Gostaríamos de agradecer a Manuel Zimmer nos fornecendo o arquivo de projeto inicial que foi adaptado para uso com machos; Frank Schroeder para a síntese e o fornecimento da ascr #3; Ross Lagoy para o insight e assistência de imagem e análise; e Laura Aurilio para a fabricação de mestre e que, ao lado de Christopher Chute, contribuiu para a revisão deste manuscrito. Financiamento para este trabalho foi fornecido sob concessão do National Institutes of Health 1R01DC016058-01 (J.S.), a concessão do National Science Foundation CBET 1605679 (D.R.A.) e o prémio de carreira Burroughs Wellcome em Interface científica (D.R.A.).

1. fabricação de dispositivo Nota: ver referência 1.
 Nota: mestre moldes de silicone foram fabricados usando técnicas padrão fotolitográfica para padronização fotorresiste SU-8 em um silício mestre 1 , 7. Máscaras de patrocínio de bolacha foram impressos em 25.000 dpi. Os recursos do dispositivo de homem-adaptado um Chip Olfactory Chronis desenha 19 com uma mudança no worm Porto de carregamento, adaptando um design obtido de M. Zimmer (correspondência pessoal, 2016). Uma vez é incluída para controlar a rotação dos animais. A largura do canal do porto de carregamento worm é reduzida para 50 μm. Todos os canais são 32 μm de altura. Uma vez que um molde mestre do silicone está disponível para o usuário, o usuário pode acompanhar o subsequente protocolo, conforme descrito anteriormente, 1.
<ol><li>Agente de cura e base Mix PDMS na proporção de 10:1 em peso.</li>
	<li>Homogeneizar com pipetas de transferência.</li>
	<li>Desgaseificar a mistura num exsicador de vácuo para 1 h, até que sejam removidas todas as bolhas visíveis.</li>
	<li>Despeje a mistura em um mestre de molde de silicone em um prato de diâmetro de 150 mm até 5 mm de espessura (100 g). Usar uma pipeta Pasteur para remover quaisquer bolhas ou poeira que foram introduzidos à mistura.</li>
	<li>Asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h, ou durante a noite.</li>
	<li>Corte o PDMS longe o molde usando um bisturi e corte os dispositivos separados separados usando uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Buracos de entrada e saída com um soco dérmica de 1 mm.</li>
	<li>Limpar os orifícios com dH 2 O, etanol e novamente com dH 2 O para remover partículas dos socos. Secar o dispositivo em um pulso de fluxo de ar.</li>
	<li>Limpar ambos os lados do canal e o lado superior do dispositivo com fita adesiva, removendo toda a sujeira ou detritos remanescentes no dispositivo para permitir a ligação de sucesso.</li>
	<li>Plasma-lig o dispositivo, canal-lado para baixo, para um vidro de tampa no. 1.
	<ol><li>Expor vidro de tampa e dispositivo (canal-cima) para ar plasma usando as condições que permitem a ligação adequada, tais como 100 W por 30 s ou 24 W em 60 s. 
		Nota: As configurações podem ser ajustadas para melhorar a eficiência da colagem. As condições de ligação-plasma não são tão críticas como a limpeza apropriada ao tentar melhorar a eficiência da colagem. Um dispositivo insuficientemente limpo não ligarão, mesmo sob condições ideais plasma.</li>
		<li>Inverter o vidro de tampa para o lado de canal do dispositivo e pressione para baixo com o polegar para 5 s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação de buffer <ol><li>dilua 1 x S Basal (100 mM NaCl e 0,05 M KPO 4, pH 6.0) de um estoque de estéril 10 x.</li>
	<li>Diluir 1 M tetramisole estoque para uma concentração final de 1 mM em 1 x S Basal para todos do buffer soluções.</li>
	<li>Adicionar fluoresceína para ambos o &#34; controle de fluxo &#34; e &#34; buffer &#34; reservatórios.
	<ol><li>Criar um estoque de 100 mg/mL de fluoresceína em 1 x Basal de S.</li>
		<li>Diluir o estoque para concentrações finais de 1 µ g/mL no controle de fluxo e 0,1 µ g/mL no buffer.</li>
	</ol></li> <li>Criar estímulos.
