Manuel Zimmer erkekler ile kullanmak için adapte oldu ilk tasarım dosya ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum; Frank Schroeder sentezi ve ascr 3 temini için; Ross Lagoy için fikir ve görüntüleme ve çözümleme ile ilgili yardım için; ve bu el yazması gözden geçirme için ana imalat ve kim, Laura Aurilio Christopher Chute, yanında bulunmuştur. Ulusal Sağlık Enstitüleri grant 1R01DC016058-01 (js), Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET 1605679 (D.R.A.) ve Burroughs Wellcome kariyer Ödülü, bilimsel arabirimi (D.R.A.) altında bu iş için fon sağlanmıştır.

1. cihaz imalat Not: bkz: başvuru 1.
 Not: silikon ana kalıpları fabrikasyon SU-8 fotorezist silikon ana 1 , 7 desenlendirme için standart photolithographic teknikleri kullanarak. Photomasks gofret desenlendirme için 25.000 dpi çözünürlükte basıldı. 19 bağlantı noktası yükleme, M. Zimmer (özel yazışmaları, 2016) elde edilen bir tasarım adapte solucan bir değişiklik ile tasarım erkek adapte aygıt özellikleri Chronis koku çip. Bir dönüş hayvanlar dönüşü kontrol için bulunur. Bağlantı noktası Kanal yükleme solucan genişliğini için 50 mikron daralmış. Tüm kanallar 32 mikron uzun boylu vardır. Silikon ana kalıp kullanıcı için kullanıma hazır olduğunda, kullanıcı sonraki takip edebilirsiniz, protokol 1 daha önce açıklandığı gibi.
<ol><li>Mix PDMS temel ve kür Ajan ağırlık tarafından 10:1 oranında.</li>
	<li>Karıştırın iyice transfer Pipetler ile.</li>
	<li>Tüm görünür kabarcıklar kaldırılana kadar 1s için bir vakum desiccator karışımı degas.</li>
	5 mm kalınlığında (100 gr) kadar <li>bir silikon kalıp yöneticisinde bir 150 mm çapında çanak üzerine karışımı dökün. Herhangi bir kabarcıklar veya karışıma ortaya konan toz kaldırmak için bir Pasteur pipet kullanın.</li>
	<li>İçin en az 3 h ya da bir gecede 65 ° C'de pişirin.</li>
	<li>PDMS neşter kullanarak kalıp uzak kesmek ve ayrı aygıtlar ayrı bir jilet kullanarak kesti.</li>
	<li>1 mm dermal yumruk ile giriş ve çıkış delikleri yumruk.</li>
	<li>Sifonu dH ile delik 2 O, etanol ve parçacıklar yumruk kaldırmak için tekrar dH 2 O ile. Bir hava akışı darbe cihazda kuru.</li>
	<li>Temiz kanal taraf ve yapışkan bant, toz ve başarılı bağ için izin vermek için cihaz üzerinde kalan enkaz kaldırma cihazın üst kısmında.</li>
	<li>Plazma-bond cihazın bir No 1 kapak cam kanal tarafı aşağı,.
	<ol><li>Maruz kapak cam ve aygıt (kanal-tarafına kadar) 100 W 30 gibi uygun bağ için izin koşulları kullanarak hava plazma s veya 24 W 60 s. 
		Not: Ayarları bağ etkinliğini artırmak için ayarlanabilir. Plazma-bağ koşullar bağ etkinliğini artırmak çalışırken uygun temizlik olarak kritik değildir. Yeterince temizlenmiş bir aygıt, hatta ideal plazma koşullar altında bağ değil.</li>
		<li>İle 5 için başparmak aşağı cam kanal yan aygıt ve basın üzerine ters çevir s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Arabellek hazırlık <ol><li>Dilute 1 x S Bazal (100 mM NaCl ve 0,05 M KPO 4, pH 6.0) steril 10 x stoktan.</li>
	<li>Tüm çözümleri arabellek için 1 M tetramisole hisse senedi 1 S Bazal x 1 mM son bir konsantrasyon için oranında seyreltin.</li>
	<li>Fluoresein için her iki ekleyin &#34; akış denetimi &#34; ve &#34; tampon &#34; rezervuarlar.
	<ol><li>Fluoresein 100-mg/mL stokunun 1 x S Bazal oluşturun.</li>
		<li>Hisse senedi için akış denetimi 1 µg/mL ve 0.1 µg/mL arabellek son konsantrasyonları sulandırmak.</li>
	</ol></li> <li>Uyaranlara oluşturmak.
