Este trabalho é apoiado pelo K-INBRE P20GM103418, da Comissão de soja Kansas (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polímero química inicialização, só para SS. Agradecemos a cinegrafista da Universidade, Sr. Jacob Anselmi, pelo seu excelente trabalho com o vídeo. Agradecemos também o Sr. Roger Heckert e Sra. Katha Heckert pelo seu generoso apoio para a investigação.

1. síntese e Functionalization de multi paramétrico Magneto-fluorescente Nanosensors (MFnS).
<ol><li>Síntese de óxido de ferro superparamagnético nanopartículas (IONPs) <ol><li>para se preparar para a síntese IONP, preparar as seguintes 3 soluções: solução 1: FeCl 3 (0,70 g) e FeCl 2 H 2 O (2 mL), 2 solução: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) em H 2 O (15 mL) e a solução 3: ácido poliacrílico (0,855 g) em H 2 O (5 mL).</li>
		<li>Adicionar 90 µ l de ácido clorídrico de 2 M (HCl) à solução 1 e então misture com 2 solução enquanto num Vortex em 875 rpm. Em seguida, adicione solução 3. Continuar num Vortex de 60 min.</li>
		<li>Centrifugar por 20 min no 1.620 g. x de centrifugação o sobrenadante por 20 min em 2.880 g. x</li>
		<li>Purificar o sobrenadante final através de diálise. Adicionar o sobrenadante para um saco de diálise (MWCO 6 &#8722; 8 K) e coloque-o em um béquer contendo tamponado fosfato salino (PBS) (pH = 7,4) e barra de rotação. Deixe de molho por 12h, substituindo com buffer fresco a cada 2-3 h.</li>
	</ol></li> <li>Conjugação de anticorpos de alvos de superfície de IONPs <ol><li>preparar as seguintes quatro soluções: solução a: 5 mg de 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (CED), em 250 µ l MES [2-(N- tampão de ácido etanesulfónico de Morpholinos)] (0,1 M, pH = 6,8), solução b: 3 mg de N-Hidroxisuccinimida (NHS) em 250 µ l de tampão MES (0,1 M, pH = 6,8), solução c: 5 µ g de IgG1, o mAb de Escherichia coli, em 225 µ l de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4) e a solução d: 4 mL de IONP (5,0 mmol) em 1 mL de PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Então imediatamente adicionar 2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES) do buffer para a solução A, adicionar solução-A solução d em pequenos incrementos, no prazo de 15 s, invertendo a solução após cada adição para a mistura.</li>
		<li>Imediatamente começam a adicionar solução B a solução D em pequenos incrementos ao longo de um período de três minutos. Mix, invertendo-se a solução após cada adição.</li>
		<li>Adicionar solução C solução em incrementos de 5 µ l, invertendo a solução após cada adição para a mistura.</li>
		<li>Permitir a reação continuar para 3h em temperatura ambiente e em seguida, continuar a incubação a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Purificar as IONPs Ab-conjugado resultantes através de coluna magnética usando PBS (pH = 7,4, final [Fe] = 3,5 mmol) para remover quaisquer anticorpos unconjugated.
		<ol><li>Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Unir a coluna para a placa magnética e adicionar a solução IONP.</li>
			<li>Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Remova a coluna magnética da placa magnética. Adicionar PBS para a coluna e recolher a solução. Loja a 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>encapsulamento de 1,1 fluorescente &#39; - Dioctadecyl - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-corante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) para o revestimento (PAA) o ácido poliacrílico os conjugado anticorpo IONPs usando um método de difusão de solventes.
	<ol><li>De 4 mL dos IONPs, Adicionar gota a gota 2.0 μL de tintura de DiI (2 mmol) em 100 µ l de DMSO com mistura contínua a 1100 rpm.</li>
		<li>Dialize a solução resultante (MWCO 6-8 KDa, 12 h) contra PBS, criando uma solução final de MFnS com uma concentração final de ferro [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol></li> <li>Caracterização de MFnS <ol><li>para análise espectrofotométrica, usar um leitor de placas para detectar encapsulado DiI tintura com emissão de fluorescência em 595 nM.</li>
