3 contenimento, che in genere si verifica nello spazio limitato severamente. Quindi, questa tecnica riduce al minimo la quantità di apparecchiature aggiuntive che deve essere ospitato all'interno di tale ambiente di lavoro.
Perché Fn è stato il ceppo di F. tularensis utilizzato per videografia, tutte le tecniche sono state eseguite sotto BSL2 contenimento. Adattamento di questa tecnica all'ambiente BSL3 include tutte le procedure eseguite all'interno di una cappa di biosicurezza da personale indossando l'attrezzatura di biosicurezza (cappuccio completo, respiratore alimentato aria (PAPR), coperchio di protezione con cappuccio, guanti, stivaletti), e questi adattamenti riducono la mobilità, la destrezza e la visibilità. L'indicatore della trachea è una componente importante che permette la conferma che il catetere è stato correttamente posizionato all'interno della trachea, considerando che è spesso difficile fare altrimenti questa determinazione quando si lavora in condizioni BSL3.
Ci sono anatomicamente corretto ratto "simulatori" che hanno una trachea e l'esofago, e questi sono utili per perfezionare la tecnica prima di lavorare con gli animali vivi. Tuttavia, lavorare con il simulatore non è identico a lavorare con un ratto dal vivo. Un mezzo per determinare se questa tecnica viene eseguita correttamente nell'animale vivo è di utilizzare il colorante Trypan blu come inoculo su un ratto anestetizzato e dopo la procedura immediatamente eutanasia animale. Dissezione del tessuto del polmone e dello stomaco rivelerà se il colorante è stato consegnato in polmoni e non l'esofago. Un topo che è stato vaccinato con Fn/Ft da questa tecnica può anche essere euthanized poco dopo l'inoculazione e tessuto polmonare placcato per determinare la reale deposizione all'interno del polmone.
L'inoculazione intratracheale corretta sarà importante per la valutazione dell'efficacia del vaccino di tularemia nel ratto Fischer 344, ma può anche essere utile per altri vaccini e/o applicazioni terapeutiche in ratti pure, compreso biodifesa. Quindi, questa tecnica può essere adattabile a svariate applicazioni polmonare che utilizzano il modello di ratto. Mentre la consegna di un aerosol elettromagnetico può essere più simile a uno scenario di biothreat, l'inoculazione di intratracheale di F. tularensis rappresenta un'alternativa relativamente semplice ed economica per lo sviluppo di vaccini di tularemia.

