Financiado em parte pela concessão de NIH RO1AI015503. Ratos infectados esquistossomíase foram fornecidos pela esquistossomose NIAID Resource Center, no Instituto de pesquisas biomédicas (Rockville, MD) através de HHSN272201000005I de contrato NIAID-NIH para distribuição por meio de recursos do BEI.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Wisconsin-Madison, sob protocolo e cuidados institucionais de Animal nenhum. V005717. O seguinte protocolo envolve o trabalho em uma instituição de nível de biossegurança 2 (BSL2) para patógenos humanos, apesar de nenhum dos estágios esquistossomíase retratados no presente protocolo são infectantes aos seres humanos ou outros mamíferos. Segui as políticas institucionais para a manipulação de agentes patogénicos humanos risco grupo 2 (RG2).
Nota: Nós usamos ratos fêmeas Swiss-Webster (6 - semanas de idade) devido à sua maior susceptibilidade à infecção10, desse modo, produzindo fardos de ovo maiores. Tucker et al descrevem os protocolos de infecção mouse e caracol usados neste modelo sistema11. A Tabela de materiais lista todos os equipamentos específicos, materiais, reagentes e animais fontes necessárias para realizar este protocolo experimental.
1. processamento de fígados infectados
<ol><li>Eutanásia em ratos, pós-infecção 6-7 semanas, por asfixia de CO2 (taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto). Monitor de ratos para cessação da respiração e batimento cardíaco. Nota: Normalmente, até 20 ratos podem ser transformados em um determinado momento.</li>
	<li>Após a transferência de ratos sacrificados para uma armário de biossegurança, coloque os ratos em suas costas e pulverizar suas superfícies ventrais com etanol a 70%. Deixe de molho por 1 min.</li>
	<li>Beliscar e puxar a pele do abdômen inferior e corte em toda a base da pele comprimida mais próximo ao abdômen com uma tesoura cirúrgica estéril. Puxe a pele cortada anteriormente (ou seja, em direção a cabeça) para revelar o fígado. Observe que o fígado deve ser ampliado e salpicado devido a uma reação granulomatosa induzida por ovo (Figura 2A).</li>
	<li>Remover o fígado e coloque-o em um béquer contendo 200 mL de estéril 1,2% NaCl solução contendo caneta/estreptococos.</li>
	<li>Repita as etapas de 1.3 e 1.4 com ratos restantes. Nota: Vinte ratos geralmente são processados em uma única colheita.</li>
	<li>Coloque os fígados em uma placa de Petri estéril e remover não-fígado gordo/conjuntivo tecidos com Pinças esterilizadas.</li>
	<li>Transferi aparadas/limpa fígados para uma garrafa de centrífuga estéril de 250 mL contendo ~ 200 mL de solução de NaCl de 1,2% estéril com caneta/estreptococos.</li>
	<li>Vigorosamente agitar o frasco que contém os fígados e, usando uma pipeta descartável estéril, remover a excesso superfície espuma/flutuante de detritos. Lentamente, despeje o restante da solução salina em um recipiente ou afundar contendo 1% de cloro (desinfectante).</li>
	<li>Adicionar ~ 200 mL de solução salina fresca para os fígados e repita o passo 1.8 mais três vezes.</li>
</ol>2. fígado isolamento de extração e miracidial
<ol><li>Coloque os fígados em um copo pequeno estéril aço inoxidável liquidificador e adicionar ~ 2 mL da solução de NaCl de 1,2% (Figura 2B).</li>
	<li>Cubra o copo com papel alumínio e uma placa de Petri para evitar derramamentos e misturar por 1 min, alternando-se baixa e alta velocidade (20 s baixa velocidade/10 s alta velocidade; repetir) (Figura 2).</li>
	<li>Distribua uniformemente a suspensão de fígado misturada em frascos estéreis 250 mL centrífuga (para 20 fígados usam 4 garrafas).</li>
	<li>Adicione uma solução salina estéril com antibióticos para o volume total de ~ 200 mL/frasco. Peso/equilíbrio garrafas antes da centrifugação.</li>
	<li>Centrífuga de fígados misturados a 290 x g durante 15 min em 4 óC. delicadamente despeje sobrenadantes em um recipiente com água sanitária antes de serem eliminados.</li>
	<li>Repita os passos de 2.4-2.5 uma vez. Certifique-se de completamente Ressuspender o sedimento fígado antes da centrifugação.</li>
	<li>Após descartar a última solução salina lavar (passo 2.6), adicionar 200 mL de água estéril lagoa com caneta/estreptococo no tecido hepático peletizadas, shake para Ressuspender o sedimento e a suspensão de transferência para um balão aferido de 1L esterilizado que foi completamente coberto com alumínio folha, exceto a parte superior do pescoço (Figura 2D) de 3 cm. Nota: Use duas garrafas (= 10 fígados) por balão 1-L. Água da lagoa simula o ambiente de água doce natural necessário para estimular o miracidial para incubação de ovos.</li>