		Difusão dinâmica da luz <ol><li>de <li>coloca uma amostra da solução de MFnS em um zetasizer para determinar o tamanho médio e carga de superfície da MFnS. 
			Nota: Aqui, o tamanho médio e carga de superfície de MFnS funcionais foram encontrados para ser 77.09 nm e-22.3 mV, respectivamente.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Bactérias Culturing e preparação de solução estoque <ol><li>bacteriana cultivo <ol><li>hidratar uma pelota liofilizada (Escherichia coli O157: H7) em 1 mL de caldo nutriente e em seguida, adicionar um adicional 5 mL de caldo de carne.</li>
		<li>Aplicam-se 100 µ l desta solução para uma placa de ágar e raia utilizando uma ansa de inoculação estéril, seguida de incubação a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Após 24 h, selecione uma colônia isolada da placa de ágar e adicioná-lo a um 15 mL de caldo de cultura. Incubar a 37 ° C, durante 4-6 h, enquanto monitora o valor de densidade óptica (absorvância a 600 nm).</li>
		<li>Uma vez um valor de densidade óptica de 0.1 obtido, pare de cultivo e realizar diluições em série.</li>
	</ol></li> <li>Diluições em série <ol><li>Adicionar 900 µ l de caldo nutriente para oito tubos estéreis microcentrifuga.</li>
		<li>Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana ao primeiro tubo (diluição 10 -1).</li>
		<li>Levar 100 µ l do primeiro tubo e adicioná-lo para o segundo, para obter uma diluição de 10 -2. Continue este padrão para os tubos restantes, terminando com uma diluição final de 10 -8.</li>
		<li>Transferir 100 µ l de cada tubo para separar as placas de ágar e incubar por 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>No dia seguinte, contar as unidades (CFUs) formadoras em cada prato. Selecione a placa com CFUs ~ 100. Usar as correspondentes diluições para novas experiências (100 µ l = CFUs ~ 100). 
		Nota: Aqui era a diluição de 10 -6 que resultou em 100 ~ CFUs.</li>
	</ol></li></ol> 3. Rápida deteção de E. coli O157: H7 usando MFnS <ol><li>Spike várias soluções de PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) com a quantidade crescente do estoque de 10 -6 bacteriana, resultando em CFU varia de 1-100. Adicionar uma quantidade consistente de MFnS (100 µ l) para essas soluções.</li>
	<li>Criar uma solução de linha de base que contém somente PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).</li>
	<li>Incubar soluções por 30 min a 37 ° C e então deixe-os arrefecer à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferência de soluções individuais para o relaxometer magnético (Tesla 0,47) e gravar alterações nos tempos de relaxamento (T2) em relação as CFUs em cada solução.
	<ol><li>Para gravar as alterações em valores de T2, Comece medindo o valor de T2 da solução de linha de base que contém somente PBS e MFnS.
		Relaxometer <ol><li>lugar a solução em magnética. Abra o respectivo software, selecione o &#34; relaxamento T2 &#34; definição e pressione &#34; medida. &#34;</li></ol></li> <li>seguindo a coleção de linha de base T2, medir os valores de T2 das soluções adicionais que foram cravados com vários concentrações de bactérias. 
		Nota: A mudança em T2 é equivalente à linha de base de T2 subtraída a T2 cravado.</li>
	</ol></li> <li>Remover amostras da relaxometer magnética e centrifugar os tubos a 2880 x g durante 10 min.</li>
	<li>Decante o sobrenadante e ressuspender pelotas bacterianas em 100 µ l de PBS (1. X, pH 7,4).</li>
	<li>Adicionar 80 µ l de cada ressuspensão de uma placa de 96 poços e intensidades de fluorescência recorde em 595 nM. 
	Nota: Teste pode ser repetido usando solventes diferentes, incluindo a água do lago, leite e outros, conforme descrito na seção de resultados</li></ol>