	<ol><li>Son konsantrasyonu 1 m 1 X S Bazal seyreltik gliserol.</li>
		<li>Seyreltik ascaroside #3 (ascr 3) 1 µM son bir konsantrasyon 1 X S Bazal içine için.</li>
	</ol></li></ol> 3. Aygıt Kurulumu Not: bkz: 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> şekil 1. Mikrosıvısal aygıt ayarları. (A) rezervuar ve boru. 30 mL şırınga olmadan bir dalgıç olarak hizmet veren &#34; rezervuar. &#34; bu üç akış seçenekleri ile bir radarı Vana bağlı olduğu. Diğer mikrosıvısal cihaza baðlanýr tüp takılı olduğundan bir iğne (turuncu) için bağlı olduğu sırada bir çıkış pompası, 3 mL şırınga bağlıdır. (B) genel deneme Imaging mikrosıvısal kuruluşu. Cihazın objektif lensler üzerinde bir ters epifluorescence mikroskop bir sahnede yer alıyor. &#34; Akış denetimi &#34; arabellek seyahatleri ile belgili tanımlık tertibat üstünde rafta bir birimi tarafından kontrol edilir bir 3-yollu vana. Arabellek içeren satırların sonra uygun aygıt bağlantı noktaları eklenir. (C) mikrosıvısal aygıtının bağlantı noktalarını. &#34; Akış denetimi &#34; bağlantı noktaları diğer giriş bağlantı noktalarını yan: &#34; uyarıcı &#34; ve &#34; tampon &#34; bağlantı noktaları. &#34; Çıkış &#34; en sağdaki port limanıdır. Solucan yükleme arena, konumu nedeniyle &#34; yükleme solucan &#34; Merkez-çoğu bağlantı noktası aygıt üzerindeki bağlantı noktasıdır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3 mL şırınga ve iğne ( şekil 1A) olduğu gibi de radarı Vana bağlı ile 3-yönlü radarı Vana, 30 ya da 60 mL şırınga ekleyerek <ol><li>hazırla üç sıvı su depoları. İğne mikrosıvısal aygıta uzanan boru bağlanmak ( şekil 1A olduğu gibi -B).</li>
	<li>Hava kabarcıkları rezervuar ve boru çıkarın.</li>
	<li>1 S Bazal x ile ekli boru ile 3 mL şırıngaya doldur ve prize takın limanda</li>
	<li>Arabellek giriş delikleri üst kısmında görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.</li>
	<li>Akış denetimi, arabellek ve uyarıcı boru uygun giriş delik bağlantısı ( şekil 1B olduğu gibi -C), her iki yükleme noktasındaki sıvı damla mevcut sağlama delik ve bağlanmak tampon tüp.</li>
	<li>Yine yavaşça damlacıkları bağlantı noktası giriş yükleme solucan görününceye kadar çıkış bağlantı noktasına bağlıysa şırınga basınç uygulamak.</li>
	<li>Limanda yükleme solucan içine sağlam bir engelleme çiviyi yerleştirmeden</li>
	<li>Şırınga çıkış bağlantı noktasından çıkarın ve ev vakum (-670 Torr) bağlı çıkış satırına ekleyebilir.</li>
	<li>Kontrol aygıtı akışında herhangi bir kabarcık açısından kanalları, görsel ve fotoğraf makinesi ile uyumlu bir yazılım yoluyla video onay aracılığıyla, kullanılan açık kaynak yazılım Mikro-yemlik gibi. Adım 6 mikro-Yöneticisi'ni kullanma hakkında ipuçları için bkz:.
	<ol><li>Herhangi bir kabarcıklar varsa beklemek onları çıkarmak veya PDMS absorbe duvar herhangi bir hayvan önce yükleme; kabarcıklar varlığı sıvıların uygun akış aygıtı aracılığıyla rahatsız edemeyecek.</li>
	</ol></li> <li>GFP filtreyi kullanarak onaylamak uygun akış dinamiği içinde belgili tanımlık aygıt yükleme 3-yollu vana aktüatör ve arabellek geçiş gözlemleyerek solucan önce.
	<ol><li>Belirleme uygun akış dinamikleri: akış denetimi ve tampon çözümlerinde mevcut floresein gözlemlemek ( şekil 2B -2E) denetim basarak akış denetimi değeri değiştiğinde değiştirme 3-yollu vana Vana bağlantısını ( şekil 1B) karşılık gelen düğmeyi.</li>
		<li>Mikro-Yöneticisi'ni açtıktan sonra tıklayın &#34; Live &#34; cihazın canlı bir görüntü gözlemlemek için. Cihazın arabellekleri akışını Floresan ışık kaynağı açın ( şekil 2B -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Resim 2: Bir erkek adapte mikrosıvısal koku çip. (A) akışını desenleri solucan maruz kaldığında cihazın tampon. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. Bağlantı noktası yükleme solucan solucan yönlendirme daha iyi kontrol için sağlar bir eğri eklemek için uyarlanmıştır. (B) akışını desenleri solucan için uyarıcı maruz kaldığında cihazın. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. (C) ölçümleri fabrikasyon olarak adapte cihazın. Bağlantı noktası yükleme solucan, erkek genişliği için tasarlanmış bir 50 µm kanal açılarak bir 42 µm biter. Ölçülen Kanallar tasarımı 25 µm hedef rağmen 32 µm yüksekliğidir. (D-E) A tuzak erkek ifade p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 organizatörü kül özgü değildir ve hiçbir kalsiyum geçişler ASI tespit edildi, ancak bazı ifade ASI nöron gözlenen. (E) sadece floresan ise (D) alan parlak ve floresan aydınlatma, bir arada görüntüdür. Ölçek çubukları 42 µm. (F) ASH nöron tepki 1 M gliserol stimülasyon ile sağlam sinirsel aktivite gösterir. Mavi alanı 1 M gliserol uyarıcı zamanı gösterir. Gölgeli bölge n ile standart hatasını gösterir yedi solucanlar dan 20 bakliyat =. Kırmızı izler depolarize yanıt-e doğru göstermek. Axes ΔF/F 0 göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 4. hayvan hazırlık Not: bkz: başvuru 23.
<ol><li>1 M gliserol yanıtlarını görüntüleme kül.
