Estamos gratos à Fundação Boettcher e a associação de esclerose Lateral amiotrófica (#17-II-344) pelo apoio da pesquisa.

todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê de uso e Universidade do Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care (91813(05)1D).
 1. dia 1: primária (1°) imunocoloração com bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) <ol><li>ar seco seções congeladas do músculo do membro posterior de rato (por exemplo, tibial anterior, sóleo) montagem em slides carregados para ~ 30 min 11. desenhar uma borda ao redor as seções usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta.</li>
	<li>Lugar ~ 250 µ l de soro de 5% BSA/tampão de fosfato (BSA/PBS) em cada slide para bloquear a ligação do anticorpo específico. Incubar em temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Enquanto bloqueia, 01:50 de preparar diluições do anticorpo 1 ° sobrenadante em 5% BSA/PBS (todos são anticorpos monoclonais de rato, ver tabela 1 6 , 12); preparar 250 µ l de solução por slide. Manter estoques de anticorpo de 1° e diluições na Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabela 1: os anticorpos primários usados para distinguir MyHCs.
<ol start="4"> <li>após a aspiração da solução bloqueio 5% BSA/PBS, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 1° para os slides adequados. Adicionar 250 µ l de 5% BSA/PBS para controlo de negativo somente anticorpo secundário (2°) slides.</li>
	<li>Incubar a 4 ° C por 24-48 h em um ambiente úmido. 
	Nota: Um prato de Petri coberto com folha de alumínio com papel de filtro umedecido pode servir como uma câmara de incubação adequado.</li>
</ol> 2. Dia 2:2 ° imunocoloração com anticorpos fluorescentes <ol><li>aspirar solução de anticorpo 1° ou 5% BSA/PBS solução de controle. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA.</li>
	<li>Durante a lavagem, preparar diluições de 1: 200 dos anticorpos purificado, fluoróforo conjugado 2 ° em 5% BSA/PBS (ver tabela 2, todos são anti-rato cabra). Prepare 250 µ l de solução por slide. Manter anticorpos fluoróforo conjugado de 2° às escuras na Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabela 2: anticorpos secundarios conjugados fluoróforo usado para visualizar de primária do anticorpo reconhecimento do MyHCs.
<ol start="3"> <li>após aspiração da terceira aplicação da solução a 5% BSA/PBS bloqueio, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 2° a todos os slides. Incubar durante 90 min à temperatura ambiente em um ambiente escuro, úmido.</li>
	<li>Solução de anticorpo 2° aspirado. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Lavagem com PBS. Seca durante 10 min.</li>
	<li>Montar a lamela com um meio de não-permanentes, baixa viscosidade montagem aquoso.</li>
	<li>Quando seco, selar as bordas de slide com as unhas pintadas. Secar e armazenar em um escuro slidebox.</li>
</ol> 3. Slides com microscopia de epifluorescência de imagem <ol><li>limpar os slides com uma pequena, 70% etanol-embebido laboratório-limpeza.</li>
	<li>Obter imagens digitais das seções de músculo immunostained usando um microscópio de epifluorescência, equipado com um aparelho fotográfico (consulte a Tabela de materiais).
	<ol><li>Selecione uma área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, at 1.4).</li>
		Filtro de passa-tempo <li>Vista fluorescência de anticorpos conjugados a Alexa 488 2° através de um 505 nm. Ver os a fluorescência gerada pela excitação dos anticorpos conjugados a Alexa 594 2° através de um filtro de passa-tempo 595 nm. Digitalize imagens com um computador PC equipado com um software de imagem compatível. Incluem a barra de escala da imaging software para análise posterior.</li>
	</ol></li></ol> 4. Análise de imagens com Fiji Nota: antes de prosseguir com a análise, Fiji (disponível livremente o National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve ser instalado através de https://imagej.net/Fiji/Downloads. Além disso, a macro usada neste processo é fornecida no Arquivo suplementar. Coloque o arquivo de macro em um diretório acessível.