<ol><li>Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens%3A+principles%2C+applications%2C+advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front Microbiol. 5, 770(2014).</li>
<li>Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+of+water+resources+by+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Contamination of water resources by pathogenic bacteria.</a> AMB Express. 4, 51(2014).</li>
<li>Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+rapid+detection+methods+for+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).</li>
<li>Heithoff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecies+variation+in+the+emergence+of+hyperinfectious+bacterial+strains+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002647(2012).</li>
<li>Ishii, S., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+in+the+Environment%3A+Implications+for+Water+Quality+and+Human+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health.</a> Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).</li>
<li>Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+serovar+O3%3AK6+as+cause+of+unusually+high+incidence+of+food-borne+disease+outbreaks+in+Taiwan+from+1996+to+1999%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999.</a> J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+methods+for+the+rapid+detection+and+identification+of+four+pathogenic+Legionella+spp.+and+two+Legionella+pneumophila+subspecies+based+on+the+gene+amplification+of+gyrB%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).</li>
<li>Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+multiplex+PCR+for+simultaneous+detection+of+five+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens.</a> J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).</li>
<li>LeBlanc, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+gears+for+an+influenza+pandemic%3A+validation+of+a+duplex+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+simultaneous+detection+and+confirmatory+identification+of+pandemic+%28H1N1%29+2009+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).</li>
<li>Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+bead-based+multiplex+PCR+assay+for+combined+subtyping+and+oseltamivir+resistance+genotyping+%28H275Y%29+of+seasonal+and+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+influenza+A%2FH1N1%2F2009+antibodies+in+human+serum%3A+a+simple+virus-free+ELISA+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method.</a> PLoS One. 5 (4), e10176(2010).</li>
<li>Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+surface+plasmon-enhanced+fluorescence+spectroscopy+biosensor+for+ultrasensitive+detection+of+E.+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7.</a> Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+visual+detection+of+highly+pathogenic+Streptococcus+suis+serotype+2+isolates+by+use+of+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification.</a> J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).</li>
<li>Han, F., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+potentially+virulent+Vibrio+vulnificus+strains+in+raw+oysters+by+quantitative+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+pathogenic+bacteria+and+screening+of+phage-derived+peptides+using+microcantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers.</a> Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).</li>
<li>Banerjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Magneto-fluorescent+Nanosensors+for+the+Ultrasensitive+Detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7.</a> ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).</li>
<li>Shelby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+magnetic+relaxation+nanosensors%3A+an+unparalleled+%26%2334%3Bspin%26%2334%3B+on+influenza+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled &#34;spin&#34; on influenza diagnosis.</a> Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).</li>
<li>Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Digit+Pathogen+and+Attomolar+Detection+with+the+Naked+Eye+Using+Liposome-Amplified+Plasmonic+Immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay.</a> Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).</li>
<li>Farnleitner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+detection+of+Escherichia+coli+contamination+in+polluted+river+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water.</a> Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).</li>
<li>Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-enhanced+Raman+scattering+based+ligase+detection+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction.</a> J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).</li>
<li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+bacteria+quantification+using+immunomagnetic+separation+and+electrochemical+detection+of+guanine-labeled+secondary+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads.</a> Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).</li>
<li>Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step%2C+nanoparticle-mediated+bacterial+detection+with+magnetic+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation.</a> Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).</li>
<li>Meeker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Photothermal+and+Antibiotic+Killing+of+Biofilm-Associated+Staphylococcus+aureus+Using+Targeted+Antibiotic-Loaded+Gold+Nanoconstructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs.</a> ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtractive+inhibition+assay+for+the+detection+of+E.+coli+O157%3AH7+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+bioassay+for+single+bacterial+cell+quantitation+using+bioconjugated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).</li>
</ol>