	<li>Usando a água da lagoa estéril, encha o balão para cerca de 3 cm acima da folha cobrindo no pescoço. Então, sem demora (como miracidia logo começam a eclodir), retire a espuma residual e flutuando na superfície, pipetando rapidamente até ~ 12 mL de água da lagoa contendo os restos de tecido hepático e descartá-lo em um separado descartar o tubo. Substitua por água fresca lagoa estéril.</li>
	<li>Repita a limpeza passo 2.8, mais três vezes, verificando a presença de miracidia no tubo de descarte. Cesse a repetição da etapa de limpeza se miracidia aparece na solução de lavagem.</li>
	<li>Após a última lavagem, adicione lentamente ~ 12 mL de água da lagoa estéril quente (pré aquecida a 30 oC) para criar um gradiente de temperatura com água morna limpa e esterilizada por cima. Nota: Isto é realizado melhor por descarregando lentamente a água ao longo da lateral do pescoço do frasco para evitar a mistura.</li>
	<li>Coloque uma pequeno prato de Petri de capa sobre a abertura do frasco e brilhar uma luz brilhante na parte superior do balão acima a capa da folha para iluminar a superfície superior da água. Nota: Normalmente, dentro de 5-10 min, natação miracidia, atraído pela luz, irá se concentrar em grandes números dentro o primeiros 2-3 cm de água da lagoa (Figura 3A).</li>
</ol>3. Miracidial colheita e cultivo
<ol><li>Quando miracidia reuniram-se na superfície após 10min, usando uma pipeta de transferência estéril, remova ~ 8 mL de água da lagoa e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloca o tubo contendo miracidia no gelo.</li>
	<li>Adicionar fundo 8 mL de água estéril quente ao longo do interior do balão volumétrico e esperar mais 10 minutos.</li>
	<li>Usando novos tubos de cada vez, repita as etapas de 3.1 e 3.2 mais três vezes. Após a coleta deth 4, mantenha o tubo final no gelo durante 10 minutos permitir que o miracidia resolver. Este conjunto de tubos compreende a primeira colheita.</li>
	<li>Tubos de centrífuga contendo miracidia a 290 x g por 1 min em 4 óC numa centrifugadora refrigerada pre-cooled.</li>
	<li>Imediatamente remova a maior parte do sobrenadante (~ 7 mL), tomando cuidado para não perturbar a pelota de parasita (Figura 3B).</li>
	<li>Piscina toda a miracidia desta primeira colheita em um tubo, então Lave todos os tubos originais com água da lagoa estéril ~ 1 mL e adicionar ao tubo de "pool".</li>
	<li>Permitir que os parasitas que se contentar em gelo ~ 5 min e centrifugue novamente os parasitas a 290 x g por 1 min em 4 oC.</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e adicionar que 6-8 mL estéril Chernin balanceamento de solução salina (CBSS +; ver tabela de materiais) contendo caneta/estreptococos.</li>
	<li>Suspenda suavemente o miracidia e alíquota-los em uma placa de cultura de 24 poços (1 mL por bem), seguido de lavagem do tubo em 6-8 mL CBSS + e adicionar 1 mL de lavagem a cada poço. Incube os parasitas em 26 oC sob condições normoxic. Concentrações de miracidia isolado irão variar, mas geralmente média ~ 7000/mL.</li>
	<li>Se parasitas ainda estão se concentrando na fonte luminosa, repita os passos 3.1 a 3.9 para continuar a colheita final-incubação miracidia mas aumentar o intervalo de tempo entre coleções de 15-20 min. Nota: Este novo conjunto de tubos representa a segunda colheita. No entanto, porque os números de miracidial normalmente são baixos, as larvas de todos os tubos normalmente são agrupadas em uma única cultura bem contendo 2 mL CBSS +.</li>
	<li>Em 24h pós-colheita e cultivo, Ressuspender delicadamente sporocysts em seus poços pipetando.</li>
	<li>Espere alguns minutos para permitir que os parasitas resolver no fundo dos poços. Uma vez que eles se instalaram, remova cuidadosamente o sobrenadante (~1.5 mL), que irá conter a maioria das placas ciliadas epidérmicas derramadas por miracidia durante transformação larval. Essa "transformação" sobrenadante pode ser descartada ou incorporada em estudos de seguimento de produtos secretoras larvas.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de CBSS fresco + para cada bem e delicadamente pipeta para Ressuspender sporocysts. Repita a etapa 3.12 se desejar ainda mais lavagem ou mudar para um meio diferente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+(trematode)+Schistosoma+mansoni:+a+2009+assessment.">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li><li>Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+Biomphalaria-trematode+interactions.">Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions.</a> Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).</li><li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites:+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade.">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li><li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival.">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li><li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+schistosome+dermatitis.