<ol><li>Carga brightfield uma imagem de uma seção selecionada em Fiji. Navegue até Plugins &#8594; segmentação &#8594; segmentação Weka Trainable.</li>
	<li>a fim de estipular as áreas celulares da seção, desenhar uma linha em uma fibra e clique em &#34; adicionar a classe 1 &#34;. Em seguida, desenhe uma linha no espaço entre as fibras e clique &#34; adicionar a classe 2 &#34; para marcar os domínios extracelulares. Repita até que há 5-10 etiquetas em cada classe.
	Classificador de trem clique <ol><li>. Sobre a sobreposição resultante de vermelha e verde, adicionar rótulos mais manualmente (consulte a etapa 4.2) incorretamente segmentado pedaços da imagem, se necessário. Repita até fibras (vermelho) são separadas adequadamente o espaço entre as fibras (verde).</li>
	</ol></li> <li>Clique &#34; probabilidade de obter &#34; e salvar a imagem em uma pasta recém rotulada.</li>
	<li>Repita o procedimento acima (passos 4.2-4.3) com a imagem fluorescente tirada do mesmo campo. Rotular as fibras immunostained como &#34; classe 1 &#34; e todas as regiões não-fluorescente como &#34; classe 2 &#34;. Salvar o mapa resultante de probabilidade para a mesma pasta onde a imagem processada brightfield é armazenada.</li>
	<li>Abrir um dos mapas probabilidade salvo anteriormente em Fiji. Desenhe uma linha reta na barra de escala fornecida pelo software da imagem latente. Vá para analisar &#8594; definir escala. Altere os parâmetros (ou seja, distância conhecida, unidade de comprimento) para seus valores apropriados como determinado pela barra de escala e, em seguida, verificar o &#34; Global &#34; caixa para padronizar a escala para cada imagem.</li>
	<li>Navegar para Plugins &#8594; Macros &#8594; executar &#8594; Tyagi et al fibra quantificação macro.ijm (consulte o Arquivo suplementar). Imediatamente, um painel de navegação irá aparecer. Abra a imagem &#39; pasta do host s; uma caixa de diálogo será exibida. Para cada caixa de diálogo, alterar o &#34; fundo &#34; valor de lista suspensa para &#34; luz. &#34; Nota: A pasta agora será preenchida com imagens dos contornos da fibra e arquivos de software de planilha dos resultados (diâmetro CSA e Ferrari são mais pertinentes ao quantificar a morfologia das fibras; parâmetros medidos podem ser ajustados em analisar medidas de conjunto). Dados de morfologia de fibra gerados pela função dos poros-análise de Fiji serão automaticamente transferidos para arquivos de software de planilha para ambas as imagens fluorescentes e brilhante campo.</li>
	<li>Calcular a fração de fibras expressando um determinado MyHC em um campo, dividindo o número de fibras fluorescentes no campo com o número de fibras totais na imagem correspondente campo claro.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

Os autores têm sem interesses conflitantes para divulgar.

Aqui, nós fornecemos orientação útil para a identificação dos tipos de fibra de músculo esquelético. Ao fazê-lo, descrevemos um novo algoritmo para análise dos dados.
Desde que nossos resultados, em grande parte, confirmam os anteriores relatórios5,8,10 e refletem nossa própria medição manual, o algoritmo aparece ser exato. Ainda, encontramos algumas armadilhas experimentais infrequentes, incluindo bordas claras fibra resultantes de artefato de seccionamento. O impacto desses artefatos pode ser minimizado através de seccionamento cuidadoso e atento exame da seção processada antes da análise. Em particular, menos-do que-ideal segmentação de imagem pode ser contornada através de várias rodadas de reclassificação na mesma imagem para alcançar o contraste mais nítida.
A etapa mais crucial em nosso protocolo é um passo 4.2 em que estipulamos as áreas celulares e extracelulares da seção por desenhar uma linha em uma determinada fibra, distinguindo, assim, uma área de "classe 2" ou "classe 1". Obviamente, esta distinção manual é crítica porque determina os limites das fibras musculares; um erro nesta etapa afetará negativamente a avaliação das dimensões da fibra.