	<ol><li>Glicerol diluído a uma concentração final de 1 M em 1 X Basal de S.</li>
		<li>Diluído ascaroside #3 (ascr #3) a uma concentração final de 1 µM em 1 X Basal de S.</li>
	</ol></li></ol> 3. Instalação de dispositivo Nota: ver 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> Figura 1. Instalação do dispositivo microfluidic. (A) reservatórios e tubos. Um 30 mL seringa sem um êmbolo serve como o &#34; reservatório. &#34; isto é anexado a uma válvula Luer com três opções de fluxo. Uma tomada é ligada a uma seringa de 3 mL com um êmbolo, enquanto o outro é conectado a uma agulha (laranja) que é inserida o tubo que conecta o dispositivo microfluidic. (B) o total configuração da microfluidic experiência de imagem. O dispositivo é colocado em um palco de um microscópio de epifluorescência invertido, acima as lentes objetivas. O &#34; controle de fluxo &#34; tampão viaja através de uma válvula de 3 vias, que é controlada por uma unidade na prateleira acima da instalação. Linhas que contêm buffers de então são inseridas os portos de dispositivo apropriado. (C) as portas do dispositivo microfluidic. O &#34; controle de fluxo &#34; portas flanqueiam as outras portas de entrada: o &#34; estímulo &#34; e &#34; buffer &#34; portas. A &#34; tomada &#34; porta é a porta da direita. Devido à localização da arena de carregamento do worm, o &#34; worm carregando &#34; porta é a porta central-maioria no dispositivo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Preparar três reservatórios de fluido, anexando uma seringa de 30 ou 60 mL com válvula de 3 vias Luer, com uma seringa de 3 mL e agulha anexada à válvula Luer também (como na figura 1A). Conecte a agulha a tubulação que se estende até o dispositivo microfluidic (como na figura 1A -B).</li>
	<li>Remover as bolhas de ar do reservatório e tubulação.</li>
	<li>Encher a seringa de 3 mL com tubo anexado com 1 x S Basal e inseri-lo na saída do Porto</li>
	<li>Suavemente aplique pressão na seringa até que o buffer aparece na parte superior dos orifícios de entrada.</li>
	<li>Conectar o controle de fluxo, tampão e tubulação de estímulo aos orifícios de entrada apropriado (como na figura 1B -C), garantindo que gotas de líquido estão presentes em ambos o porto de carregamento orifício e o tubo de buffer a ser anexado.</li>
	<li>Novo, suavemente aplique pressão na seringa que é conectado à porta de saída até que as gotas aparecem no worm da entrada do porto de carregamento.</li>
	<li>Inserir um pino de bloqueio sólido para o worm Porto de carregamento</li>
	<li>Remover a seringa da porta de saída e conecte o tubo de descarga ligado ao vácuo casa (-670 Torr).</li>
	<li>Inspecione o dispositivo para quaisquer bolhas no fluxo de canais, visualmente e através de confirmação através de um software compatível com a câmera de vídeo utilizados, tais como o software open-source Micro-Manger. Consulte a etapa 6 para obter dicas sobre como usar o Microgestor.
	<ol><li>Se as bolhas estiverem presentes, esperar por eles para desalojar ou ser absorvido o PDMS de parede antes de carregar qualquer animais; a presença de bolhas irá perturbar o fluxo adequado de fluidos através do dispositivo.</li>
	</ol></li> <li>Usando um filtro GFP, confirmar a dinâmica do fluxo adequado dentro do dispositivo antes da minhoca carregando a válvula de 3 vias de actuação e observando o switching de buffers.
	<ol><li>Determinar a dinâmica do fluxo adequado: observar a fluoresceína presente nas soluções de controle e buffer de fluxo ( Figura 2D -2E) alterar quando o valor do controle de fluxo é alterado pressionando o controle botão correspondente à válvula de 3 vias no link da válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Depois de abrir o Microgestor, clique no &#34; Live &#34; para observar uma imagem ao vivo do dispositivo. Ligue a fonte de luz fluorescente para observar o fluxo de buffers no dispositivo ( Figura 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Figura 2: Um macho-adaptado microfluidic olfativo chip. (A), o fluxo de padrões do dispositivo quando o worm é exposto para reserva. Tampão (B) é mostrado na cor marrom, e controle de fluxo (FC) é mostrado em amarelo, com estímulo (S) em branco. O worm Porto de carregamento foi adaptado para incluir uma curva, o que permite o melhor controle da orientação do worm. (B) o fluxo de padrões do dispositivo quando o worm é exposto ao estímulo. Tampão (B) é mostrado na cor marrom, e controle de fluxo (FC) é mostrado em amarelo, com estímulo (S) em branco. (C) as medições do dispositivo adaptado como fabricada. O worm Porto de carregamento termina em uma 42 µm de abertura, com um canal de µm 50 projetado para a largura masculina. A altura medida dos canais é 32 µm, apesar de um alvo de 25 µm no design. (D-E) A presa masculino expressando p sra-6:: GCaMP3. O promotor sra-6 não é específico do ASH, e alguma expressão pode ser observada no neurônio ASI, embora não transientes de cálcio foram observadas na ASI. A imagem é (D), uma combinação de iluminação de campo claro e fluorescente, enquanto (E) só é fluorescente. As barras de escala denotam 42 µm. (F) o ASH neurônio responde à estimulação de glicerol 1m com atividade neural robusta. A área azul denota o tempo de estímulo de glicerol a 1 M. A região sombreada indica o erro-padrão, com n = 20 pulsos de sete vermes. Os traços vermelhos indicam respostas despolarizante. Os y-Axes mostram ΔF/F 0. Barra de escala denota 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 4. preparação de animal Nota: ver referência 23.