+IX.+The+life+cycles+of+three+dermatitis-producing+schistosomes+from+birds+and+a+discussion+of+the+subfamily+Bilharziellinae+(Trematoda:+Schistosomatidae).">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li><li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts.">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li><li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+mortality,+pathophysiology,+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice.">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li><li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li><li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni:+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation.">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li><li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni:+their+occurrence+and+cultivation.">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li><li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata.">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li><li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts.">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li><li>Hansen, E. L., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+line+from+embryos+of+Biomphalaria+glabrata+(Pulmonata):+Establishment+and+characteristics.">A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics.</a> Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).</li><li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li><li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni.">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li><li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscan+cells+in+culture:+primary+cell+cultures+and+cell+lines.">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li><li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flukes+without+snails:+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes.">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li><li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules.">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae.">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espaço BSL2, é altamente recomendada. Além disso, lavar todas as soluções usadas no processamento de fígados e isolamento de larvas devem ser tratadas com desinfetante (por exemplo, 1% de alvejante) antes do descarte.
Deve notar-se que infectados de remoção cirúrgica de fígados de ratos e seu posterior processamento antes da mistura/homogeneização são executadas em uma câmara de segurança biológica (CSB) sob condições assépticas. No entanto, por razões práticas (facilidade de manipular amostras em massa) todos os outros procedimentos são feitos em uma bancada desinfetada utilizando recipientes esterilizados (por exemplo, copos de liquidificador, frascos, garrafas e tubos, pipetas de transferência, etc) e soluções estéreis contendo antibióticos (água salina, lagoa, CBSS). Antibióticos são adicionados a todas as soluções como uma precaução adicional contra contaminação microbiana introduzida. Além disso, durante o isolamento miracidial e colheita passos (protocolo seções 2 e 3), uma pequeno prato de Petri tampa é colocada sobre o balão para minimizar a contaminação externa durante a remoção inicial dos restos de espuma/fígado e subsequente transferência de entrada miracidia concentrada do recipiente para tubos de centrifuga.
Normalmente, Nós colhemos miracidia de 20 fígados de rato infectado em um único lote, do qual estimamos larvas rendimentos de cerca de 5000 larvas por fígado. No entanto, rendimentos podem variar consideravelmente dependendo da intensidade da infecção de ratos individuais, resultando em variação de lotes em recuperações de miracidial. Isolamentos podem ser realizados usando menos fígados de partida, embora o método descrevemos é geralmente aplicáveis para 10-20 fígados. Quando 20 fígados são processados, seguindo o final ressuspensão das pelotas fígadas em água estéril (seção de protocolo 2, passo 2.7), as suspensões devem ser distribuídas igualmente em dois frascos de 1000 mL (2 garrafas/balão). Se 10 fígados ou menos são usados, o original homogenates fígado (protocolo seção 2, passo 2.3) podem ser distribuídos para 2 garrafas e lavado suspensões então transferidas para um balão volumétrico de único para processamento adicional. Uma ou 2 fígados também podem ser processados, mas quantidades (volumes) de extração, lavagem e soluções de incubação devem ser reduzidas proporcionalmente, com final lavado sedimento na água da lagoa sendo transferido para um balão de graduado de 10 mL para folha-cobertas para concentrar-se miracidia.