	P sra-6 için olumlu <ol><li>yer yaklaşık 20 C. elegans erkek:: GCaMP3 dizi ifade nematodunun büyüme orta (NGM) agar plaka üzerine numaralı seribaşı OP50 E. coli çim ile. Floresan GECI ifade ve/veya bir ortak enjeksiyon marker dizi pozitif hayvanların tanımlanması için kullanın. 
		Not: Dizi olumlu hayvanlar kullanılan GECI göre belli (Yani, hayvanlar GCaMP ifade bulabilsem yeşil mavi ışık stimülasyon altında lebomm hayvanlar kırmızı yeşil ışık stimülasyon altında belli iken). Ortak enjeksiyon işaretçileri GFP ve RFP, gibi floresan diğer proteinler gibi rol-6, fenotipik işaretleri alanı kullanılabilir veya pha-1 mutasyon 28 gibi baskın bir fenotip kurtarabilirsiniz.
		<ol>Eğer hemen tahlil önce çekme genç yetişkin erkekler toplama <li>. Gün önce tahlil, L4 larva erkekler cevap.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>1 µM ascr 3 CEM yanıtlarını görüntüleme.
	<ol><li>Çekme yaklaşık 20 L4 C. elegans erkekler (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); onu-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dsRed ortak enjeksiyon marker ifade için olumlu. 
		Not: dsRed ray nöronlar içinde erkek masalı gözlemlemek ve GCaMP ifade dört CEM nöronlar içinde daha onaylamak daha kolay ifadesidir.</li>
		<li>İzole hünsa görüntüleme deneme yapmadan önce bir çim OP50 E. coli için 5-14 h seribaşı NGM agar tabakta gelen bu erkek. 
		Not: en az 5 h için izole değil erkek davranışsal ascr 3 yanıt vermeyen ve bu nedenle ascaroside için burada görülmektedir daha bile az kalsiyum geçişler sergileyebilirler.</li>
	</ol></li></ol> 5. Hayvan yükleme Not: bkz: refefence 1.
<ol><li>Standart solucan bakım teknikleri kullanarak bir seribaşı NGM agar plaka üzerine bir solucan seçin.
	<ol><li>Çekme solucanlar bakteri çekme üzerine toplama (düzleştirilmiş Platin tel yapılmış) bir çekme, alev ve &#34; dabbing &#34; almak için bir solucan. Yavaşça solucan kapalı, kendi tarama izin yeni plaka üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Plaka sular altında olacak yaklaşık 5 mL 1 x S Bazal seribaşı plakasına eklemek.</li>
	<li>1 x S Bazal ile önceden doldurulmuş oldu bir yükleme şırınga (Yani, 3 mL şırınga ile ekli boru) içine belgili tanımlık kurt çizin.
	<ol><li>Solucan değil sonuna kadar içine şırınga, sadece tüp içine emmek için emin olun. 
		Not: solucan şırınga geçerse, yakın olduğunu onu geri içine tüp imkansız.</li>
	</ol></li> <li>Çıkış radarı kapak kapatarak akışını durdurmak için vakum kapatmak.</li>
	<li>Sağlam iğneyi limanda yükleme solucan engelleme kaldırma</li>
	<li>Açmak böylece bu havalandırma ( şekil 1B) çıkış bağlantı noktasına bağlı radarı Vana. 
	Not: bir canlı video solucan yüklenirken konumunu ve yönünü hayvan (Adım 5.8-5.13) onaylamak için kullanın.</li>
	<li>Limanda yükleme solucan tüpüne yükleme solucan Ekle</li>
	<li>Solucan yükleme kanalda görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.</li>
	<li>Solucan kuyruk-ilk kanal başlanır, solucan kanal girmesini önlemek için şırınga pistonu üzerinde çekin.</li>
	<li>Uygulama ve baş kanal ilk girene kadar basınç ters arasındaki geçiş.</li>
	<li>3'lü radarı kapak kapatarak vakum atmosfer yerine vakum açmak için çıkış noktasına bağlı açık.</li>
	<li>El ile yönlendirmek ve arabellek akışı kanal, ama henüz maruz öyle ki solucan kafa yerleştirmek için şırınga dalgıç tarafından iç karartıcı baş serbestçe taşıyabilirsiniz basınç uygulayın ( Şekil 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Uyarıcı ve satın alma <ol><li>bir açık kaynak mikroskobu yazılımını kullanarak, mikro-Yöneticisi gibi tarafından esir alma imge: 10 kare/s Mavi ışıklı uyarma kullanarak TIFF yığını olarak kaydetmek (470 nm) 30 s.</li>
	<li><ol><li>Açık 100 Bayan için ana menüsünde pozu ayarlamak &#34; çok D alma. &#34; yazılım ana menüden. Ayarla &#34; numarası &#34; için &#34; 300, &#34; ve &#34; Aralık &#34; için &#34; 0. &#34;'ı tıklatın &#34; edinme! &#34; video kazanmaları.</li>
	</ol></li> <li>Uygula 10 s nabzı satın alma başlatılıyor sonra uyarıcı 5 s. İstediğiniz gibi uyarıcı uygulama süresi ayarlamak.