<ol><li>Respostas de ASH imaging para glicerol 1 M.
	<ol><li>Lugar aproximadamente 20 c. elegans machos que são positivos para p sra-6:: expressão de matriz GCaMP3 em uma placa de ágar nematoide crescimento média (NGM) inoculado com um gramado de OP50 Escherichia coli. Usar a expressão de Lino fluorescente e/ou um marcador de injeção de co para a identificação dos animais positivos matriz. 
		Nota: Animais positivos matriz serão fluorescem de acordo com o Lino usado (i.e., animais expressando GCaMP serão fluorescência verde sob luz azul estimulação, enquanto RCaMP animais serão fluorescem vermelho sob estimulação verde). Marcadores de co injeção podem variar de outras proteínas fluorescentes, tais como a GFP e RFP, a marcadores fenotípicos, como o rol-6, ou podem resgatar um fenótipo dominante, como a mutação de pha-1 28.
		<ol><li>Se mexendo imediatamente antes do ensaio, escolher jovens adultos do sexo masculino. Se escolher o dia antes do ensaio, escolher machos larvas L4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imaging as respostas CEM a 1 µM ascr #3.
	<ol><li>Pick aproximadamente 20 L4 c. elegans machos (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); -o-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) que são positivos para expressão de marcador dsRed injeção co. 
		Nota: dsRed expressão dentro os neurônios do raio do conto masculino é mais fácil de observar e confirmar que GCaMP expressão dentro os quatro neurônios CEM.</li>
		<li>Isolar esses machos de hermafroditas em uma placa de ágar NGM semeado com um gramado de OP50 Escherichia coli para 5-14 h antes de realizar o experimento de imagem. 
		Nota: Os machos não isolados por um período mínimo de 5 h não respondem comportamentalmente a ascr #3 e, portanto, podem apresentar ainda menos transientes de cálcio para o ascaroside do que o observado aqui.</li>
	</ol></li></ol> 5. Carga animal Nota: ver refefence 1.
<ol><li>Escolher um verme em uma placa de ágar não-semeada NGM usando técnicas de manutenção padrão worm.
	<ol><li>Picareta vermes por em chamas uma picareta (feita de fio de platina achatado), escolhendo as bactérias para a escolha, e &#34; enxugando &#34; um verme para buscá-lo. Coloque delicadamente o verme na chapa de novo, permitindo-lhe sair por conta própria.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar aproximadamente 5 mL de 1x S Basal para a placa não-semeada, tal que a placa está inundada.</li>
	<li>Desenhar a minhoca em uma seringa de carregamento (ou seja, seringa de 3 mL com tubo anexado) que tenha sido previamente enchida com 1 x Basal de S.
	<ol><li>Não se esqueça de chupar o worm só para o tubo, não todo o caminho para a seringa. 
		Nota: Se o worm viaja para a seringa, é quase impossível de recuperá-lo para o tubo.</li>
	</ol></li> <li>Desligar o vácuo para parar o fluxo girando a válvula de saída Luer.</li>
	<li>Retire o pino sólido bloqueando o worm Porto de carregamento</li>
	<li>Girar a válvula Luer conectada à porta de saída ( figura 1B), para que ele está descarregando. 
	Nota: Use um vídeo ao vivo alimentar ao carregar o worm para confirmar a localização e orientação do animal (etapas 5.8-5.13).</li>
	<li>Inserir o sem-fim do tubo para o worm Porto de carregamento de carga</li>
	<li>Suavemente aplique pressão na seringa até que o verme aparece no canal de carregamento.</li>
	<li>Se o worm começa a entrar no canal posição invertida, puxar o êmbolo da seringa para impedir a entrada do canal de worm.</li>
	<li>Interruptor entre aplicação e invertendo a pressão até que a cabeça entre o canal primeiro.</li>
	<li>Abrir o vácuo, girando a válvula de 3 vias Luer conectado à porta de saída para abri-lo a vácuo em vez de atmosfera.</li>
	<li>Pressionar manualmente, pressionando o êmbolo da seringa para orientar e coloque a cabeça de minhoca, tal que ele é exposto para o canal do fluxo de reserva, mas não tão longe que a cabeça pode circular livremente ( Figura 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Estímulo e aquisição <ol><li>usando um software de código-fonte aberto microscopia, como Gerenciador de Micro, gravar, capturando imagens como uma pilha TIFF em 10 quadros/s usando a excitação de luz azul (470 nm) por 30 s.</li>
	<li>Definir a exposição no menu principal para 100 ms. <ol><li>aberto &#34; Acq multi D. &#34; no menu principal do software. Definir o &#34; número &#34; para &#34; 300, &#34; e o &#34; intervalo de &#34; para &#34; 0. &#34; clique &#34; adquirir! &#34; para adquirir o vídeo.</li>
	</ol></li> <li>Aplicar um pulso de s 10 do estímulo 5 s após iniciar a aquisição. Ajustar a duração da aplicação de estímulos como desejado.
