男性; に対応した初期設計ファイルをご提供するマヌエル · ジマーを感謝したいと思います合成と ascr; #3 の供給のためのフランク ・ シュレーダー洞察力とイメージングと分析支援のためロス Lagoyこの原稿のレビューに貢献したクリストファー ・ シュートと一緒に、マスターの作製とローラ Aurilio.この作業に資金は国立衛生研究所の助成金 1R01DC016058-01 (バッハ)、全米科学財団助成金あわせて 1605679 (D.R.A.)、バローズ Wellcome キャリア賞科学的なインターフェイス (D.R.A.) の下で提供されました。

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男性に適応した嗅覚チップは、男性c. の elegansの効率的なトラップの方向のより詳細に制御でき狭いロードポートにターンを組み込みます。Z スタックを必要とせず、神経の二国間ペアの左と右の両方のメンバーの可視化が可能になります。この曲線は、アッシュ (2 D 図-e)29,30などの蛍光マーカーで 1 つだけの二国間のペアが割り当てられているワームの時間の垂直 100% から方向に します。ただし、CEM など 4 つの放射状に対称なニューロンと神経のクラスですべての 4 つのニューロンが表示されます時間の 3 分の 1 だけ。ワームをテストの 3 分の 1 3 つのだけ目に見える 4 つのニューロンと残りの 3 番目ののみ区別の違いは、背側と腹側の細胞体、左右非対称性 (データは示されていない) のいない間。狭いポートは、z 軸にワームの変動を防ぐためにより低いチャネル高さと結合されます。このデザインは、将来的に男性のイメージング研究、男性コネクトーム25,31の絶えず増加の知識と組み合わせると、性特異的神経機能の理解を深めるためになります。
このプロトコルに行われた分析は、関心のニューロンの蛍光の変化を測定するのに ImageJ の無料のソフトウェアを使用します。現在の設計では、バッファーに 1 mM tetramisole 効果的にワームを麻痺させるし、イメージされているニューロンの移動を防ぐことができます。運動は、予防ではない場合、またはユーザーが麻痺の使用を避けたい場合は、7を移動するニューロンを追跡するより複雑なトラッキング スクリプトを書かれてする必要があります。ただし、このプロトコルでは男性ワームのみ移動彼らが小さすぎて読み込みポート、グリセロールなどの非常に嫌悪刺激を提示されたときに効果的に拘束します。これらのインスタンスでも動きは簡単と大量のトラッキング調整を必要としない-不適切な蛍光読取 (図 2) を軽減する新しいニューロン周辺の投資収益率を設定します。
シングル ワームの制限、トラップ ベースのイメージングは、1時間で視覚化されるその 1 つだけのワームです。これらのトラップのもう一つの制限は、デバイス内ワームが動けなくことができますのみいくつかのワームをイメージングした後目詰まりするデバイスと「を使用」を引き起こしています。ただし、マスター型から新しいデバイスの作製を迅速な納期では、この欠点が軽減されます。拡張の青色光照明は、線虫32,33の光損傷を誘導するために示されています。この議定書の比較的短い実験時間枠 (30 s) 測定可能な退色せずイメージングが可能になります。しかし、長い実験で症状や退色を避けるためには、光源がパルス7をすることができます。たとえば、10 さんこれが7時間以上増加体蛍光を除去するために示されているため、各 100 ms 露光中に光をパルスできます。
Ascarosides への応答の男性を適切にテストするために幼虫の段階 4 (L4) 男性最初分離しなければなりません、少なくとも 5 時間の両性具有からフェロモン23に近い素朴な応答を達成するために。この期間よりより少しのための分離は、ascarosides に対応するため失敗する動物を引き起こす可能性があります。ただし、グリセロールなどの非 ascaroside キューをテストするとき、このような分離は必要ではありません。しかし、一貫性を保つのために、動物いたカルシウム イメージング、少なくとも 5 h 前に分離では常に。CEM など、いくつかのニューロンのすべての刺激は、ニューロンの応答を引き出すだろうし、応答は各 CEM は、特定の「コード」の神経表現を生成します。CEM のこの現象は、電気生理学研究を介してだけでなく、カルシウム イメージング研究ここで23で説明したもののように観察されています。したがって、ascaroside 露出のすべての動物の CEM 細胞で測定可能なカルシウム濃度23は保証されません。実際には、日付に調査した ascarosides の多くは測定カルシウム トランジェント13,15,34,35を引き出すないです。測定可能なトランジェントの成功の獲得していた中の 1 つだけ興味 (図 3) の ascaroside にさらされる 5 つの動物の 2 つのフェロモンの 3 パルス.これは以前他のラボの23の観察の成功率と一致します。この変動は、フェロモン応答を勉強するときは制約と男性ベースのフォーカスこのプロトコルのためではないです。
Ascarosides に応答を誘発するカルシウム濃度を調査するとき 1 つはより詳しい調査なしの一貫した応答の欠如を解任しないでください。これは、神経のクラス内で変数の応答を確認するための電気生理学研究などの実験をテストできます。灰などの神経細胞の応答、確実に一貫した応答の欠如は刺激性制御のエラーなどの大きな実験的問題を示すかもしれない。応答の変動が予想される場合、応答のピーク強度を検討もできます。トレースは、標準偏差と標準誤差 (図 2 f) のようにプロットできます。標準偏差が小さい場合トレースをプロットし、などを分析することができます。中程度の標準偏差につながる変化の顕著な量の場合は、データをすることができます応答応答-応答による変化を表示する「タイプ」によって並べ替えられてヒートマップなどを伴うと、同じプロット。応答を応答 (例えば、脱分極、過分極、または非偏光) の「種類」に分類できる有意な変化 (図 3)、前記ピークは、ガウスの方法で配布することはできません、がある場合23。「型」に分類される応答をプロットし一緒、分析できます。同様に、ヒートマップなどもこの分析を伴うべきであります。
前進して、このデバイスを読み込みポートをさらに狭くすることによって線虫の幼虫上演のイメージングを可能にするのに適応できます。ロードポートの末をさらに絞りこみに動物の制約の感覚ニューロンの細胞体ではなく繊毛だけのイメージングを可能になります。他のデバイスより一般に調査の両性具有者のようなこの適応の嗅覚チップ男性の神経回路における神経活動イメージング可能になります。男性のコネクトームはまだ解明されている、セックス固有のネットワークのダイナミクスを測定することができるという神経伝達を完全に理解する重要です。雌雄同体と男性の反応の違いは今テストすることができます、このデバイスを使用して測定します。