Neste estudo, nós sondou seções para apenas um MyHC em uma determinada seção serial. No entanto, algumas fibras, como fibras de híbrido, expressam dois tipos de MyHC, indicativo de sobreposição de perfis metabólicos/funcional (por exemplo, tipo IIX e IIB). Assim, as frações de fibra-tipo resumidas-se a um valor &#62; 1 para o sóleo e tibial anterior(Figura 4). Fibras de híbrido podem ser identificadas com duplo-, ou até mesmo triplo-, rotulagem protocolos como os descritos por Lee et al 7e Bloemberg e Quadrilatero5, respectivamente. Importante, o nosso método de análise pode ser aplicado a esses protocolos de coloração mais complexos. Outra limitação do nosso protocolo é que não é totalmente automático; no entanto, acreditamos que esta pequena concessão garante que nosso método não compromete a rigor por causa da velocidade.
Enquanto as composições MyHC de tanto sóleo e tibial anteriores músculos observados neste estudo refletem os resultados de estudos anteriores5,6,7,10,14 , há alguns contrastes com estudos anteriores sobre a avaliação do CSA. Por exemplo, nossas medições de CSA média são um pouco menores do que aqueles relatados por qualquer Bloemberg e Quadrilatero5 e Allen et al. 15 em particular, nossas medições de CSA variaram de 539.86 ± 24.44 µm2 a 1319.50 ± 57.47 µm2 através de tipos de fibra enquanto deles durou aproximadamente 735.7 ± 31,2 µm2 para 3073.8 ± 51.3 µm2. No entanto, os nossos valores mais se assemelham às observadas por Augusto et al . 13 e Lucas et al 6 que relataram CSAs médias variando de 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 e 815 ± 221 µm2 a 1904 ± 570 µm2, respectivamente. Assim, uma variabilidade na análise morfométrica das fibras do membro posterior do mouse existe em toda a literatura.
Imuno-histoquímica apresenta uma maneira eficiente para rotular e classificar as fibras musculares, com base no seu teor de MyHC. Quantificação precisa das experiências de imuno-histoquímica é essencial para fazer conclusões significativas sobre os dados; para este fim, um método que pode automatizar as partes tediosas de análise é útil, especialmente quando centenas ou mesmo milhares, de fibras precisam ser medidos e classificados. Além de fornecer medições semelhantes às observações manuais, nosso algoritmo fornece uma avaliação rigorosa destes dados sem preconceito; Esta vantagem sobre medição manual garante rigor científico. A este respeito, a nossa metodologia pode ser útil na caracterização dos efeitos de manipulações genéticas e experimentais que afetam a integridade do músculo. Especificamente, juntamente com o nosso método de rápida análise imuno-histoquímica de MyHC pode ser empregada para avaliar as alterações morfológicas e metabólicas no músculo dos modelos de doenças como as distrofias musculares, caquexia ALS e câncer. Além disso, a eficácia das intervenções que impedem a atrofia ou hipertrofia de causar também poderão ser avaliada.

-Já há algum tempo que o músculo esquelético é composto por fibras simples de muitos tipos1. Inicialmente, dois grupos de fibras foram caracterizados com base em suas propriedades contráteis e chamado, apropriadamente, contração lenta (tipo I) e contração rápida (tipo II). Estas categorias eram ainda mais diferenciadas com base no metabolismo de fibra. Desde tipo I fibras são ricas em mitocôndrias e dependente do metabolismo oxidativo, eles foram elucidados por robustamente positivo dinucleótido de nicotinamida e adenina-tetrazólio redutase (NADH-TR) face2 ou Succinato desidrogenase (SDH)3 a coloração. Por outro lado, as fibras do tipo II exibiram menor e graus variáveis de NADH-TR face ou SDH manchando e foram divididos em dois subgrupos de contração rápida (tipo IIA e IIB) um pouco grosseira com base na sua capacidade oxidativa relativa. Essas distinções entre fibras tem sido visualizadas mais eficazmente pela miosina-ATPase coloração onde tipo I fibras mancham escuras depois de uma pré-incubação a pH 4.0 e tipo IIB fibras absorvem precipitada seguir pré-incubação com fibras de tipo IIA pH 10,0 coloração intermediària4.
Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino de fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibras podem ser todos identificadas com precisão com base no seu perfil MyHC. Além disso, um outro tipo de rápido-contração muscular metabolicamente intermediário-fibra, tipo IIX, tem sido identificados6. Fibras de híbrido expressar mais do que um MyHC também foram confirmados5,7,8. Algumas espécies como o gato e o babuíno são conhecidos para não expresso tipo IIB MyHCs6. Apesar de imunocoloração MyHC atualmente é a avaliação do estado-da-arte da composição muscular, a análise dos dados obtidos através desta técnica é complicado e demorado sem assistência automatizada. Para este fim, um punhado de métodos semi automatizados para analisar esses dados foram desenvolvidos5,9,10. Aqui, apresentamos um protocolo relativamente padrão para identificação de imuno-histoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, , juntamente com um romance semi-automático algoritmo que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra com precisão.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

Durante anos, distinções entre os tipos de fibra de músculo esquelético foram melhor visualizadas pela coloração de miosina-ATPase. Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino do tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, IIX e tipo IIB fibras agora podem ser identificadas com precisão, com base no seu perfil de MyHC; no entanto, a análise manual desses dados pode ser lento e baixo-direita tedioso. A este respeito, avaliação rápida, exata da composição da fibra-tipo e morfologia é uma ferramenta muito desejável. Aqui, apresentamos um protocolo para coloração imuno-histoquímica estado-da-arte da MyHCs nas seções congeladas obtidas de músculo do membro posterior do mouse em conjunto com um algoritmo semi-automático de romance que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra. Como esperado, o músculo sóleo exibido mancha para tipo I e fibras IIA, mas não para as fibras tipo IIX ou tipo IIB. Por outro lado, o músculo tibial anterior era composto predominantemente de tipo IIX e tipo IIB fibras, uma pequena fração de fibras de tipo IIA e pouco ou nenhum tipo I fibras. Várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade, com a finalidade de medir os diferentes aspectos da morfologia das fibras (ou seja, área da seção transversal (CSA), diâmetro de Feret máxima e mínima). Os valores obtidos para estes parâmetros foram então comparados com os valores obtidos manualmente. Não há diferenças significativas foram observadas entre o modo de análise em relação ao CSA, diâmetro de Feret máximo ou mínimo (todos os p &#62; 0,05), indicando a precisão do nosso método. Assim, nosso protocolo de análise de imunocoloração pode ser aplicado para a investigação dos efeitos na composição muscular em muitos modelos de envelhecimento e miopatia.

Músculos do membro posterior (ou seja, tibial anterior, sóleo) dissecados de um rato masculino de C57BL/6 de idade desconhecida foram flash congelado pelo afundamento de um molde de plástico que contém o músculo em OCT composto em isopentano arrefecido a nitrogênio líquido. Em seguida, usando um cryotome, 8-10 µm serial seções foram cortadas a-20 ° C e transferidas para lâminas de vidro carregado positivamente diferentes12.