	<ol><li>Depois de adquirir 5 s de vídeo, altere a válvula de 3 vias, controlando o buffer de controle de fluxo para aplicar o estímulo para o animal que está sendo testado. Clique no botão mais à esquerda no link da válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Após 10 s de exposição de estímulo (este tempo pode ser ajustado como desejado pelo usuário), alterar o fluxo de buffers pressionando novamente o botão mais à esquerda no link válvula.</li>
	</ol></li> <li>Registro sob reserva somente até a janela de 30-s está completa para permitir que a fluorescência de Lino retornar à linha de base.</li>
	<li>Repetir como desejado. Espere 30 s entre o fim de aquisição e o início do próximo julgamento.</li>
</ol> 7. Análise de imagem <ol><li>abrir a pilha TIFF com o software open-source, ImageJ, arrastando o arquivo para a janela do ImageJ.</li>
	<li>Clique usando o cursor e arraste para definir a região de interesse (ROI) em torno do neurônio de interesse. Definir a região para incluir o soma do neurônio de interesse (como na Figura 3A).</li>
	<li>Plot z-pilha da intensidade da fluorescência do ROI através de pilhas clicando em Open-&#62; imagem - &#62; pilhas - &#62; traçar perfil do eixo z.</li>
	<li>Clique &#34; lista &#34; na janela que se abre. Clique em Editar - &#62; copiar para copiar os valores. Cole os valores em um programa de planilha.</li>
	<li>Analisar a fluorescência de fundo para cada pulso arrastando o ROI para uma região do verme que não contenha a expressão GCaMP.</li>
	<li>Realizar a subtração de fundo para cada pulso subtraindo o valor de fluorescência do fundo do valor de intensidade de fluorescência neurônio.</li>
	<li>ΔF/F 0 para cada quadro de cada pulso de calcular.
	<ol><li>F calcular 0 como o valor de intensidade média do ROI para primeiro 1 s da aquisição (por exemplo, quadros 1-10).</li>
		<li>Calcular ΔF/F 0 dividindo o valor subtraído de fundo para o quadro de interesse pelo valor calculado F 0.</li>
	</ol></li> <li>Repita para cada neurônio fotografada e cada pulso de estímulo.</li>
	<li>Dos neurônios com perfis de resposta consistente, como ASH, média de todos os pulsos para cada neurônio e calcular o SEM (como na Figura 2F).</li>
	<li>Plotar a média ΔF/F 0 com SEM ao longo do tempo para cada neurônio. 
	Nota: Neste caso, é prática comum incluir heatmaps das respostas neuronais individuais de cada julgamento também. Em neurônios que não exibem alterações consistentes em transientes de cálcio após a exposição a estímulos através de estimulações repetidas, ou em indivíduos diferentes 23, pode ser mais aplicável para mostrar traços de pulso individuais (como em a Figura 4). Consulte a discussão para obter detalhes sobre como determinar como exibir os dados.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+in+C.+elegans.">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li><li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans.">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans.">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li><li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+male:+postembryonic+development+of+nongonadal+structures.">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>C&#225;ceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies.">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Garc&#237;a, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li><li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autofluorescent+&amp;#34;lipofuscin+granules&amp;#34;+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes.">The autofluorescent &amp;#34;lipofuscin granules&amp;#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li><li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans.">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans.">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O chip olfativo macho-adaptado incorpora uma vez em um porto de carregamento mais estreito, o que permite maior controle da orientação e para a captura eficiente de masculino c. elegans. Isto permite a visualização de ambos os membros direito e esquerdos da neuronais pares bilaterais, sem a necessidade de empilhamento z. Esta curva leva a uma orientação longe vertical 100% do tempo em worms, onde destina-se apenas um par bilateral com um marcador fluorescente, como o ASH (Figura 2D-E)29,30. No entanto, nas classes neuronais com quatro neurônios radialmente simétricos, como CEM, todos os quatro neurônios são visíveis apenas um terço do tempo. Outro terço de vermes testado tem apenas três dos quatro neurônios visíveis e para o restante do terceiro, a diferença somente distinguível entre os corpos celulares dorsais e ventrais, não a assimetria esquerda-direita (dados não mostrados). A porta estreita é combinada com uma altura inferior do canal para evitar flutuação worm através do eixo z. Este projeto permite a imagem de machos no futuro de estudos, que, quando combinado com o conhecimento cada vez maior do conectoma masculino25,31, permitirá um melhor entendimento da função neural específicas do sexo.