	<ol><li>5 edinme sonra s video, değiştirme uyarıcı test edilen hayvan uygulamak için akış denetimi arabellek kontrol 3-yollu vana. Vana bağlantı ( şekil 1B) en sol düğmesini.</li>
		<li>Sonra 10 s uyarana maruz kalma (Bu sefer ayarlanabilir kullanıcı tarafından istediğiniz gibi), yine Vana linke en soldaki düğmeye basarak akışı arabellekleri alter.</li>
	</ol></li> <li>Kayıt sadece 30-s pencere temele dönmek GECI Floresans izin vermek için tamamlanana kadar tampon altında.</li>
	<li>İstediğiniz şekilde yineleyin. Bekle 30 s edinme sonu ve sonraki deneme inisiyasyon arasında.</li>
</ol> 7. Görüntü analizi <ol><li>dosya ImageJ penceresine sürükleyerek açık kaynak yazılım ile ImageJ, TIFF yığın açın.</li>
	<li>İmleç kullanarak tıklatın ve faiz (ROI) faiz nöron çevresinde bölge ayarlamak için sürükleyin. Faiz (olduğu gibi şekil 3A) nöron soma içerecek şekilde bölgesi ayarlayın.</li>
	<li>Aç'ı tıklatarak yığınları arasında yatırım Getirisi floresan yoğunluğu z yığını arsa-&#62; görüntü - &#62; yığınları - &#62; z ekseni profil çiz.</li>
	<li>Tıklama &#34; listesi &#34; açılır penceresinde. Düzenle-'yi &#62; değerleri kopyalamak için Kopyala. Değerleri Yapıştır bir elektronik tablo programına.</li>
	<li>GCaMP ifade içermeyen solucan bir bölgeye yatırım Getirisi sürükleyerek her darbe için arka plan Floresans analiz.</li>
	<li>Arka plan Floresans nöron floresan yoğunluğu değerinden çıkararak her darbe için arka plan çıkarma gerçekleştirmek.</li>
	<li>ΔF/F 0 her darbe her çerçeve için hesaplamak.
	<ol><li>Olarak yatırım Getirisi için ilk 1 ortalama yoğunluk değerini hesaplamak F 0 s satın alma (Örneğin, çerçeve 1-10).</li>
		<li>ΔF/F 0 faiz çerçeve arka plan düşülen değeri hesaplanan F 0 değerine göre bölerek hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Görüntüsü her nöron ve her uyarıcı darbe için yineleyin.</li>
	<li>Nöronlar ile tutarlı yanıt profilleri, ASH gibi tüm darbeleri her neuron için ortalama ve SEM (olduğu gibi şekil 2F) hesaplamak için.</li>
	<li>Her neuron için zaman içinde SEM ile ortalama ΔF/F 0 arsa. 
	Not: Bu durumda, bu heatmaps her deneme de bireysel nöronal tepkilerin dahil etmek yaygın uygulamadır. Kalsiyum geçişler tekrarlanan elektrodlar arasında uyarıcılara maruz üzerine tutarlı değişiklikler sergi değil nöronlar, veya farklı kişiler 23, bireysel darbe izlemeler (olarak göstermek için daha uygun olabilir şekil 4). Ayrıntılar için tartışma verilerin nasıl görüntüleneceğini belirleme bkz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis,+Microscopy,+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li><li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+chips:+Microtools+for+C.+elegans+biology.">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li><li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm.">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li><li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans.">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023 (2016).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).</li><li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action.">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour.">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li><li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior.">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans.">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li><li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes.">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li><li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans.">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males.">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mating+cues+in+C.+elegans.">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li><li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li><li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+in+C.+elegans.">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li><li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans.">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans.">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li><li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+male:+postembryonic+development+of+nongonadal+structures.">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>C&#225;ceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies.">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Garc&#237;a, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li><li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autofluorescent+&amp;#34;lipofuscin+granules&amp;#34;+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes.">The autofluorescent &amp;#34;lipofuscin granules&amp;#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li><li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans.">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans.">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Erkek adapte koku çip bir dönüş yönünün daha fazla denetim ve erkek C. elegansverimli yakalama sağlar daha dar bir yükleme limanı içine içermektedir. Bu z-istifleme için gerek kalmadan nöronal ikili çift sol ve sağ üyeleri görselleştirme sağlar. Bu eğri bir solucan zamanında yönünü dikey %100 uzak nerede sadece bir ikili çift kül (şekil 2B-E)29,30gibi floresan bir marker ile hedef yol açar. Ancak, nöronal sınıfları gibi CEM, dört Radyal simetrik nöronlar ile tüm dört nöronlar görünür zaman sadece üçte biri. Başka bir üçüncü test solucan var sadece üç dört nöronların görünür ve üçüncü kalan için sadece ayırt fark değil-sol asimetri (veri gösterilmez) dorsal ve ventral hücre organları arasında. Dar bağlantı noktası solucan dalgalanma z ekseni önlemek için daha düşük bir kanal yüksekliği ile birleştirilmiştir. Bu tasarım erkek görüntüleme için gelecekte sağlar çalışmaları, hangi, erkek connectome25,31sürekli artan bilgi ile birleştirildiğinde, daha iyi seks özel sinirsel işlevini anlamak için izin verir.
Floresans nöron ilgi içinde değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım ImageJ bu protokol için gerçekleştirilen çözümlemesini kullanır. Geçerli tasarım ile 1 mM tetramisole arabellek etkili solucanlar felç ediyor ve hareket görüntüsü nöronların engeller. Hareket önlenebilir değildir veya kullanıcı bulduğumuz kullanımı istemiyorsa, daha karmaşık izleme komut dosyaları7taşırken bu nöronlar izlemek yazılmalıdır. Etkili bir şekilde yükleme limanı ve gliserol gibi son derece caydırıcı bir uyarıcı görüntülendiğinde kısıtlı için çok küçük olduklarını ancak, bu protokol için erkek solucanlar sadece gitmenizi sağlar. Bu durumlarda bile, hareketin kısa ve izleme ayarlar büyük miktarda gerektirmez — bir yatırım Getirisi yeni nöron konumu ayarlama yanlış floresan dökümanları (Şekil 2) azaltır.