A fim de maximizar os rendimentos de miracidial com um mínimo de contaminação de detritos de fígado, também é importante realizar lavagens de água da lagoa (protocolo seção 2, passos 2,7-2,9) mais rapidamente e eficientemente quanto possível. Uma vez que os ovos são expostos à água da lagoa, miracidial eclosão ocorre logo depois, embora o tempo antes de aparência larval na fonte de luz no pescoço balão pode variar de 5 a 20 min após a eclosão do início. Para limitar a perda de parasitas durante a limpeza de água de lagoa passos é fundamental verificar visualmente cada água da lagoa lavagem miracidia chegando cedo na camada superior de água do pescoço do frasco. Além disso, uma vez que miracidia são transferidas para tubos de colheita de 15 mL e são colocados no gelo, eles irão cessar a actividade de natação e resolver para o fundo do tubo. No entanto, após a centrifugação de larvas (seção 3, passos 3.4-3.5) de Pelotas, miracidia novamente vai começar a nadar se a água for permitida para aquecer. Portanto, é importante remover a água da lagoa rapidamente, mas sem perturbar o sedimento ou pipetagem até natação parasitas.
Como mencionado anteriormente, rendimentos de miracidia isolado podem variar dependendo do número de pares de verme adulto presentes em ratos individuais (intensidade de infecção) e consistência dos protocolos de infecção inicial. Miracidia são fortemente phototropic e a maioria (80-90%) se concentrará na fonte de luz ao longo do primeiro período de colheita. Os restantes 10-20% de miracidia continuará a chocar e mais lentamente se acumulam durante o segundo período de colheita. Mais (> 95%) miracidia introduziu na cultura e mantida a 26 oC CBSS + médio será ter transformado a principais sporocysts dentro de 24-48 h de cultivo. Neste momento, a viabilidade larval é tipicamente > 90%. Depois de 4 dias em CBSS + viabilidade sozinha cai consideravelmente (70-80%). No entanto, o meio de cultura de CBSS + para completar Bge seguinte de média 24h de comutação cultivo inicial de CBSS resulta em maiores taxas de sobrevivência e crescimento mais robusto. Nós mantemos rotineiramente culturas sporocyst a curto prazo em condições normoxic. No entanto, sporocysts são bastante sensíveis aos níveis de oxigênio e especialmente de espécies reativas de oxigênio que podem infligir dano oxidativo deletérios7. Bayne CJ4 e outros relataram que a saúde geral e a viabilidade do sporocysts em vitro são significativamente melhoradas quando as culturas são mantidas em condições de hipóxicos. Níveis de oxigênio baixou podem ser obtidos por gaseamento (com nitrogênio) frascos closeable individuais, ou por nitrogênio-enriquecimento da fase de gás da incubadora4.