A análise realizada neste protocolo usa o software livre ImageJ para medir as mudanças na fluorescência no neurônio de interesse. Com o design atual, tetramisole de 1 mM no buffer efetivamente paralisa os vermes e impede o movimento dos neurônios sendo fotografada. Se o movimento não é evitável, ou se o usuário deseja evitar o uso de um paralítico, scripts mais complexos de rastreamento devem ser escritos que vigiam os neurônios como movem-7. No entanto, neste protocolo, vermes masculinos só mover quando eles eram pequenos demais para ser efetivamente restrita pelo porto de carregamento e quando apresentado com um estímulo extremamente contrário, tais como o glicerol. Mesmo nestes casos, o movimento é breve e não requer grandes quantidades de ajustes de rastreamento — definir um ROI em torno da nova localização do neurônio alivia as leituras incorretas de fluorescentes (Figura 2).
Uma limitação do único-worm, geração de imagens baseada em armadilha é que apenas uma minhoca pode ser fotografada em um tempo de1. Outra limitação dessas armadilhas é que os vermes podem ficar presos dentro do dispositivo, causando dispositivos para estar entupido e "acabada" depois de apenas alguns vermes de imagem. No entanto, o tempo de retorno rápido para a fabricação de novos dispositivos de um molde mestre alivia esta desvantagem. Iluminação de luz azul estendida também foi mostrada para induzir Fotodano em c. elegans32,33. O frame de tempo relativamente curto experimental do presente protocolo (30 s) permite a imagem sem fotobranqueamento mensurável. No entanto, para evitar o fotobranqueamento e Fotodano em experimentos mais tempo, a fonte de luz pode ser pulsada7. Por exemplo, durante cada exposição de 100 ms, a luz pode ser pulsante de 10 ms. isso tem sido mostrado para eliminar autofluorescência de corpo aumentada ao longo de tempo7.
Para testar corretamente os machos para suas respostas para ascarosides, os machos do estágio larval 4 (L4) primeiro devem estar isolados da hermafroditas, pelo menos 5 h, a fim de obter uma resposta de perto-ingênuo a feromônios23. Isolamento por menos do que este período de tempo pode causar animais deixar de responder para o ascarosides. No entanto, esse isolamento não é necessário quando o teste não-ascaroside pistas, como glicerol. Por uma questão de coerência, no entanto, animais eram sempre isolado pelo menos 5 h antes da sua imagem de cálcio. Em alguns neurônios, tais como o CEM, nem toda estimulação irá provocar uma resposta neuronal, e cada CEM que responde faz isso para gerar um certo "código" da representação neural. Esse fenômeno em CEM tem sido observado através de estudos de eletrofisiologia, bem como com estudos de imagem, como os que descreveu aqui23de cálcio. Assim, transientes de cálcio mensuráveis nos neurônios CEM em cada animal ascaroside-expostos não são garantidos para23. De fato, muitos o ascarosides investigado até à data não eliciar cálcio mensuráveis transientes13,15,34,35. Observou-se o levantamento de sucesso de transientes mensuráveis durante apenas um dos três pulsos de feromônio em dois dos cinco animais expostos para a ascaroside de interesse (Figura 3). Isso coincide com a taxa de sucesso anteriormente observado em outros laboratórios23. Esta variabilidade é uma limitação ao estudar a resposta de feromônio e não é devido o foco masculino-baseado do presente protocolo.
Ao investigar transientes de cálcio suscitou em resposta a ascarosides, um não devemos descartar uma falta de resposta consistente sem maiores investigações. Isso pode ser testado através de experimentos, tais como estudos de eletrofisiologia para confirmar a resposta variável dentro de uma classe neuronal. Para os neurônios, tais como ASH, que respondem confiantemente, a falta de resposta consistente pode ser indicativa de problemas maiores experimentais, tais como erros no controle de estímulo. O pico de intensidade das respostas também pode ser investigado se variabilidade é esperada na resposta. Os traços podem ser plotados com o desvio padrão ou erro padrão (como na Figura 2F). Se o desvio padrão é pequeno, os traços podem ser plotados e analisados como tal. Se há uma notável quantidade de variação levando a moderada desvios-padrão, os dados podem ser plotados o mesmo, com acompanhamento heatmaps classificados por resposta "tipo" para mostrar a variação de resposta-por-resposta. Se houver variação significativa (Figura 3), no qual os picos não podem ser distribuídos de forma gaussiana, as respostas podem ser categorizadas em resposta "tipos" (por exemplo, despolarizar, hiperpolarização ou não-polarização)23. Respostas que se enquadram em um determinado "tipo" podem ser plotadas e analisadas em conjunto. Da mesma forma, heatmaps devem acompanhar esta análise também.
Em frente, este dispositivo pode ser adaptado para permitir a imagem latente de nematódeos larvais-encenado por estreitar ainda mais o porto de carregamento. Mais estreitamento do fim da porta de carregamento permitirá a restrição do animal para permitir a imagem de apenas os cílios dos neurônios sensoriais, em oposição ao corpo celular. Enquanto outros dispositivos são projetados para o hermafrodita mais comumente estudado, este chip olfativo adaptado permite que a imagem da atividade neural em circuitos neurais masculinos. Como a conectoma do macho ainda está sendo elucidada, sendo capaz de medir a dinâmica neural em redes específicas do sexo é fundamental para compreender plenamente a sinalização neuronal. Diferenças entre as respostas masculinas e hermafroditas agora podem ser testadas e medido usando este dispositivo.