F. tularensis (Ft) causa la malattia umana, tularemia. Quando i batteri vengono acquisiti attraverso la via polmonare, questo porta alla tularemia polmonare, che ha un'elevata morbilità e mortalità1. F. tularensis è considerato un agente biothreat dovuto il pericolo associato con forme aerosolizzate e non esiste attualmente un vaccino approvato per uso umano negli Stati Uniti Un intenso sforzo è attualmente in corso per sviluppare vaccini e misure terapeutiche contro tularemia polmonare, per proteggere la popolazione umana contro l'uso illecito di questa biothreat batterica.
Gran parte della ricerca di tularemia è concentrata sul modello del mouse, a causa della estrema sensibilità dei topi all'infezione di F. tularensis e la prevalenza dei reagenti. Tuttavia, i topi hanno dimostrato di essere un modello difficile per lo sviluppo di vaccini, a causa della difficoltà di dimostrare l'efficacia del vaccino in questo modello2. Recentemente, il ratto di Fischer 344 è stato sviluppato come un modello per lo sviluppo di tularemia vaccino3. La sensibilità del ratto Fischer 344 a varie sottospecie di F. tularensis imita sensibilità umana4e ratti possono essere protetti contro F. tularensis polmonare sfida dalla vaccinazione con un ceppo del vaccino vivo conosciuto per proteggere gli esseri umani5,6,7. Perché il ratto di Fischer 344 modelli alcune caratteristiche di F. tularensis infezione degli esseri umani, può essere un modello estremamente utile per lo sviluppo di un vaccino che protegge contro polmonare F. tularensis esposizione.
Ha bisogno di un vaccino efficace proteggere l'uomo contro l'esposizione polmonare di F. tularensis. Il più probabile esposizione polmonare da weaponized F. tularensis sarebbe aerosolized batteri inalati nei polmoni8. Tuttavia, generazione di aerosol di F. tularensis è pericoloso e ingombrante e richiede attrezzature specializzate e contenimento. Un percorso alternativo di esposizione polmonare nel ratto che è forse più adattabile per i laboratori più carente di attrezzature specializzate è via intratracheale inoculazione6. Questa tecnica utilizza un laringoscopio per il corretto posizionamento di un catetere all'interno della trachea di un ratto anestetizzato. Posizionamento all'interno della trachea, piuttosto che l'esofago, è verificato da un dispositivo semplice che Visualizza il flusso d'aria dai polmoni. F. tularensis viene successivamente recapitato nei polmoni attraverso il catetere dall'amministrazione con una siringa, seguita dall'introduzione di aria nel catetere per garantire una consegna polmonare dei batteri. Al contrario, che indica che l'inoculazione intranasale in ratti fa Jemski5 precedentemente segnalato che F. tularensis inoculato nei ratti Fischer 344 per via intranasale non poteva essere coltivato dai polmoni fino al post-inoculazione 3 giorni, non risultato in consegna diretta di batteri nei polmoni.
Moduli selezionare agente di F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) richiedono procedure di contenimento di biosicurezza di livello 3 (BSL3), che impedirebbero la videografia. Tuttavia, F. novicida (Fn) è esente dallo status di agente selezionare a causa sua avirulenza nell'uomo sano e può essere utilizzato in sicurezza in condizioni di livello 2 di biosicurezza (BSL2)9,10. Inoltre, Fn serve come base per vaccini vivi attenuati in grado di proteggere contro l'esposizione polmonare di F. tularensis quando consegnato via intratracheale inoculazione11,12,13. La tecnica presentata qui consente lo studio delle infezioni che si verificano attraverso la via polmonare utilizzando ratti come un modello per gli esseri umani. Questa tecnica può essere eseguita senza la necessità di attrezzature specializzate generatori di aerosol. FN è stato usato per le tecniche girate qui.

<table><tbody><tr><td>GreenLine fiber optic blade size 0</td><td>Carefusion</td><td>5-5231-00</td><td>Macintosh American profile</td></tr><tr><td>GreenLight system laryngoscope handle</td><td>Carefusion</td><td>4559GSP</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet I.V. Catheter</td><td>EXEL INTERNATIONAL</td><td>26743</td><td></td></tr><tr><td>Slip Tip Sterile Syringes 1mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Broad Point Dressing Thumb Forceps</td><td>Thermo Scientific</td><td>76-302</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L barrier tip</td><td>GeneseeScientific</td><td>24-142</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L pipette tip</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-173</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit</td><td>Dremel</td><td>3000228</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Rodent anesthesia machine</td><td>Surgivet</td><td>VTC302 Classic T3</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Anesthesia chamber</td><td>Braintree Scientific</td><td>AB 1</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheal inoculation of fischer 344 rats with francisella tularensis

Infezione polmonare con il batterio Francisella tularensis può condurre alla malattia grave e potenzialmente mortale, tularemia, negli esseri umani. Dovuto la mancanza attuale di un vaccino di tularemia approvati per gli esseri umani, la ricerca è focalizzata sullo sviluppo del vaccino utilizzando appropriati modelli animali. Il ratto di Fischer 344 è emerso come un modello che riflette umana suscettibilità all'infezione di F. tularensis e quindi è un modello interessante per lo sviluppo di vaccini di tularemia. Intratracheale inoculazione del ratto Fischer 344 con F. tularensis imita l'esposizione polmonare in esseri umani. La consegna di successo nella trachea del ratto è critica per la consegna polmonare. Viene utilizzato un laringoscopio con illuminazione a intubate correttamente le trachee di ratti anestetizzati; il corretto posizionamento all'interno della trachea è determinato da un semplice dispositivo per rilevare la respirazione. A seguito di intubazione, la cultura di F. tularensis viene consegnata in una dose misurata tramite siringa. Questa tecnica consente di standardizzare consegna polmonare di F. tularensis entro la trachea di ratto per valutare l'efficacia del vaccino.