Como citados acima, métodos para isolar axénica e cultivo da esquistossomíase miracidia e sporocysts têm sido descritos anteriormente. Foi reconhecida desde o início que miracidial fototropismo poderia ser usado para atrair e concentrar-se larvas de natação e aquele miracidia isolado poderia ser rapidamente imobilizado em hiper-osmóticos de soluções salinas (entre 120-160 mOs/Kg)8. Além disso, observou-se que manutenção em soluções salinas resultou na transformação da miracidia sporocysts primárias, a primeira fase larval intramolluscan9,12. Meios complexos também foram formulados para oferecer suporte a longo prazo em vitro crescimento e desenvolvimento do S. mansoni sporocyst estágios9,13,14,15, bem como células derivado do host do gênero Biomphalaria glabrata16. Estas formulações incorporaram vários meios de comunicação comerciais e podem ter sido completadas com sais, aminoácidos, lipídios, agentes redutores e açúcares. Formulações de mídia completa também incluem inactivadas pelo calor fetal bovino ou soro de cavalo em diferentes concentrações. Encontramos que esse adequado calor-inactivação (HI) foi crucial para a sobrevivência sporocyst e desenvolvimento a longo prazo em vitro. Achamos que incubação do soro (frascos descongelados, 100 mL) em banho-maria oC 60 por 60 min, com suave mistura a cada 10 minutos para aquecimento uniforme foi mais eficazes. Além disso, geralmente testamos vários lotes do soro de um fornecedor em potencial para compatibilidade de cultura larval. Finalmente, o estabelecimento da linha celular primeiro (e atualmente única) autêntica de cozidos, b. glabrata embrionário (Bge) linhagem celular por Hansen16 foi um grande avanço que significativamente facilitado avanços em larval esquistossomíase esforços de cultivo. Isolado miracidia do S. mansoni , quando colocado em co-cultura com células Bge, desenvolvidas a partir de primário para o secundário e filha sporocysts17e, eventualmente, para a fase final cercarial18,19. Assim, o cultivo contínuo em vitro da fase do ciclo de vida do S. mansoni caracol inteiro foi conseguido. O meio celular Bge usado em nosso sistema de cultura suporta tanto sporocyst crescimento/desenvolvimento e manutenção da linha de celular Bge.
Em resumo, temos descrito e ilustrado visualmente um protocolo detalhado para o isolamento de massa axénica e cultivo da fase miracidial livres de S. mansoni. Estes miracidia, quando sujeitos a condições de cultura apropriado, são capazes de desenvolver a gerações sucessivas sporocyst primário e secundário e, eventualmente, cercárias. Com o desenvolvimento e aperfeiçoamento contínuo das ferramentas disponíveis atualmente para manipular genes e gene expressão em vitro através de transgénicos, interferência do RNA e genoma de edição (por exemplo, CRISPR/Cas9) abordagens, prevê-se que eficiente métodos para isolamento e cultivo de miracidia de diversas espécies de tremátodos20 continuará a ser necessário a fim de adquirir materiais para ainda mais o avanço da investigação neste domínio. Este método complementa muito bem um protocolo descrito anteriormente para isolar e cultivar livres cercárias de S. mansoni para facilitar em vitro transformação para o estágio de mamíferos schistosomula21, para eventual cultivo a ovígeras adulto vermes22.

O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo1. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana2. O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.
Adulto masculino e feminino de S. mansoni verme pares vivem nas veias mesentéricas posteriores de reproduzir o anfitrião dos mamíferos, resultando na liberação de ovos embrionados (óvulos) que se alojaram nas pequenas vênulas da mucosa intestinal. Ovos, em seguida, rompe as paredes dos vasos, migram através do tecido da mucosa e acabaram por inserir o lúmen intestinal onde eles são anulados com as fezes. Quando óvulos digite escotilha de larvas de água doce e livres (miracidia), eles devem, na ordem curta, encontrar um caracol de Biomphalaria apropriado para infectar a fim de continuar seu ciclo de vida. Esse processo de infecção envolve miracidial apego à superfície do corpo exterior o caracol seguido por penetração ativa e entrada da larva no hospedeiro. Logo após a entrada, o miracidium começa a derramar suas placas epidérmicas ciliadas exteriores como forma um sincício que se tornará a nova superfície externa (tegumento) do próximo estágio larval, o sporocyst primário ou mãe. Através de reprodução assexuada, cada sporocyst primário produz e libera uma segunda geração de sporocysts, denominados secundários ou sporocysts filha, que por sua vez, geram e liberar um grande número de fase intramolluscan final, a cercaria3 . Após a fuga do host de caracol, cercárias livres são capazes de anexar a e penetrando diretamente na pele de um humano ou outro hospedeiro adequado mamífera. Com a entrada em seu novo hospedeiro, cercárias transformam-se para a fase de parasitas schistosomula e invadem o sistema vascular. Eles, por sua vez, migraram para o pulmão e depois para a veia hepática onde amadurecem aos vermes adultos, formam pares masculinos e femininos e viajar para as veias mesentéricas para completar seu ciclo de vida.