Dispositivos microfluídicos fornecem maior acesso a precisamente ambientes controlados, onde animais, tais como o nemátodo c. elegans, pode ser manipulado experimentalmente1. Estes estudos incluem ensaios comportamentais, estudos de imagiologia de cálcio ou mesmo sessões de fenótipos específicos, resultando em medidas mais exatas de resultados experimentais1,2,3,4, 5,6. Microfluídica proporcionar condições líquidas em pequena escala, através do qual as experiências detalhadas podem ser executadas utilizando quantidades mínimas de reagentes. Há uma produção constante de novos designs de dispositivo microfluidic, e o uso de cada um varia, de arenas que permitem o movimento natural sinusoidal de c. elegans em ensaios comportamentais e estudos de imagiologia neurais, capturar dispositivos utilizados em imagiologia neural e estudos olfativos, dispositivos que permitem alta produtividade análise fenotípica em genética telas4,5,6,7. Após a fabricação de um molde mestre, dispositivos microfluídicos são baratos construir — dada a capacidade de reutilização do mestre — e fácil de usar, permitindo a geração de dados rápida, através de estudos de alto rendimento. Fabricação de dispositivos usando polímeros tais como polydimethylsiloxane (PDMS) permite a criação de novos dispositivos dentro de horas.
Estudos de imagiologia de cálcio usam indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) expressados em células-alvo para medir a dinâmica neural essas células em tempo real8,9,10,11. A natureza transparente da c. elegans permite a gravação dos níveis fluorescentes destas proteínas em animais vivos. Tradicionalmente, GECIs dependem da proteína verde fluorescente (GFP)-baseado sensor peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), embora estudos mais recentes adaptaram estes sensores para permitir melhor relação sinal-ruído e perfis de excitação avermelhado. Após o desenvolvimento de GCaMP3, proteínas com estas especificações têm variado, incluindo sensores tais como GCaMP6s e GCaMP6f (lento e rápido fluorescência fora-taxas, respectivamente), bem como de peptídeo de RFP-calmodulina-M13 (RCaMP), que tem um avermelhado Perfil de ativação. A combinação destes GECIs com sequências de promotor de genes célula específica de c. elegans pode atingir células de interesse, neurônios sensoriais particularmente12,13,14,15 , 16.
Enquanto a facilidade de uso de c. elegans em estudos microfluídicos é aparente, quase todos os estudos têm incidido sobre hermafroditas. Apesar dos machos apenas contabilização de 0,01-0,02% da população de tipo selvagem, inestimáveis conclusões podem surgir de sua caracterização. Enquanto a conectoma física do sistema nervoso hermafrodita foi totalmente mapeada por décadas17, a conectoma masculina permanece incompleta, especialmente na região da cabeça do animal18. O uso de imagens de cálcio em machos vai ajudar a gerar uma compreensão do sistema nervoso masculino e as diferenças que surgem entre os dois sexos. O menor tamanho de c. elegans machos adultos evita armadilhas eficaz e confiável nos portos de carregamento dos tradicionais dispositivos olfativos projetados para maiores hermafroditas. Para resolver isso, uma versão modificada do Chip Olfactory Chronis19 foi desenvolvida com um porto de carregamento mais estreito, uma altura inferior do canal e se transforma no worm Porto de carregamento (que giram o animal), permitindo a visualização de esquerda/direita bilateral neuronais pares. Este projeto permite: (1) a captura efetiva de jovens adultos do sexo masculino, (2) uma orientação mais confiável do animal para a visualização de ambos os membros de neurônios emparelhados bilaterais e (3) a imagem precisa de atividade neural em neurônios masculinos.
Cada vez mais, estudos mostram que os machos de c. elegans respondem de forma diferente do que hermafroditas para uma variedade de ascarosides (ascr), ou o nematódeo pheromones20,21,22,23 ,24. Portanto, desenvolver uma compreensão da dinâmica neural e representações dentro a conectoma masculina tornou-se ainda mais pertinente. Masculino c. elegans contêm 87 neurônios específicos do sexo não está presentes no hermafrodita25,26, alterando a conectoma em como-maneiras ainda indeterminados. Sendo capaz de imagem essas dinâmicas neurais exclusivas nos permitirá compreender melhor respostas específicas do sexo e representações neurais.
Este protocolo descreve o uso de um chip olfativo macho-adaptado para a imagem neural de masculino c. elegans chemosensation. O neurônio nociceptivo que Ash responde confiantemente ao glicerol 1m em machos, consistentes com as anteriores hermafrodita estuda27. Exposição de ascarosides pode eliciar respostas que são variável de animal para animal, que requerem um maior número de animais a ser testado. A resposta dos neurônios CEM macho-específico anteriormente mostrou, através de eletrofisiologia e cálcio de imagem estudos, reagir variàvel ascaroside #323.