マイクロ流体デバイスなどを提供正確に制御された環境へのアクセス増加前記動物、線虫C. elegans、実験操作1をすることができます。これらの研究は、行動アッセイ、カルシウム イメージング、または実験結果1,2,3,4より正確な測定の結果、特定の表現型にも上映 5,6。マイクロは、試薬の最小限の量を活用しながら、詳細な実験を実行できる小規模液体条件を提供します。新しいマイクロ流体デバイス設計の一定の生産、アリーナ自然正弦波運動線虫の行動と神経イメージング研究における神経イメージング デバイスをトラップすることができるから、それぞれの使用方法が異なります・高スループットによる遺伝的形質解析画面4,5,6,7は、デバイスへの嗅覚研究。次のマスター型の製作、マイクロ流体デバイスが構築する高価な-マスターの再利用性を与えられる- で使いやすい、高スループット研究を介して迅速なデータを生成することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) などの高分子材料を用いたデバイスの作製時間以内の新しいデバイスを作成できます。
カルシウム イメージング研究は、リアルタイム8,9,10,11にこれらの細胞のダイナミクスを測定するのに遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) ターゲット細胞で発現を使用します。線虫 c. エレガンスの透過的な性質は、生きている動物のこれらの蛋白質の蛍光レベルのレコーディングのためことができます。GECIs が伝統的に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に依存-用いたセンサー GFP カルモジュリン M13 ペプチド (GCaMP) より最近の研究より良い信号対雑音比と赤いシフト励起プロファイルを許可するこれらのセンサーを適応しています。GCaMP6s や GCaMP6f などのセンサーを含む、これらの仕様が付いている蛋白質を変化の次の GCaMP3 の開発 (低速と蛍光をオフ-料金をそれぞれ高速)、RFP カルモジュリン M13 ペプチド (RCaMP)、および赤いシフトがあります。活性化のプロフィール。線虫の細胞特異的遺伝子のプロモータ配列でこれら GECIs の組み合わせ興味、特にニューロン12,13,14,15のセルを対象します。,16。
マイクロ流体研究にc. の elegansの使いやすさを感じ取ることが、ほぼすべての研究が両性具有に焦点を当てた。男性のみは 0.01 0.02 にもかかわらず野生型人口の % は、非常に貴重な所見はその特性から生じる。両性系の物理のコネクトームは何十年も17に完全にマップされている、男性のコネクトームの動物18の頭部領域を中心に、不完全なままです。男性のカルシウム イメージングの使用は男性の神経系と 2 つの男女間の差異の理解を生成するのに役立ちます。線虫 c. エレガンスの成人男性のサイズを小さく大きいの両性具有の設計された伝統的な嗅覚デバイスの読み込みポートで効果的かつ信頼性の高いトラップを防ぎます。これに対処するためヴォックストロット嗅覚チップ19の修正版は開発された狭い読み込みポート、チャネル背の低いと、ワームのロードのポート (動物を回転)、二国間左/右の可視化が可能になります神経のペア。このデザインができます: 若い成人男性の (1) の有効なトラップ、二国間の対ニューロンの両方のメンバーと男性のニューロンの神経活動の (3) の精密な画像処理の可視化のための動物の (2) のより信頼性の高い向き。
ますます、研究は、線虫の男性が様々 な ascarosides (ascr) または線虫フェロモン20,21,22,23 に両性具有とは異なる応答を示す ,24。したがって、ダイナミクスと男性のコネクトーム内表現の理解を深めると、さらにもっと適切ななっています。男性c. の elegans含む両性25,26, に存在しない 87 セックス特定ニューロンとしてのコネクトームを変更-未定方法。これらのユニークなダイナミクスをイメージすることは、私たちはセックス固有の応答と脳内表現を理解しです。
このプロトコルは男性のc. の elegansの神経イメージングのため男性に適応した嗅覚チップの使用を説明しますその。灰は 1 M グリセリン男性、以前の雌雄同体に確実に応答する侵害受容ニューロンの研究27。Ascarosides への暴露は、テストされる動物の大きい数を必要とする動物から動物へ変数を応答を引き出すことがあります。男性固有の CEM ニューロンの応答以前示されている、電気生理学とイメージング研究、カルシウム ascaroside #323に必ず対応します。