A aplicação demonstrada esta nanotecnologia ainda não está aprovada pelo FDA.

Este protocolo foi projetado para produzir MFnS totalmente funcionais como simplesmente possível. No entanto, existem muitos pontos-chave em que a alteração do protocolo pode ser útil, dependendo do objetivo do final do usuário. Por exemplo, o uso de anticorpos diferentes permitiria segmentação dos muitos outros patógenos. Além disso, este protocolo não é limitado ao uso de anticorpos como alvo moléculas. Qualquer molécula que tem afinidade de ligação específica para patógenos alvo, tais como receptores de célula do hospedeiro, também pode ser usada como alvo moléculas. Enquanto a molécula alvo tem uma amina primária ou grupo de álcool, ou pode ser acrescida para ter um, podem ser conjugado para a superfície de nanopartículas de óxido de ferro, de acordo com a química de conjugação de EDC/NHS listada no protocolo. Em segundo lugar, a quantidade de MFnS usado em cada solução de deteção pode ser variada. É importante usar o suficiente para que o valor de T2 para a solução de linha de base (contendo apenas o solvente e o nanosensor sem patógeno alvo) é na faixa de 100-250 MS. se o valor de base é abaixo de 100, então as alterações nos valores de T2 será menos sensíveis , devido a uma superabundância de nanosensor. Para aumentar a valor de T2 de linha de base, reduza a quantidade de nanosensor em solução. Se, no entanto, a linha de base está acima de 250, torna-se extremamente sensível, e falsos positivos podem tornar-se mais prováveis. Por estas razões, sugere-se a apontar para uma solução de base valor T2 entre 100-250 ms.
Limitações atuais do presente protocolo, quando se considera o seu uso como um diagnóstico point-of-care, são a dependência sobre o atual relaxometer magnético de bancada. Enquanto eficaz e estável, esta plataforma de relaxação magnética pode ser reduzida em tamanho para aumentar sua portabilidade. Isso aumentaria a facilidade com que esta plataforma pode ser usada em diferentes ambientes, tais como em fontes de água ou nos mercados de mantimento, para a eficaz seleção bacteriana no local. Isso também poderia reduzir o custo da máquina, tornando-se mais viável para a deteção de point-of-care patógeno.
Deteção de diagnóstico e patógeno doença nas configurações de recursos baixos, no que se refere esta plataforma tem potencial para ser mais eficaz do que a atual patógeno diagnóstico técnicas utilizadas hoje, incluindo PCR e ELISA. Enquanto estas técnicas tradicionais têm provado para ser eficaz em grande parte, eles são altamente complexo, caro e lento. Como tal, há uma necessidade de uma plataforma de diagnóstica precisa que poderia ser desenvolvida para uso em configurações de recursos baixos para detecção de point-of-care de patógenos e diagnóstico da doença. Esta plataforma é relativamente simples de usar, custo-eficaz e rápida. Além de custos de arranque inicial das máquinas necessárias (leitor de relaxometer e placa), os reais MFnS são relativamente baratos e muito estável. Além disso, a coleção de valores de T2 é simples e não requer um técnico profissional de laboratório.
No futuro, será prosseguida colaboração com engenheiros químicos e biológicos para a concepção de um dispositivo mais portátil, portátil que pode ser usado para a deteção fluorescente e magnética de contaminação bacteriana usando MFnS. O desenvolvimento de um dispositivo menor ajudaria a reduzir os custos associados a esta plataforma de deteção ainda mais e aumentar a sua eficácia no campo. Além disso, esta plataforma tem potencial para ser usado para analisar a eficácia do desenvolvimento de agentes biocidas. Como mostrado em nossos dados, nossos MFnS só foram capazes de vincular com bactérias vivem-alvo e não produzido pouco ou nenhum sinal quando incubadas com calor-matou as bactérias. Com esta base, nossa plataforma poderia ser usada para testar a eficácia dos candidatos de biocida, e pretendemos explorar isso ainda mais no futuro.
Passos críticos neste protocolo incluem a síntese inicial de MFnS e recolha de dados de T2. É importante purificar corretamente os MFnS para garantir que anticorpos flutuantes não interfiram com coleta de dados de T2. Além disso, a quantidade de MFnS colocados em cada amostra deve ser consistente, como alterações na concentração MFnS irão alterar os valores de T2, arriscando falsos positivos/negativos.
Em conclusão, MFnS são um novo passo em frente na luta contra a contaminação bacteriana e continuará a ser desenvolvidas como o direcionamento de patógenos adicionais é alcançado e o design mais portátil máquinas é perseguida. O baixo custo e baixa complexidade associada com o uso de MFnS torna um candidato viável para ser utilizado para detecção no local de contaminação bacteriana. Enquanto a síntese destes nanosensors requer preparação cuidadosa, seu uso real é relativamente simples e lhes dá a possibilidade de redução transmitidas por alimentos e doenças transmitidas pela água. Com maior desenvolvimento, a implementação destes nanosensors pode ser vista na exibição de reservatórios de água e alimentos em embalagens sites, pontos de venda e talvez até mesmo casas comercialmente produzidos.