La risposta umorale ad inoculazione intratracheale di F. tularensis nel ratto può essere determinata da enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) contro batteri inattivati UV, come descritto in precedenza11. Risposta di immunoglobulina G (IgG) totale dei ratti Fischer 344 ai batteri inattivati a cellula intera era valutato post-intratracheale inoculazione con un ceppo attenuato di Fn (10 inoculo di7 CFU) al giorno 14 e giorno 28 (Figura 1). Mock-vaccinati ratti hanno ricevuto vari di PBS. Un aumento nei titoli dell'anticorpo del siero contro il post-inoculazione Fn rispetto gli animali vaccinati mock ingenuo indica l'efficacia di vaccinazione intratracheale. Reattività del siero basso può indicare intratracheale non corretto posizionamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56123/56123fig1.jpg"> 
Figura 1: totale IgG Responses to Live attenuato Fn intratracheale inoculazione in ratti F344. I sieri da ratti F344 (n = 5) vari inoculato con un vivo attenuato ceppo Fn (107 CFU) sono stati analizzati per i livelli totali di IgG reattivi con cellula intera Fn al giorno 14 e 28 ° giorno post-inoculazione. Mock-vaccinati (ingenuo) ratti (n = 5) sono stati inoculati vari con PBS. Zona rossa denota la reattività dei sieri ingenuo (ratti F344 mock-vaccinati con PBS). Le barre di errore rappresentano SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56123/56123fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.

Intratracheale inoculazione di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis

Pulmonary infection with the bacterium Francisella tularensis can lead to the serious and potentially fatal disease, tularemia, in humans. Due to the ...

intratracheal-inoculation-fischer-344-rats-with-francisella

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

7.1K Views.  University of Texas San Antonio. Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.

Video: Intratracheal Inoculation of Fischer 344 Rats with Francisella tularensis

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medicina

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other bacterial pathogens, the extremely low infectious dose (&lt;10 CFU), rapid disease progression, and high morbidity and mortality rates suggest that the virulent strains of Francisella encode for novel virulence factors. Surface-exposed molecules, namely outer membrane proteins (OMPs), have been shown to promote bacterial host cell binding, entry, intracellular survival, virulence and immune evasion. The relevance for studying OMPs is further underscored by the fact that they can serve as protective vaccines against a number of bacterial diseases. Whereas OMPs can be extracted from gram-negative bacteria through bulk membrane extraction techniques, including sonication of cells followed by centrifugation and/or detergent extraction, these preparations are often contaminated with periplasmic and/or cytoplasmic (inner) membrane (IM) contaminants. For years, the "gold standard" method for the biochemical and biophysical separation of gram-negative IM and outer membranes (OM) has been to subject bacteria to spheroplasting and osmotic lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation. Once layered on a sucrose gradient, OMs can be separated from IMs based on the differences in buoyant densities, believed to be predicated largely on the presence of lipopolysaccharide (LPS) in the OM. Here, we describe a rigorous and optimized method to extract, enrich, and isolate F. tularensis outer membranes and their associated OMPs.

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A protocol for separating inner and outer membranes from Francisella tularensis by spheroplasting, osmotic lysis, and sucrose density gradient ultracentrifugation.

Metodo per l&#39;isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Biologia

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

Modello sperimentale per valutare la risoluzione della polmonite

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Intratracheale inoculazione di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis

Riepilogo

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Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

L'immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Intra-tracheale Amministrazione

Metodo per l'isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Modello sperimentale per valutare la risoluzione della polmonite