<table width="2211">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:219px;">University Wafer</td>
			<td style="width:205px;">452</td>
			<td style="width:1260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 2035</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111070-0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100-4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Mask</td>
			<td>Cad/Art Services</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">1.0 mm Dermal Punches</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hard Tubing</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>0.415/0.425&#34; OD x .500 Long</td>
			<td>Batch PB07027</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">30 mL syringes</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used as buffer reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td>
			<td>Component Supply Company</td>
			<td>NE-231PL-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Mercator Control System LF-5 Plasma System</td>
			<td>Mercator</td>
			<td>LF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Scotch Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>BSN43575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 20 Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Vacuum Desicator</td>
			<td>Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:205px;">420250000</td>
			<td>24 cm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Weigh Boats</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-01017-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Classic Plus Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:205px;">PB1501-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-25554-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">30-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Oven</td>
			<td>Sheldon Manufacturing Inc</td>
			<td style="width:205px;">9120993</td>
			<td>Model Number: 1500E.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Zeiss Axio Observer.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td style="width:205px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Blue Fluorescent Light</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td style="width:205px;">SOLA SM6-LCR-SA</td>
			<td>24-30V/7.9A DC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Illumination Adaptor</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">423302-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td>
			<td>Parker</td>
			<td style="width:205px;">001-0017-900</td>
			<td>3-way valve for controlling flow.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ValveLink8.2&#174;</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:205px;">01-18</td>
			<td>Flow Switch Controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Apex</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Peptone</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">CaCl2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270741-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Tetramisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">L9756-10(G)</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fluorescein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">FD2000S-250mg</td>
			<td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">G6279-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ascaroside #3</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">NaCl</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">18-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9268.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3252-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ASH GCaMP3 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">CEM GCaMP6 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">&#34;Reservoir&#34;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:1260px;">To create a Reservoir: A &#34;30 mL syringe&#34;, is connected to a &#34;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&#34;, which is connected to a &#34;3 mL syringe&#34; and a &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34;. The &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34; is then inserted into &#34;Soft Tubing&#34; approximately 1/3 of the way down the needle.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

A utilização de indicadores de cálcio tem bastante reforçada a nossa compreensão da dinâmica neural e regulamento. O nemátodo Caenorhabditis elegans, com sua anatomia transparente e completamente mapeado sistema nervoso apresenta um modelo ideal para a compreensão dinâmica neural em tempo real, usando indicadores de cálcio. Em combinação com tecnologias microfluídicos e projetos experimentais, estudos de geração de imagens de cálcio usando estes indicadores são realizados em animais em movimento livre e presos. No entanto, a maioria dos estudos anteriores utilizando dispositivos de captura, como o chip olfativo descrito no Chronis et al., têm dispositivos projetados para uso no hermafrodita mais comuns, como o macho menos comum é que ambos morfologicamente e estruturalmente dissimilares. Um chip adaptado olfativo foi projetado e fabricado para aumentar a eficiência no masculina imagem neuronal com o uso de animais jovens e adultos. Uma vez foi incorporada a minhoca porto para girar os animais e para permitir a separação dos neurônios individuais dentro de um par bilateral em 2D imagem de carregamento. Vermes são expostos a um fluxo controlado de odorante dentro do dispositivo microfluidic, conforme descrito em estudos anteriores de hermafrodita. Transientes de cálcio são então analisados utilizando o software open-source ImageJ. O procedimento descrito neste documento deverá permitir uma maior quantidade de macho com base em c. elegans cálcio estudos, aprofundar a nossa compreensão dos mecanismos de sinalização neuronal do sexo-específico de imagem.

Um exemplo de configuração do dispositivo global pode ser visto na figura 1A-B. Figura 1A mostra a construção do reservatório apropriado e instalação. A figura 1B mostra as conexões dos reservatórios para o dispositivo microfluidic. Figura 1 mostra um dispositivo microfluidic com portas individuais para maior clareza.
O design do aparelho masculino adaptado microfluidic contém uma curva no porto de carregamento, mas dinâmica de fluxo é idêntica ao dispositivo projetado por Chronis et al.19(Figura 2A-2 C). O fluxo de buffers pode ser controlado alterando qual válvula de controle de fluxo é aberta (Fig. 2A-2B). As medições do dispositivo como fabricado variam de arquivo projetado. As dimensões fornecidas na Figura 2 são medições "como fabricadas".
Após carregar masculino c. elegans no dispositivo olfativo macho-adaptado, seu posicionamento e orientação, bem como dinâmica de fluxo do canal, pode ser verificado através de tanto brilhante-campo e imagem fluorescente (Figura 2D-2E). A exposição dos vermes expressando GCaMP3 no neurônio nociceptivo, ASH, de glicerol 1m resulta em alterações visíveis em fluorescência dentro do neurônio ASH, indicativo de atividade neural (Figura 2F). Mudanças sutis na fluorescência podem não ser visíveis a olho nu, mas o software pode ser utilizado para quantificar estas mudanças. O software ImageJ livre pode ser usado para analisar e quantificar a intensidade fluorescente de neurônios ASH após exposição ao glicerol 1 M ao longo do tempo (Figura 2F). Isso é semelhante ao que é observado em hermafroditas27 e, devido a robustez da resposta neuronal ASH ao glicerol, isto é observado em todos os animais testados.