Intramolluscan de sucesso ou desenvolvimento de "fase de caracol" de schistosomes larvas é essencial para a continuação do ciclo de transmissão humana de host para host. De importância crítica é a seguinte entrada de período do miracidium livres para o host de caracol e a sua transformação precoce à fase primária sporocyst. Dependendo da compatibilidade fisiológica e imunológica entre hospedeiro e parasita, é durante esta fase de desenvolvimento larval esse sucesso inicial ou falha estabelecer infecções é determinado4,5,6 . Desenvolvimento subsequente de primários sporocysts capazes de produzir assexuadamente sporocysts secundários, o que geram humanos-infectantes cercárias, mais exigem um ambiente de host fisiológicas permissiva que fornece para todo o crescimento do parasita e precisa de reprodutiva.
Até à data, pouco é conhecido sobre a base fisiológica, bioquímica e moleculares processos controlar interações esquistossomíase-caracol, especialmente as moléculas e vias envolveram na regulação da reprodução e desenvolvimento larval, ou modulando respostas imunes de anfitrião. Pronto acesso a um grande número destes estágios larval condições em vitro cultura que permitem a manipulação experimental que iria facilitar muito a descoberta de caminhos do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes do crescimento celular, diferenciação e reprodução. Caminhos críticos parasita ou mecanismos, identificados através de experimentos em vitro , poderiam então ser usados para interromper o crescimento larval/reprodução do acolhimento de caracol, ou para identificar mecanismos imunes de anfitrião de caracol envolvidos no reconhecimento e eliminação de estágios miracidial ou sporocyst.
Neste artigo e o vídeo de apresentação, nós fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar um grande número de livres de S. mansoni miracidia para introdução em vitro de cultura que pode ser sujeito a acompanhamento experimental manipulação (ver Figura 1 para uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo). Embora os procedimentos semelhantes têm sido descritos anteriormente7,8,9, nós sentimos que um protocolo detalhado seria útil para pesquisadores que desejam empregar este modelo para abordar questões ainda sem resposta relacionadas com intramolluscan desenvolvimento larval, proliferação celular e interações imune esquistossomíase-caracol. Além disso, esta abordagem pode facilmente ser adaptada para isolamento de ovos provenientes de outras tremátodes medicamente importantes como bexiga-moradia S. haematobium, solhas de fígado ou acasos de pulmão.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chernin&#39;s balanced salt solution (CBSS+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 g sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g of potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>sugars in 800 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Dissolve calcium chloride separately in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td>mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.53 g calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4160</td>
			<td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 g sodium bicarbonate&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>with constant mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g glucose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>152527</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td>0.22 &#181;m disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&#160; 
			prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Bge&#160; medium (Ibge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 900 mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>220 mL Schneider&#8217;s Drosophila medium modified</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-351Q</td>
			<td>Mix Schneider&#39;s medium with 680 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9010</td>
			<td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 g galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &#181;m 
			pre-sterilized disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Bge medium (cBge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 mL of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mL Incomplete Bge medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td>waterbath at 60&#176;C for 1 hr while gently&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>swirling the bottle every 10 min 
			Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&#160; 
			and store at -20&#176;C.&#160; Mix medium + FBS and 
			filter sterilize using a 0.22 &#181;m pre-sterilized&#160; 
			disposable bottle-top filter&#160; 
			Add penicillin and streptomycin prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (stock solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1L of stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.5 g calcium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C64-500</td>
			<td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g magnesium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M27-500</td>
			<td>Note that the salts will not have completely&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g&#160; sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>dissolved.&#160; Shake vigorously to suspend&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 g&#160; potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>salts prior to making the working soln&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (working solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix stock to ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1500 mL of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&#160;cycle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (1.2% NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Autoclave saline solution to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional equipment and material:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-L mouse euthanizing chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank and regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pathogen-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-L volumetric flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source (150W)</td>
			<td>Chiu Tech Corp</td>
			<td>Model F0-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles (250 mL)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable transfer pipets&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blender</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>Model 51BL31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender cup, 100 mL capacity</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Nikon Instruments&#160;</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.