Bir tek-solucan, tuzak tabanlı görüntüleme saat1' de tek bir solucan yansıması kısıtlamasıdır. Başka bir bu tuzakları solucanlar cihaz içindeki sıkışmış almak kısıtlamasıdır tıkanmış için aygıtları ve "kadar kullanılan" sadece birkaç solucan görüntüleme sonra neden. Ancak, yeni aygıtları ana kalıp imalatı için hızlı gerçekleştirme süresi bu zararı azaltır. C. elegans32,33duyarlilik ikna etmek için genişletilmiş mavi ışık aydınlatma da gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı görece kısa deneysel zaman dilimi (30 s) ölçülebilir photobleaching olmadan görüntüleme sağlar. Ancak, photobleaching ve daha uzun deneylerde duyarlilik önlemek için ışık kaynağının pulsed7olabilir. Örneğin, her 100 ms pozlama sırasında ışık 10 Bayan bu artan vücut autofluorescence saat7üzerinde ortadan kaldırmak için gösterilmiştir için Geniş puls.
Düzgün erkekler için ascarosides yanıtlarını sınamak için larva sahne 4 (L4) erkek ilk hünsa, en az 5 h için gelen Feromonlar23saf yakınındaki yanıt elde etmek için izole gerekir. Bu süre boyunca daha az yalıtım hayvanlar için ascarosides yanıt vermek başarısız olmasına neden olabilir. Ancak bu yalıtım gliserol gibi sigara ascaroside yardımlar sınarken gerekli değildir. Ancak, tutarlılık uğruna, hayvanlar her zaman kalsiyum görüntüleme için izole en az 5 s önceden vardı. CEM gibi bazı nöronların her stimülasyon nöronal yanıt temin ve yanıt her CEM öyle bir belirli "sinirsel gösterimi kod" oluşturmak için yapar. CEM bu fenomen Elektrofizyoloji çalışmaları, yanı sıra kalsiyum olanlar burada23açıklandığı gibi çalışmalar Imaging ile gözlenmiştir. Böylece, her ascaroside maruz hayvan nöronlarda CEM ölçülebilir kalsiyum geçişler23garanti edilmez. Aslında, birçok tarihi için soruşturma ascarosides ölçülebilir kalsiyum geçişler13,15,34,35temin değil. Ölçülebilir geçişler başarılı yaşla feromon iki faiz (şekil 3) ascaroside için maruz beş hayvanların üç darbeleri yalnızca biri sırasında gözlendi. Bu daha önce diğer labs23' gözlenen başarı oranı ile eşleşir. Bu değişkenliği feromon yanıt okurken bir kısıtlamadır ve bu iletişim kuralı erkek tabanlı odak nedeniyle değil.
Ascarosides yanıt olarak elde edildi kalsiyum geçişler soruşturma zaman, bir daha da soruşturma olmadan tutarlı yanıt alınamaması göz ardı değil. Bu nöronal bir sınıf içinde değişken yanıt onaylamak için Elektrofizyoloji çalışmalar gibi deneyler yoluyla test edilebilir. ASH gibi nöronlar için bu güvenilir, tutarlı yanıt alınamaması hataları uyarıcı kontrolü gibi daha büyük deneysel sorunların göstergesi olabilir yanıt. Değişkenlik yanıtta beklenen yanıt-e doğru tepe yoğunluğunu da araştırılması. İzleri standart sapma veya standart hata (olduğu gibi şekil 2F) ile çizilebilir. Standart sapma küçükse, izlerini çizilen ve bu nedenle analiz. Orta standart sapmalar lider değişimi fark tutarı ise, veri olabilir Cevabıyla yanıt yanıt değişim göstermek için "tip" göre heatmaps eşlik eden ile aynı çizilen. Önemli değişim (şekil 3), neyin doruklarına cant dağıtılacak Gauss bir şekilde, eğer yanıt-e doğru yanıt "türleri" (Örneğin, kutuplarını, hyperpolarizing veya sigara polarize) kategorize edilebilir23. Belirli bir "türü" düşmek yanıt çizilen ve birlikte analiz. Benzer şekilde, heatmaps de bu analiz eşlik etmeli.
İleride, bu aygıt yükleme limanı daha da daraltarak larva sahnelenen nematodlar görüntüleme için izin vermek için adapte edilebilir. Daha fazla yükleme limanı sonuna daralma hayvan kısıtlaması için sadece kirpikler duyusal nöron hücre gövdesi aksine görüntüleme için izin vermek için izin verir. Diğer cihazlar daha yaygın olarak okudu hermafrodit için tasarlanmıştır, bu adapte koku çip erkek sinir devreleri sinirsel aktivite görüntüleme sağlar. Erkek connectome hala aydınlatılmamıştır, seks özel ağlar neural dynamics ölçmek için güçlü olmak tamamen nöronal sinyal anlamak için önemlidir. Hermaphroditic ve erkek yanıt arasındaki farklar şimdi test edilebilir ve bu aygıtı kullanarak ölçülen.