Nós escolhemos o tibial anterior e sóleo porque estes músculos são compostos predominantemente de fibras de contração rápida e lenta, respectivamente13,14. Após a coloração para cada tipo I, IIA, IIX e MyHCs IIB, imuno-histoquímica brightfield e fluorescentes imagens foram capturadas. Os painéis à esquerda da Figura 1 mostram as seções de um immunostained do músculo sóleo com o tipo I, IIA, IIB MyHC específicas e IIX anticorpos listados na tabela 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig1.jpg"> 
Figura 1 : Coloração imuno-histoquímica de MyHC tipo I, IIA, IIX e IIB no músculo sóleo de rato. Painéis esquerdos mostram imagens fluorescentes obtidas de seções de um músculo sóleo de rato sondado com anticorpos primários, direcionados para o tipo I (BA-F8; A), tipo II (SC-71; B), tipo IIX (6 H 1; C) e tipo IIB (BF-F3; D) MyHCs. Certo painéis mostram as seções em que o anticorpo primário usado no experimento descrito no painel da esquerda correspondente foi omitido. Bares = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Especificamente, observamos substanciais frações de fibras expressando tipo I (Figura 1A, à esquerda) e tipo IIA MyHCs (Figura 1B, à esquerda) com uma quantidade razoável das restantes fibras exibindo coloração positiva para tipo IIX MyHCs (Figura 1C, à esquerda). Por outro lado, praticamente sem fibras IIB do tipo foram evidentes (Figura 1D, à esquerda). Essas observações são consistentes com os relatórios anteriores que músculos sóleo são compostos principalmente de tipo I, tipo IIA e tipo fibras IIX (nem tanto) com quase nenhum tipo IIB fibras5,10,12. Importante, nenhuma mancha foi observada nas seções em que o anticorpo primário tinha sido omitido o protocolo, demonstrando a especificidade dos anticorpos (Figura 1A-D, painéis certo).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig2.jpg"> 
Figura 2 : Coloração imuno-histoquímica de MyHC tipo IIB, IIX, IIA e eu no músculo tibial anterior de rato. Painéis esquerdos mostram imagens fluorescentes obtidas de seções de um rato músculo tibial anterior sondado com anticorpos primários direcionados para tipo IIB (A), tipo IIX (B), tipo II (C) e tipo I (D) MyHCs. Certo painéis mostram as seções em que o anticorpo primário usado no experimento descrito no painel a esquerda adjacente foi omitido. Bares = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Nós também manchado tibial anterior músculos com os anticorpos acima mencionados. Tibial anteriores músculos foram compostos principalmente de tipo IIB e tipo IIX MyHC-positivo fibras (Figura 2A-B, deixada painéis) com contribuições menores de fibras expressando tipo IIA MyHCs (Figura 2C, à esquerda); praticamente não há fibras expressando tipo eu MyHC foram observados (Figura 2D, à esquerda). Nossos dados indicando que o rato tibial anterior é composta predominantemente de rápida contração muscular tipo IIA, tipo IIB e tipo IIX fibras são consistentes com estudos anteriores5,10,13. Novamente, nenhuma mancha foi observada nas seções em que o anticorpo primário tinha sido omitido o protocolo(Figura 2A-D, painéis certo).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig3.jpg"> 
Figura 3 : Segmentação de fibra computadorizado iterada. Brightfield imagem de uma seção anterior do tibial (A) do rato. Transformação da mesma imagem usando nosso algoritmo semi-automático (B). Imagem fluorescente de mesma seção mostrando immunostaining do tipo IIA MyHC (C). Imagem de transformação mostrando único tipo IIA MyHC-expressando fibras (D). Bares = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para efeitos de Análise morfométrica, brightfield imagens dos campos de immunostained também foram obtidas. O exemplo mostrado na Figura 3A é de uma seção de músculo anterior tibial sondada com SC-71 anticorpos dirigidos ao tipo IIA MyHCs13. Usando nosso algoritmo semi-automático original, várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade a partir das imagens de brightfield. Uma transformação de imagem típica derivada da imagem brightfield mostrada na Figura 3 é apresentada na Figura 3B. Usando a transformação e a função de análise de poro de Fiji, medimos o CSA médio (± 891.4 45,0 µm2), máximo (46,9 ± 1,3 µm) e mínimo (26,0 ± 0,8 µm) significa Feret diâmetros de cada fibra no campo. Para testar a fidelidade de nossas medições, também avaliamos esses parâmetros na imagem brightfield manualmente. O mau CSA (867.0 ± 52,0 µm2), máximo (45,7 ± 3,5 µm) e mínimo (25,6 ± 1,9 µm) quer dizer Ferrari diâmetros obtidos usando o método de aquisição manual mais tedioso não foram significativamente diferentes do método semi-automático (todos os p &#62; 0,05, unpaired t-testes; Tabela 3).