<table width="2211">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:219px;">University Wafer</td>
			<td style="width:205px;">452</td>
			<td style="width:1260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 2035</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y111070-0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100-4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wafer Mask</td>
			<td>Cad/Art Services</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">1.0 mm Dermal Punches</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hard Tubing</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking Pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>0.415/0.425&#34; OD x .500 Long</td>
			<td>Batch PB07027</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">30 mL syringes</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used as buffer reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td>
			<td>Component Supply Company</td>
			<td>NE-231PL-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Mercator Control System LF-5 Plasma System</td>
			<td>Mercator</td>
			<td>LF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Scotch Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>BSN43575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 20 Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Vacuum Desicator</td>
			<td>Bel-Art Scienceware</td>
			<td style="width:205px;">420250000</td>
			<td>24 cm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Weigh Boats</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-01017-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Classic Plus Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td style="width:205px;">PB1501-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td style="width:205px;">EW-25554-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">30-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Oven</td>
			<td>Sheldon Manufacturing Inc</td>
			<td style="width:205px;">9120993</td>
			<td>Model Number: 1500E.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td>
			<td>TriTech Research</td>
			<td>T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Zeiss Axio Observer.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td style="width:205px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Blue Fluorescent Light</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td style="width:205px;">SOLA SM6-LCR-SA</td>
			<td>24-30V/7.9A DC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Illumination Adaptor</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:205px;">423302-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td>
			<td>Parker</td>
			<td style="width:205px;">001-0017-900</td>
			<td>3-way valve for controlling flow.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ValveLink8.2&#174;</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:205px;">01-18</td>
			<td>Flow Switch Controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ImageJ</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Apex</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Peptone</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">CaCl2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270741-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Tetramisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">L9756-10(G)</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Fluorescein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">FD2000S-250mg</td>
			<td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:205px;">G6279-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">Ascaroside #3</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">NaCl</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:205px;">18-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9268.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:527px;height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3252-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">ASH GCaMP3 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">CEM GCaMP6 line</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:205px;">-</td>
			<td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:527px;height:21px;">&#34;Reservoir&#34;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:1260px;">To create a Reservoir: A &#34;30 mL syringe&#34;, is connected to a &#34;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&#34;, which is connected to a &#34;3 mL syringe&#34; and a &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34;. The &#34;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&#34; is then inserted into &#34;Soft Tubing&#34; approximately 1/3 of the way down the needle.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