Yuvarlak solucanlar C. elegans,-ebilmek var olmak deneysel olarak işlenmiş1gibi mikrosıvısal aygıtları tam kontrollü ortamlarda, artan erişim hayvanlar, neyin sağlar. Bu çalışmalar davranış deneyleri, kalsiyum görüntüleme çalışmaları veya hatta gösterimleri deneysel sonuçlar1,2,3,4daha kesin ölçümler sonucu belirli fenotipleri için dahil, 5,6. Havacilik hangi aracılığıyla detaylı deneyler reaktifler en az miktarda gerçekleştirirken çalıştırılabilir küçük ölçekli sıvı koşulları sağlamak. Yeni mikrosıvısal cihaz tasarımları sürekli üretim ve her kullanımı, sinirsel görüntülemede kullanılan aygıtları yakalamak doğal sinüsoidal hareketi C. elegans davranış deneyleri ve sinirsel görüntüleme çalışmaları için izin arenalar gelen değişir ve yüksek üretilen iş fenotipik analizde genetik4,5,6,7ekranlar için izin aygıtlara koku çalışmaları. Ana kalıp imalatı mikrosıvısal aygıt oluşturmak ucuzdur — efendi kullanılırlığı verilen — ve kullanımı kolay, bırakmak için hızlı veri üretimi ile yüksek-den geçerek çalışmalar. Fabrikasyon polimerler polydimethylsiloxane (PDMS) gibi kullanan aygıtların saat içinde yeni cihazlar yaratılması için izin verir.
Kalsiyum görüntüleme çalışmaları ifade hedef hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Turk) gerçek zamanlı8,9,10,11bu hücrelere sinirsel dinamikleri ölçmek için kullanın. C. elegans şeffaf doğası bu proteinler Canlı hayvanlarda floresan düzeyde kayıt sağlar. Geleneksel olarak, Turk yeşil flüoresan protein (GFP) üzerinde itimat-sensör GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), her ne kadar daha yeni çalışmalar daha iyi sinyal-gürültü oranı ve kırmızı kaymıştır uyarma profiller için izin vermek için bu sensörler adapte olması dayalı. GCaMP3 gelişimini, bu özellikleriyle proteinler çeşitli, GCaMP6s ve GCaMP6f gibi sensörler dahil olmak üzere (yavaş ve floresan kapalı-fiyatlar, sırasıyla hızlı), RFP-Calmodulin-M13 peptid (lebomm) yanı sıra, sahip olduğu kırmızı kaymıştır harekete geçirmek profil. Bu Turk C. elegans hücre özel gen organizatörü dizileri ile kombinasyonu ilgi, özellikle duyusal sinir hücreleri12,13,14,15 hücreleri hedef alabilirsiniz , 16.
Mikrosıvısal çalışmalarda C. elegans kullanım kolaylığı belirgin olsa da, hemen hemen tüm çalışmalar hünsa üzerinde odaklanmıştır. Erkekler sadece 0,01-0,02 için muhasebe rağmen vahşi türü nüfusunun %, çok değerli bulgular--dan onların karakterizasyonu çıkabilir. Hermafrodit sinir sisteminin fiziksel connectome tam on yıl17için eşlenen süre erkek connectome özellikle hayvan18kafa bölgesinde eksik, kalır. Kalsiyum görüntüleme erkeklerde kullanımı erkek sinir sistemi ve iki cinsiyetler arasında ortaya çıkan farklılıklar bir anlayış oluşturmak için yardımcı olacaktır. C. elegans Yetişkin erkekler daha küçük boyutu daha büyük hermoafroditler için tasarlanan geleneksel koku aygıt yükleme noktalarından etkili ve güvenilir yakalama engeller. Bu sorunu çözmek için Chronis koku çip19 değiştirilmiş bir versiyonu daha dar bir yükleme limanı ile alt kanal yüksekliği, geliştirilmiş ve ikili sol/sağ görselleştirme için izin (hangi hayvan döndürmek) solucan yükleme limanı, döner nöronal çiftleri. Bu tasarım izin verir: genç yetişkin erkekler (1 etkili bindirme, ikili eşleştirilmiş sinir hücreleri iki üye ve (3) erkek nöronlar sinirsel aktivite hassas görüntüleme görselleştirme için hayvan daha güvenilir (2) bir yönünü.
C. elegans erkek farklı hünsa daha için a değişiklik-in ascarosides (ascr) veya Yuvarlak solucanlar Feromonlar20,21,22,23 yanıt çalışmalar giderek, göstermek ,24. Bu nedenle, sinirsel dynamics ve temsilcilikleri erkek connectome içinde bir anlayış geliştirmek bile daha uygun oldu. Erkek C. elegans içeren 87 seks özgü nöronlar hermafrodit25,26' da yok içinde connectome olarak değiştirme-henüz belirlenmemiş yolları. Bu benzersiz sinirsel dinamikler resim edememek bizi daha iyi seks özel yanıt ve sinirsel ifadeleri anlamak izin verir.
Bu iletişim kuralı bir erkek adapte koku çip erkek C. elegans sinirsel görüntüleme için açıklar chemosensation. ASH, güvenilir bir şekilde 1 M gliserol için erkeklerde, önceki ile tutarlı hermaphroditic yanıt nosiseptif nöron27çalışmalar. Ascarosides maruz gerektiren test edilecek hayvanlar daha çok sayıda hayvan hayvan, değişken olan yanıt-e doğru çıkarmak. Erkek özel CEM nöronların yanıt daha önce Elektrofizyoloji ve çalışmalar, Imaging kalsiyum degisken ascaroside #323için yanıt vermek için gösterilmiştir.