<img alt="Table 3" src alt="Table 3"></img alt="Table 3" src>= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / > 
Tabela 3: morfologia das fibras e a composição do tibial anterior músculo immunostained para tipo I, IIA, IIB e IIX MyHCs conforme determinado pelo manuais e semi-automática de métodos analíticos. Quer dizer fibra CSA, significa Feret diâmetros e tipo de MyHC em um rato tibial anterior quantificadas através de avaliação manual tradicional versus o algoritmo apresentado. Por favor, note que frações combinadas excederem um valor de 1 devido à presença de fibras, expressando a mais de um tipo de MyHC.
Figura 3 C mostra uma imagem fluorescente do mesmo campo immunostained com anticorpos dirigidos ao tipo IIA MyHCs. Fibras manchadas de forma positiva no campo foram selecionadas por número (Figura 3-D) e usadas para determinar a fração de fibras do tipo IIA MyHC-expressando dividindo pelo número total de fibras no campo brightfield de transformação (tabela 3 ). A média CSA, máximo e mínimo Feret diâmetros de fibras de tipo IIA foram então avaliados (tabela 3). A proporção de tipo eu, as fibras tipo IIX e tipo IIB, bem como as suas dimensões, foram determinados, repetindo este protocolo em seções serial immunostained com BA-F8, 6h 1 e anticorpos BF-F3, respectivamente,6,12(tabela 4 ; Figura 4 A-D).
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56024/56024table4.jpg"> 
Tabela 4: MyHC conteúdo e morfologia no sóleo rato e tibial anterior. Composições de tipo de fibra de seções representativas do sóleo e tibial anterior. Quantificação da CSA média, Ferrari e diâmetros mínimos e máximas de tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB do sóleo e tibial anterior são mostrados. Dados são dadas como mau ±SEM.
Também avaliamos esses parâmetros em um campo obtidos a partir do músculo sóleo (tabela 4; Figura 4 A-D). 3.052 e 2.876 fibras individuais foram contadas para o tibial anterior e músculos sóleo, respectivamente. Tomados em conjunto, estes dados demonstram a viabilidade do nosso método na análise do tipo de fibra e morfométricos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig4.jpg"> 
Figura 4 : Resumo de dados de Análise morfométrica. Composições de fibra-tipo de seções representativas do tibial anterior e músculos sóleo (A). Quantificação da média CSA, minimimal e diâmetros de Feret máximas de tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB cinco no sóleo e tibial anteriort é mostrados em (B-D). Dados são dadas como dizer ±SEM. diferenças significativas entre o tibial anterior e sóleo são indicados (* denota p &#60; 0.05: * * denota p &#60; 0,01; * * * denota p &#60; 0.005; teste-t). 3.052 e 2.876 fibras individuais foram contadas para o tibial anterior e músculos sóleo, respectivamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental File" src="/files/ftp_upload/56024/56024supfile.jpg"> 
Arquivo suplementar: macro de quantificação de fibra. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/Tyagi_etal_fiber_quantification_macro" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K visualizações.  University of Colorado School of Medicine. Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Medicina

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Avaliação da Estrutura e Função do Ventrículo Direito em modelo de camundongo Pulmonary Artery constrição por Ecocardiografia transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimentos de biópsia de músculo esquelético humano, utilizando a técnica Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitativa Ressonância Magnética da doença do músculo esquelético

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto lateral</em&gt; Biópsia de músculo esquelético Usando o Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Indução e Avaliação da Exertional lesão muscular esquelético em humanos

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composição corporal e análise de enjaulamento metabólico em ratos de alta gordura Fed

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...