カルシウム指標の使用に神経回路のダイナミクスとその制御の私達の理解が高まります。マップを完全に神経系と透明な解剖学、線虫線虫は、カルシウムの指標を使用してリアルタイムのダイナミクスを理解するための理想的なモデルを示します。マイクロ流体技術や実験のデザインと組み合わせて、これらの指標を用いたカルシウム イメージング研究は自由移動と閉じ込められた動物で実行されます。しかし、ヴォックストロットらで説明されている嗅覚のチップなどの捕集装置を利用した前の調査があるより少なく共通の男性、両方の形態学的および構造的より一般的な両性具有者で使用するために設計されたデバイス異種。適応嗅覚チップを設計、若い大人動物を用いた男性神経イメージングにおける効率性の向上のために作製します。ターンは、動物を回転し、2 D イメージングで二国間ペア内で個々 のニューロンの分離を可能にするポートをロード ワームに組み込まれました。ワームは、以前両性研究に従ってマイクロ流体デバイス内での匂いの流れを制御する公開されます。カルシウム濃度は ImageJ のオープン ソース ソフトウェアを使用して分析しています。男性ベースのc. の elegansの量の増加対応記載手順必要がありますカルシウム イメージング研究、セックスに固有の神経信号のメカニズムの私達の理解を深めます。