<table width="2211">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:219px;">University Wafer</td>
			<td style="width:205px;">452</td>
			<td style="width:1260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 2035</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111070-0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100-4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Mask</td>
			<td>Cad/Art Services</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">1.0 mm Dermal Punches</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hard Tubing</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>0.415/0.425&#34; OD x .500 Long</td>
			<td>Batch PB07027</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">30 mL syringes</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used as buffer reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td>
			<td>Component Supply Company</td>
			<td>NE-231PL-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Mercator Control System LF-5 Plasma System</td>
			<td>Mercator</td>
			<td>LF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Scotch Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>BSN43575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 20 Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Vacuum Desicator</td>
			<td>Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:205px;">420250000</td>
			<td>24 cm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Weigh Boats</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-01017-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Classic Plus Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:205px;">PB1501-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-25554-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">30-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Oven</td>
			<td>Sheldon Manufacturing Inc</td>
			<td style="width:205px;">9120993</td>
			<td>Model Number: 1500E.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Zeiss Axio Observer.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td style="width:205px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Blue Fluorescent Light</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td style="width:205px;">SOLA SM6-LCR-SA</td>
			<td>24-30V/7.9A DC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Illumination Adaptor</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">423302-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td>
			<td>Parker</td>
			<td style="width:205px;">001-0017-900</td>
			<td>3-way valve for controlling flow.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ValveLink8.2&#174;</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:205px;">01-18</td>
			<td>Flow Switch Controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Apex</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Peptone</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">CaCl2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270741-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Tetramisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">L9756-10(G)</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fluorescein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">FD2000S-250mg</td>
			<td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">G6279-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ascaroside #3</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">NaCl</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">18-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9268.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3252-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ASH GCaMP3 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">CEM GCaMP6 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">&#34;Reservoir&#34;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:1260px;">To create a Reservoir: A &#34;30 mL syringe&#34;, is connected to a &#34;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&#34;, which is connected to a &#34;3 mL syringe&#34; and a &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34;. The &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34; is then inserted into &#34;Soft Tubing&#34; approximately 1/3 of the way down the needle.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

Kalsiyum göstergeleri kullanımını büyük ölçüde sinirsel dinamikleri ve yönetmelik anlayışımızı geliştirmiştir. Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans, tamamen eşleştirilmiş sinir sistemi ve şeffaf anatomi, kalsiyum göstergeler kullanarak gerçek zamanlı sinirsel dynamics anlamak için ideal bir model sunar. Mikrosıvısal teknolojileri ve deneysel tasarımlar ile birlikte, hem ücretsiz taşıma ve kapana kısılmış hayvanlarda kalsiyum görüntüleme çalışmaları bu göstergeler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, içinde Chronis ve ark., açıklanan koku çip gibi yakalama aygıtları kullanan en önceki çalışmaları olarak daha az yaygın erkek hem morfolojik ve yapısal olarak daha yaygın hermafrodit olarak kullanılmak üzere tasarlanan aygıt var birbirine benzemeyen. Adapte bir koku çip tasarlanmıştır ve genç yetişkin hayvanlar kullanarak erkek nöronal görüntülemede verimlilik artışı için fabrikasyon. Bir dönüş hayvanlar döndürmek için ve 2D görüntülemede ikili bir çift bireysel nöronlar ayrılması için izin vermek için bağlantı noktası yükleme solucan içine dahil oldu. Solucanlar propil mikrosıvısal aygıt içinde kontrollü bir akış önceki hermafrodit çalışmalarda açıklandığı gibi maruz kalır. Kalsiyum geçişler sonra açık kaynak yazılım ImageJ kullanarak analiz edilir. Burada açıklanan yordamı erkek tabanlı C. elegans artan miktarda için izin vermelidir çalışmalar seks özgü nöronal sinyal verme mekanizmaları bizim anlayış derinleştirilmesi, Imaging kalsiyum.

Genel aygıt kurulum örneği şekil 1A-Bgörülebilir. Şekil 1A uygun rezervuar inşaat ve kurulum gösteriyor. Şekil 1B mikrosıvısal aygıt depolar bağlantılarını gösterir. Şekil 1 c ile netlik için etiketli bağlantı noktalarını ayrı ayrı bir mikrosıvısal aygıtı gösteriyor.
Yükleme limanı eğrideki erkek adapte mikrosıvısal aygıt tasarımını içerir, ancak akış dynamics Chronis tarafından tasarlanmış alet aynı ve ark.19(şekil 2A-2 C). Akış Arabellek hangi akış kontrol vanası açık değiştirerek kontrol edilebilir (şekil 2A-2B). Fabrikasyon olarak ölçümleri tasarlanmış dosyasından değişir. Şekil 2C içinde sağlanan ölçümleri "gibi uydurma" ölçüleri vardır.