A ocorrência persistente de contaminação bacteriana em ambos produzidos comercialmente alimentos e fontes de água criou uma necessidade de plataformas de diagnósticos cada vez mais rápidas e específicas. 1 , 2 alguns dos contaminantes bacterianos mais comuns responsáveis pela contaminação de alimentos e água são dos gêneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus e Escherichia. 3 , 4 a contaminação bacteriana por esses patógenos frequentemente resulta em sintomas como diarreia, cólera, gastroenterite e febre. 4 contaminação das fontes de água, muitas vezes tem efeitos adversos e drásticos em comunidades sem acesso a água filtrada suficientemente, e contaminação de alimentos tem levado a um grande número de doenças e esforços de recuperação do produto. 5 , 6
A fim de reduzir a ocorrência de doenças causadas por contaminação bacteriana, tem havido uma série de esforços para desenvolver métodos pelos quais água e alimentos podem ser eficientemente verificados antes da venda ou consumo. 3 técnicas como a PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(mediada por loop de amplificação isotérmica de12 LÂMPADA),13,14 entre outros,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente tem sido usado para detecção de vários patógenos. Comparado ao tradicional bacteriana, métodos de cultivo, estas técnicas são muito mais eficientes em relação à especificidade e tempo. No entanto, estas técnicas ainda lutam com falsos positivos e negativos, procedimentos complexos e custo. 1 , 3 , 25 ... é por essa razão que Multiparamétrico magneto-fluorescente nanosensors (MFnS) propõem-se como um método alternativo para a deteção bacteriana.
Estes nanosensors com exclusividade par juntos relaxação magnética e modalidades fluorescentes, permitindo uma plataforma dual-deteção rápida e exata. Usando Escherichia coli O157: H7 como um contaminante de amostra, é demonstrada a capacidade de MFnS para detectar tão pouco quanto 1 CFU em poucos minutos. Específicas do patógeno anticorpos são usados para aumentar a especificidade, e a combinação de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de alta e baixa --contaminação. 16 no caso de contaminação bacteriana, o nanosensors vai enxame à volta as bactérias devido as habilidades alvos dos anticorpos específicos do patógeno. A ligação entre a nanosensors magnética e bactérias limita a interação entre o núcleo de ferro magnético e os prótons de água circundante. Isto causa um aumento nos tempos de relaxamento T2, como registrado por uma relaxometer magnética. Como a concentração de bactérias na solução aumenta, os nanosensors se dispersar com o aumento do número de bactérias, resultando em valores mais baixos de T2. Por outro lado, a emissão de fluorescência aumentará em proporção com a concentração de bactérias, devido ao aumento do número de nanosensors diretamente ligado ao patógeno. Centrifugação das amostras e o isolamento da pelota bacteriana, só irão conservar as nanopartículas diretamente conectadas com as bactérias, removendo qualquer nanosensors flutuante e correlacionando diretamente a emissão de fluorescência com o número de bactérias presentes na solução. Uma representação esquemática deste mecanismo é representada na Figura 1.
Esta plataforma de MFnS foi projetada com rastreio de point-of-care em mente, resultando em características de baixo custo e portátil. MFnS são estáveis à temperatura ambiente e só são necessários em concentrações muito baixas para detecção precisa de bactérias contaminantes. Além disso, após a síntese, o uso da MFnS é simples e não requer o uso de profissionais treinados no campo. Por último, esta plataforma de diagnóstica permite direcionamento altamente personalizável, proporcionando um meio pelo qual este uma plataforma pode ser usada para detectar agentes patogénicos de todos os tipos, em muitas configurações diferentes.

<table><tbody><tr><td>Ferrous Chloride Tetrahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I90-500</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyacryllic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157270250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O111 antibody&amp;nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td><td>ATCC</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Relaxomteter&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Column&amp;nbsp;</td><td>QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 Series</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Floor Model Shaking Incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Open-Air Rocking Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 tem sido associada a ambos de origem hídrica e doenças transmitidas por alimentos e continua a ser uma ameaça, apesar dos métodos de seleção de alimentos e de água usada atualmente. Enquanto os métodos de detecção bacteriana convencional, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios imunoenzimático (ELISA) especificamente podem detectar contaminantes patogênicos, eles exigem preparação da amostra extensa e longos períodos de espera. Além disso, estas práticas exigem instrumentos de laboratório sofisticado e configurações e devem ser executadas por profissionais treinados. Neste documento, propõe-se um protocolo para uma técnica de diagnóstica mais simples que apresenta uma combinação única de parâmetros magnéticos e fluorescentes em uma plataforma baseada em nanopartículas. O nanosensors de magneto-fluorescente Multiparamétrico proposto (MFnS) pode detectar a contaminação de Escherichia coli O157: H7 com tão pouco quanto 1 unidade formadoras presente em solução dentro de menos de 1 h. Além disso, a capacidade de MFnS permanecem altamente funcional em meios complexos tais como leite e água do lago foi verificada. Ensaios de especificidade adicionais também foram utilizados para demonstrar a capacidade de MFnS para detectar somente as bactérias do alvo específico, mesmo na presença de espécies bacterianas semelhantes. O emparelhamento de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminação do patógeno em uma ampla gama de concentrações, exibindo seu alto desempenho em ambos deteção de contaminação e tarde-estágio inicial. A eficácia, acessibilidade e portabilidade dos MFnS torná-los um candidato ideal para o rastreio de point-of-care para bactérias contaminantes em uma ampla gama de configurações, de reservatórios aquáticos para alimentos embalados comercialmente.