全体的なデバイスの設定の例は、図 1 aBで見ることができます。図 1 aは、適切な貯水池建設とセットアップを示しています。図 1 bは、マイクロ流体デバイスに貯水池の接続を示しています。図 1は、個々 のポートをわかりやすくするためのラベル付きのマイクロ流体デバイスを示しています。
男性に適応したマイクロ流体デバイスの設計に読み込みポートのカーブが含まれているが、流動、ヴォックストロットによって設計されたデバイスと同じら19(図 2 a-2 C)。どのフロー コントロール バルブが開いて変更することにより、バッファーの流れを制御できます (図 2 a-2B)。作製されたデバイスの測定は、設計されたファイルによって異なります。図 2は、測定は、「として偽造された」の測定です。
男性に適応した嗅覚デバイスの配置と向きと同様、チャネル流ダイナミクスに男性のc. の elegansをロードした後、明視野と蛍光イメージングを通じて検証できること (図 2 D-2E)。1 M グリセリンに侵害受容ニューロン、灰で GCaMP3 を表現するワームの露出は目に見える変化で結果灰のニューロンは、神経活動 (図 2 f) を示す蛍光に.蛍光の微妙な変化を目では表示できない場合がありますが、これらの変化を定量化するソフトウェアを使用することができます。分析 (図 2 f) 時間をかけて 1 M グリセロールへの露出に灰ニューロンの蛍光強度を定量化し、ImageJ フリーソフトを使用できます。これは両性具有27と、グリセロールの神経応答を灰の堅牢性のために観察されるものと同様です、これはテストのすべての動物で観察されます。
軸方向または回転運動の少量は、しばしばビデオ解析 (図 3 a) の間にニューロンの追跡アルゴリズムを施行した unparalyzed の動物の予定です。バッファー (例えば、 1 mM tetramisole) で麻痺の追加は、いくつかの動物 (~ 10%) はまだ試験中に移動がほぼこの効果を排除します。これによって回避されることができます: (a) はより効率的に閉じ込められている; 古い男性を使用して(b) 幅またはさらにポートをロード ワームの厚さを減少させます。または、(c) どちらか使用される麻痺または別中風の人を使用して濃度が増加します。これがまたあることを確認しないトラップの末尾の頭と臭気チャネルにさらされるはあまりにも多く。ワームの動きとトライアルが発生すると、解析部を移動し、動き (図 3 b) が実行されるフレームから始まる新しい神経の場所から再読み込みすることができます。このインスタンスでユーザーによる神経トレースの手動再構築が必要です。スクリプト、ニューロン内の蛍光の変化を分析することおよび19を書き込むこともできますを移動するニューロンのセンターに従うこと。
男性のc. の elegans 234 セックス固有 CEM ニューロンを介して ascarosides と呼ばれる魅力的な生体フェロモンを感じる。男性でカルシウム濃度を観測すると、応答は、形、記号、およびニューロンと動物 (図 4 aB) の両方の間の大きさの変数です。しかし、フェロモンへの男性の応答は多くの動物 (図 4) カルシウム過渡現象として確実に認められなかった。これは、ほとんど ascarosides を行う感覚13,14,15時にカルシウムの過渡現象を引き出すないと落胆するではありません。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig3.jpg"> 
図 3: イメージ取得期間中にアドレスのワーム動き。(A) ΔF/F0 (最初 1 の平均バック グラウンド蛍光強度で割った蛍光強度の変化買収の s) 興味のニューロンは確実に 1 の静的な領域を定義することで ImageJ で算出しました s です。刺激パルス (青い部分) の間に動物が移動すると、カルシウム トレース上の画像に見られるように結果としてもはや分析領域 (黄色のボックス) に含まれるニューロン。スケール バーを示す 42 μ m. 破線表示各イメージでワームの場所に対応するトレースの地域。(B) 解析の領域は、試用期間中に次のニューロンに移動し、個々 のトレースが実際のダイナミクスを伝えるために再構築される場合、トレースは、動物が移動しなかった場合に表示されます。破線は、ワームの動きに修正されたトレースの領域を表示します。両方灰ニューロン、左と右のトレース (ASHR (ブルー)、ASHL (赤) それぞれ) が表示されます。Y は、ΔF/F0を表示します。スケール バーを示します 5 s.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig4.jpg"> 
図 4: 男性線虫CEM 1 μ M ascr #3 への応答は可変です。男性固有の CEM 細胞生体フェロモン応答の独自のパターンを表示します。(A) 各 CEM ニューロンと、1 つのパルスで 1 つの応答性の高い動物にみられる応答が表示されます。4 つの CEM ニューロンがあります: 腹側左 (CEM VL) 腹側右 (CEM VR)、背側左 (CEM DL) 背右 (CEM DR)。3 つ 4 つのニューロンは、4 番目に応答していない、ascaroside でのさまざまな形や大きさ、したりで応答します。(B) 約 3 分の 1 (本研究では 2/7 テスト) トラップの動物のイメージを作成することができる唯一の 3 つのニューロンの結果。この向きでワームの応答は、最初のワームで観察されたものより異なっていた CEM カルシウム トランジェントで起因しました。CEM DR が両方の向きで表示されると動物の間の変数の応答を展示として、これはワームの方向を変更したためでした。(C) 多くのワームがない (本研究では 5/7 テスト) 任意の検出可能なカルシウム トランジェントで応答します。示されている個々 のトレース、プロット上の画像に示すように単一動物の代表です。、スケール バーを示す 42 μ m トレース: 青色の領域は、1 μ M ascr #3 露出の時間を示します。赤の痕跡を示す脱分極応答。黒のトレースを示す観測応答ありません。Y は、ΔF/F0を表示します。スケール バーを示します 5 s.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56026/56026fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.0K ビュー.  Worcester Polytechnic Institute. 線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。

ビデオ: Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

神経科学

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

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