Erkek adapte koku aygıt, onların yerleşim ve yönlendirme yanı sıra kanal akış dinamikleri erkek C. elegans yükledikten sonra alan parlak ve floresan görüntüleme ile doğrulanabilir (şekil 2B-2E). Nosiseptif nöron, ASH, 1 M gliserol için GCaMP3 ifade solucanlar pozlama Floresans kül nöron, sinir aktivitesinin (şekil 2F) gösterge içinde görünür değişiklikleri sonuçlanır. Floresans ince değişiklikleri gözle görünür olmayabilir, ama yazılım bu değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Ücretsiz ImageJ yazılım analiz ve kül nöronlar 1 M gliserol maruz üzerine floresan yoğunluğu zaman içinde (şekil 2F) ölçmek için kullanılabilir. Bu hünsa27 ' deki ve gliserol kül nöronal cevaben sağlamlığı nedeniyle gözlenen için benzer, bu test tüm hayvanlarda görülmektedir.
Aksiyel veya dönme hareketi az miktarda kez video analiz (şekil 3A) sırasında bir nöron izleme algoritma gerektiren unparalyzed hayvanlarda bekleniyor. Bazı hayvanlar (~ %10) hala denemeler sırasında hareket olsa da (Örneğin, 1 mM tetramisole) arabelleklerindeki bulduğumuz eklenmesi bu etki neredeyse ortadan kaldırır. Bu tarafından atlatılabilmişlerdir: (a) kullanarak daha verimli bir şekilde sıkışıp kalırlar; büyük erkekler (b) genişlik veya bağlantı noktası daha da yükleme solucan kalınlığı azaltmak; veya (c) de kullanılan paralitik veya başka bir felç kullanarak konsantrasyonu artan. Bu da orada değil çok fazla kafa tuzak sonu geçmiş ve koku kanal maruz sağlayacaktır. Bir deneme solucan hareketi ile ortaya çıkarsa, alan analiz taşındı ve sonra hareketi (şekil 3B) oluştuğu çerçeve başlayan yeni nöronal konumundan yeniden okumak. Sinirsel izlemeler kullanıcı tarafından el ile yeniden inşası bu örnekte gerekir. Bu nöron içindeki floresan değişikliklerini çözümlemek ve19da yazılabilir hareket ederken nöron'ın merkezi takip komut dosyaları.
Erkek C. elegans çekici biyojenik Feromonlar dört seks özel CEM nöronlar23üzerinden ascarosides denilen hissediyorum. Kalsiyum geçişler erkeklerde gözlendiğinde, şekli, işaret ve büyüklüğü nöronlar ve hayvanlar (şekil 4A-B) arasında değişken yanıtlardır. Ancak, Feromonlar erkek yanıt olarak güvenilir birçok hayvan (şekil 4 c) kalsiyum geçişler olarak görülmektedir değil. Çoğu ascarosides kalsiyum geçişler hissi13,14,15üzerine temin değil gibi bu cesaret kırıcı, değil.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig3.jpg"> 
Şekil 3: adresleme solucan hareketi sırasında görüntü edinme dönemi. (A)ΔF/F0 (floresan yoğunluğu ortalama arka plan floresan yoğunluğu için ilk 1 bölü değiştirmek s Alım) nerede faiz nöron 1 için güvenilir bir şekilde statik bir alanı tanımlayarak ImageJ kullanarak hesaplanan s. (Mavi alanı), uyarıcı darbe sırasında hayvan taşındı, kalsiyum izleme yukarıdaki resimlerde görüldüğü gibi artık analiz alanı (sarı kutu) içinde bulunan nöron sonuçlanan. Ölçek çubukları 42 µm. kesik çizgiler Haritayı her görüntüde solucan konumuna karşılık gelen izleme bölgesi belirtmek. (Alan analiz nöron duruşma sırasında takip etmek taşıdıysanız ve bireysel izleri gerçek sinirsel dynamics iletmek için yeniden oluşturulurB), izleme hayvan kımıldamadı gibi görünür. Kesik çizgiler solucan hareket için düzeltilen izleme bölgesi göster. Hem kül nöronlar, sol ve sağ için izlemleri (yakın (kırmızı) ve ASHR (mavi), sırasıyla) gösterilir. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig4.jpg"> 
Şekil 4: Erkek C. elegans CEM 1 mikron ascr 3 yanıttır değişken. Erkek özel CEM nöronlar biyojenik Feromonlar için yanıtının benzersiz desenler görüntüler. (A)her CEM nöron bir darbe için bir duyarlı hayvan gözlenen yanıt gösterilir. Dört CEM nöronlar vardır: dorsal sağ (CEM DR), dorsal sol (CEM DL), ventral sağ (CEM VR) ve ventral sol (CEM VL). Üç dört nöronların ile değişen şekli ve büyüklüğü, depolarizations dördüncü ascaroside için yanıt vermiyor ile yanıt. (B) yaklaşık 1 / 3 (2/7 Bu çalışmada test) kapana kısılmış hayvan sonuç sadece üç nöronlar yansıması mümkün. Bir solucan bu yönde tepkiler ilk solucan gözlenen farklı CEM kalsiyum geçişler sonuçlandı. CEM DR hem yönelimleri görünür ve hayvanlar arasında değişken yanıt sergileyen bu solucan yönünü değişikliği nedeniyle değildi. (C) birçok solucan yok (5/7 test bu çalışmada) herhangi bir tespit kalsiyum geçişler ile yanıtla. Gösterilen bireysel temsilcisi görüntüleri araziler yukarıda gösterilen tek hayvanların izleri. ,ölçek çubukları göstermek 42 µm. izlemeler: 1 mikron ascr 3 pozlama zaman mavi alanı gösterir. Kırmızı izler depolarizing tepki gösterir. Siyah izleri gözlenen yanıt göstermek. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons at JoVE.com

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.0K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Video: Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Nörobilim

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...