O mecanismo de ação MFnS é representado na Figura 1. O agrupamento de MFnS em torno da superfície de bactérias contaminantes interfere com as interações entre os magnetic cores dos MFnS e os núcleos de hidrogênio circundante. Como resultado deste relaxamento de clustering, magnético valores aumentam. À medida que aumenta a concentração de bactérias contaminantes, reduz a clusterização e a alteração nos valores de T2 diminui. Portanto, a adição de uma modalidade fluorescente é crucial. À medida que aumenta a concentração bacteriana, aumenta a força do sinal fluorescente produzido por MFnS, permitindo a detecção sensível de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de baixa e alta concentração.
Seguindo o protocolo,16 MFnS foram sintetizados e testados primeiro em soluções de PBS (1. X, pH 7,4). A modalidade inicial utilizada para detecção, relaxação magnética, foi usada para gravar alterações em valores de T2. De acordo com o protocolo, as amostras foram centrifugadas então, pelotas foram resuspended e fluorescência foram recolhidos. O correspondente ΔT2 e valores de emissão de fluorescência são apresentados na Figura 2. Como mostrado, o valor de ΔT2 foi maior em concentrações menores de contaminação bacteriana e chegou a saturação em aproximadamente 20 CFUs. Emissão de fluorescência, por outro lado, tornou-se mais preciso na &#62; 20 CFUs, mostrando a importância de combinar essas duas modalidades. Seguindo estes ensaios primários, testes semelhantes foram realizados em meios complexos, incluindo o leite e a água do lago. Isto foi feito para garantir que os nanosensors são ainda eficazes nos meios de comunicação mais complexos. Os dados coletados destes ensaios são apresentados na Figura 3 e são muito semelhantes para os ensaios realizados em PBS. Isto confirma que estes nanosensors permanecem eficazes nos meios de comunicação complexos.
Após a confirmação de que MFnS poderia detectar a presença de contaminantes bacterianos em simples e complexos meios de comunicação, um número de testes realizaram-se então para determinar o nível de especificidade, mantido pelo nanosensors. Para este fim, MFnS foram incubados em soluções que contêm bactérias do alvo, as bactérias do alvo morto de calor, bactérias não-alvo (não-patogênicas de e. coli e S. typhimurium) e uma mistura. Como este foi apenas um ensaio de especificidade, a coleta de dados de relaxação magnética sozinhos era suficiente, e os dados correspondentes são apresentados na Figura 4. Como pode ser visto, o MFnS vinculado apenas a viver de Escherichia coli O157: H7 e não para outras bactérias as calor-matou ou não-alvo. Este nível de especificidade é atribuída aos anticorpos conjugados direcionamentos e ainda confirma que MFnS será eficaz na detecção de contaminantes específicos do patógeno, mesmo quando na presença de espécies de bactérias não-patogênicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig1.jpg"> 
Figura 1 : Mecanismo de detecção de magneto-fluorescentes. Representação esquemática da síntese de MFnS e o mecanismo dual-modal da deteção bacteriana. Após um período de incubação curto (30 min), MFnS são capazes de detectar sensivelmente as bactérias do alvo através de uma combinação de ressonância magnética e de emissão de fluorescência. Cluster de MFnS em torno da superfície de bactérias contaminantes provoca alterações em valores de relaxação magnética, que são detectáveis por um relaxometer magnético. Além disso, os sinais fluorescentes podem ser recolhidos desde os MFnS diretamente ligado a contaminantes bacterianos. Isto fornece uma plataforma de deteção de dual-modal capaz de contaminantes bacterianos de deteção em ambas as gamas de baixa e alta concentração. 16 esta figura foi modificada com a permissão de. 16
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig2v3.jpg"> 
Figura 2 : Prova de conceito,. A) dados de relaxamento magnético (ΔT2) foi coletados pela primeira vez de diluições de Escherichia coli O157: H7 (1-100 CFU) em solvente de PBS (1 X, pH = 7,4). Senhor de detecção de bactérias era altamente sensível à baixa contagem de UFC (baixo-relevo: desde o UFC 1-20). No entanto, as leituras de ΔT2 se tornou saturadas em altas concentrações bacterianas (&#62; 20 CFU), indicando que o senhor é mais valiosa para a detecção e quantificação de estágios iniciais de contaminação bacteriana. B) dados de emissão de fluorescência da mesma cravado soluções PBS (baixo-relevo: trama de linearidade). Os resultados mostraram que o método de deteção de fluorescência é mais sensível a maior contagem de UFC, enquanto é falta de sensibilidade para amostras CFU baixas. Juntos, estes dados demonstram a capacidade das modalidades magnéticas e fluorescentes para detectar e quantificar a contaminação bacteriana no início e final-estágios de contaminação bacteriana. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig3v3.jpg"> 
Figura 3 : Deteção bacteriana em meios complexos. Relaxação magnética ΔT2 dados coletados dos meios de comunicação mais complexos, incluindo A) Lago água e B) leite integral. Semelhante aos dados coletados das soluções anteriores de PBS, observou-se que a detecção de contaminantes bacterianos foi mais sensível na faixa de 1-20 UFC (inserções). Dados de emissão de fluorescência correspondente foi coletados para o C) água do lago e D) amostras de leite (inserções: linearidade parcelas), que mostrou maior sensibilidade com o aumento da contagem de UFC. Mais uma vez, esses dados demonstram a eficácia com que cada modalidade complementa o outro e validar a sua capacidade de permanecer funcional em meios complexos. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig4v3.jpg"> 
Figura 4 : Especificidade MFnS. A especificidade de MFnS foi testada usando análise de senhor em soluções de caldo nutriente contendo A) um número de cruz-contaminantes bacterianos e uma mistura e B) calor-Inactive Escherichia coli O157: H7. Como mostrado, é claro que o nanosensors não tem pouco ou nenhuma ligação com bactérias não específico e são ainda capaz de detectar as bactérias do alvo na presença de outros contaminantes, garantindo que esta forma de rastreio seria viable para uso em meios complexos que contêm um número de espécies de bactérias não-patogênicas. C) outras especificidade teste foi conduzido por sintetizar MFnS com um anticorpo isotype (círculos vermelhos: Antie. coli O111), que resultou em pouca ou nenhuma ligação em comparação com os MFnS conjugado anticorpo O157: H7 (quadrados pretos). Estes dados demonstram que MFnS apenas reagir com bactérias alvo viável, ainda mais, verificando sua eficácia como uma plataforma de diagnóstica point-of-care. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16