Uma pequena quantidade de movimento axial ou rotacional é esperada em animais unparalyzed, muitas vezes necessitando de um algoritmo de controle de neurônio durante a análise de vídeo (Figura 3A). A adição de um paralítico em buffers (por exemplo, 1 mM tetramisole) quase elimina este efeito, embora alguns animais (~ 10%) ainda deslocar-se durante os ensaios. Isto pode ser contornado por: (a) usando os machos mais velhos, que estão presos de forma mais eficiente; (b) diminuindo a largura ou espessura do worm carregamento Porto ainda mais; ou (c) ou aumentando a concentração de paralítico usado ou usando outro paralítico. Isso também irá garantir que não há muita coisa da cabeça após o final da armadilha e exposto para o canal de odor. Se ocorrer um julgamento com movimento de verme, a área de análise pode ser movida e reler de novo local neuronal, começando com o quadro, após o qual o movimento ocorre (Figura 3B). Reconstrução manual dos vestígios neurais pelo usuário é necessário neste caso. Scripts que analisar as alterações fluorescentes dentro do neurônio e que siga centro do neurônio, enquanto se move também pode ser escrito de19.
Masculino c. elegans sentir atraentes feromônios biogênico chamados ascarosides através de quatro sexo específico CEM neurônios23. Quando transientes de cálcio são observados nos machos, as respostas são variáveis em forma, sinal e magnitude entre os dois neurônios e animais (Figura 4A-B). No entanto, resposta masculina aos pheromones não é observada tão confiável como transientes de cálcio em muitos animais (Figura 4). Isto não é desanimador, como a maioria dos ascarosides não provocam transientes de cálcio com sensação de14,13,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig3.jpg"> 
Figura 3: endereçamento movimento worm durante o período de aquisição de imagem. (A) ΔF/F0 (mudança na intensidade fluorescente dividida pela intensidade média fundo fluorescente para primeiro 1 s de aquisição) foi calculado usando o ImageJ definindo uma área onde o neurônio de interesse foi confiantemente estático para 1 s. Durante o pulso de estímulo (área azul), mudou-se o animal, como visto nas imagens acima o rastreamento de cálcio, resultando em neurônio já não sendo contido dentro da área analisada (caixa amarela). As barras de escala denotam 42 µm. o show de linhas tracejadas, a região do rastreamento que corresponde à posição do worm em cada imagem. (B) se a área de análise é mudou-se para seguir o neurônio durante o julgamento e os traços individuais são recriados para transmitir a real dinâmica neural, o rastreamento aparece como se o animal não se mexeu. As linhas tracejadas mostram a região do rastreamento que foi corrigido para o movimento da minhoca. Traços para ASH neurônios, esquerdo e direito (ASHL (vermelho) e ASHR (azul), respectivamente) são mostrados. Os y-Axes mostram ΔF/F0. Barra de escala denota 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig3large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig4.jpg"> 
Figura 4: Masculino c. elegans CEM resposta a 1 μM ascr #3 é variável. Os neurônios CEM macho-específico exibem padrões únicos de resposta aos pheromones biogênica. (A) as respostas observadas em cada neurônio CEM para um pulso de um animal ágil são mostradas. Existem quatro neurônios CEM: dorsal direita (CEM DR), dorsal esquerda (CEM DL), ventral direito (CEM VR) e ventral esquerdo (CEM VL). Três dos quatro neurônios respondem com depolarizations de diferentes forma e amplitude, com o quarto não está respondendo para o ascaroside. (B) aproximadamente um terço dos animais presos (2/7 testado neste estudo) resultado em apenas três neurônios capazes de ser fotografada. As respostas de um verme na presente orientação resultaram em transientes de cálcio CEM que eram diferentes do que aqueles observados no primeiro worm. Isto não foi devido à mudança de orientação do worm, como CEM DR é visível em ambas as orientações e exibe a resposta variável entre animais. (C) muitos vermes que não responder com qualquer transientes de cálcio detectável (5/7 testado neste estudo). Traços individuais mostrados são representativos dos animais único mostrado nas imagens acima as parcelas. Obarras de escala denotam 42 µm. traços: A área azul denota o tempo de exposição de ascr #3 1 μM. Os traços vermelhos indicam a resposta despolarizante. Os traços pretos não denotam nenhuma resposta observada. Os y-Axes mostram ΔF/F0. Barra de escala denota 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig4large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.0K visualizações.  Worcester Polytechnic Institute. O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Vídeo: Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Neurociência

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...