A grande maioria dos miracidia normalmente será foram coletada os dois primeiros "colheitas". Incubação de miracidia isolado na CBSS + desencadeia o processo de transformação de miracidium-para-sporocyst (Figura 4A- C). Dentro da primeira hora seguinte transferência de cultura poços contendo CBSS +, a maioria dos miracidia cessar natação (Figura 4A). Às 6 h em cultura, miracidia estão ativamente derramamento suas placas epidérmicas ciliadas (Figura 4B). Coincidente com este processo de derramamento, larvas formam sua cobertura tegumentar sincicial exterior como elas se transformam para sporocysts primários. A maioria dos parasitas vai ter concluído a transformação larval, tornando-se totalmente formado sporocysts, pelo pós-cultivo de 24-48 h em CBSS + (Figura 4). Após 4 dias de cultura na CBSS + sozinho, sobrevivência sporocyst é susceptível de diminuir a ~ 80%. No entanto, sporocysts cultivadas para 1 dia em CBSS + e em seguida transferido para meio Bge (cBge) completo para 3 dias normalmente resultam em melhores taxas de sobrevivência e larvas com uma aparência mais robusta (Figura 4). Viabilidade de sporocyst geralmente permanece estável entre 4 e 7 dias em cBge com aumento continuado no crescimento larval durante este tempo em cultura, comparado a CBSS + sozinho.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56345/56345fig1.jpg"> Figura 1 . Visão geral do fluxo de trabalho protocolo. Resumo esquemático das principais etapas envolvidas no isolamento e cultivo de miracidia derivado de camundongos infectados com a sangue fascíola, S. mansoni. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56345/56345fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56345/56345fig2.jpg"> Figura 2 : Processamento de fígados infectados. (A) fígado de rato fortemente infectado com ovos de S. mansoni . Observe o tamanho ampliado, cor anormal e a presença de granulomas no fígado infectado (à direita) comparado com um fígado não infectado normal (à esquerda). (B) lavado mouse fígados após transferência para copo liquidificador estéril de aço inoxidável. Fígados foram então misturados por um minuto usando folha estéril e placa de Petri para cobrir o copo, evitando derramamentos (C). Após a mistura, o fígado homogeneizado, contendo ovos, foi lavado várias vezes em solução salina e resuspended em água estéril, antes de ser transferido para um balão aferido de 1 L coberto com papel alumínio (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56345/56345fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56345/56345fig3.jpg"> Figura 3 : Colheita S. mansoni miracidia. Nadando ativamente miracidia concentrado pela atração de luz na parte superior do balão volumétrico (A). Em intervalos de 10 min, parasitas são colhidas com uma pipeta e colocadas a 4 ° C para imobilizar as larvas. Miracidia em seguida são lavados na CBSS + por centrifugação e coletados em um único tubo (B) apenas antes da distribuição para poços de uma placa de cultura. CBSS +; Chernin balanceamento de solução salina (Tabela de materiais). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56345/56345fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56345/56345fig4.jpg"> Figura 4 : Transformação de Miracidial a sporocysts primárias e sua manutenção em vitro . S. mansoni miracidia e sporocysts colocados em cultura em vitro para momentos diferentes pós-colheita. Miracidia recém colhido dentro de 1h de cultura na CBSS + (A). Após 6 h de cultura, miracidia começaram a lançar suas placas epidérmicas ciliadas (setas) como elas se transformam para sporocysts primárias (B). Após 24h em CBSS + maior parte o miracidia transformaram-se completamente ao sporocysts primários (C). Sporocysts foram transformados em CBSS + para 24h, então transferidos e mantidos em cBge médio por 3 dias (D). Sporocysts geralmente aparecem mais robustos e têm taxas mais altas de sobrevivência no pós-cultivo de 4 dias na presença de cBge, comparado a CBSS + sozinho. CBSS +, Chernin equilibrada solução salina; cBge médio, completa b. glabrata embrionárias celular médio (ver Tabela de materiais). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56345/56345fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .

Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K visualizações.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .

Vídeo: Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...