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Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K visualizações.  Pittsburg State University. O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Imunologia e Infecção

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bioengenharia

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Química

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologia

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors para detectar Protease atividade In Vivo para diagnóstico não-invasivo

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular diagnostics. However, traditional PCR is very time-consuming because of the low-temperature variation efficiency. This work proposes a continuous-flow-PCR (CF-PCR) system based on a microfluidic chip. The amplification time can be greatly reduced by running the PCR solution into a microchannel placed on heaters set at different temperatures. Moreover, as capillary electrophoresis (CE) is an ideal way to differentiate positive and false-positive PCR products, a CE system was built to achieve efficient separation of the DNA fragments. This paper describes the process of amplification of Escherichia coli (E. coli) by the CF-PCR system built in-house and the detection of the PCR products by CE. The results demonstrate that the target gene of E. coli was successfully amplified within 10 min, indicating that these two systems can be used for the rapid amplification and detection of nucleic acids.

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

This protocol describes how to build a continuous-flow-polymerase chain system based on a microfluidic chip and how to build a capillary electrophoresis system in the lab. It presents a simple method for the analysis of nucleic acids in the lab.

Amplificação de Escherichia coli em um chip microfluídico de PCR em fluxo contínuo e sua detecção com um sistema de eletroforese capilar

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Resumo

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