Diese Arbeit wird von K-INBRE P20GM103418, Kansas Soja Kommission (KSC/PSU-1663), ACS PRF 56629-UNI7 und PSU Polymer Chemie-Gründerfonds, alle SS unterstützt. Wir danken der Universität Videofilmer, Herr Jacob Anselmi, für seine hervorragende Arbeit mit dem Video. Wir danken auch Herrn Roger Heckert und Frau Katha Heckert für ihre großzügige Unterstützung für die Forschung.

1. Synthese und Funktionalisierung von multiparametrischen Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS).
<ol><li>Synthese von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) <ol><li>zur Vorbereitung der IONP Synthese, bereiten die folgenden 3 Lösungen: Lösung 1: FeCl 3 (0,70 g) und FeCl 2 H 2 O (2 mL), Lösung 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) H 2 O (15 mL) und Lösung 3: Polyacryl Säure (0,855 g) H 2 O (5 mL).</li>
		<li>Lösung 1 90 µL 2 M Salzsäure (HCl) hinzu und dann mischen Sie mit Lösung 2 sofort beim Aufschütteln bei 875 UPM. Dann fügen Sie Lösung 3. Bereich für 60 min. weiter</li>
		<li>Zentrifuge für 20 min bei 1.620 x g. Zentrifugieren den Überstand für 20 min bei 2.880 x g.</li>
		<li>Reinigen den endgültigen Überstand über Dialyse. Hinzufügen den Überstand auf eine Dialyse-Tasche (MWCO 6 &#8722; 8 K) und legen Sie sie in einen Becher mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4) und Spin-Bar. Lassen Sie es für 12 h, ersetzen mit frischen Puffer alle 2-3 h einweichen</li>
	</ol></li> <li>Konjugation von Target-spezifische Antikörper auf der Oberfläche des IONPs <ol><li>bereiten die folgenden vier Lösungen: Lösung A: 5 mg 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) in 250 µL MES [2-(N- Morpholino) Ethanesulfonic Säure] Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung B: 3 mg des N-Hydroxysuccinimide (NHS) in 250 µL MES Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung C: 5 µg von IgG1, die E. Coli-mAb in 225 µL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) , und Lösung D: 4 mL IONP (5.0 Mmol) in 1 mL PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Fügen Sie 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer-Lösung A, dann sofort hinzufügen Lösung A Solution D in kleinen Schritten innerhalb von 15 s, invertieren die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von.</li>
		<li>Beginnen sofort, Lösung B Lösung D in kleinen Schritten über einen Zeitraum von drei Minuten hinzufügen. Mischung durch invertieren die Lösung nach jeder Zugabe.</li>
		<li>Lösung in Schritten von 5 µL Lösung C hinzufügen die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von invertierenden.</li>
		<li>Reaktion auf weiter für 3 h bei Raumtemperatur und dann weiter die Inkubation über Nacht bei 4 ° C zu ermöglichen.</li>
		<li>Reinigen die resultierende Ab konjugiert IONPs über magnetische Spalte mit PBS (pH = 7,4, Finale [Fe] = 3,5 Mmol), unconjugated Antikörper zu entfernen.
		<ol><li>Der magnetischen Spalte Waschen mit PBS (1 mL). Legen Sie die Spalte auf der Magnetplatte und IONP Lösung hinzufügen.</li>
			<li>Waschen die magnetischen Spalte mit PBS (1 mL) wieder. Entfernen Sie die magnetische Spalte aus magnetischen Platte. Hinzufügen der Spalte PBS und sammeln Sie die Lösung. Shop bei 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>Kapselung von fluoreszierenden 1,1 &#39; - Dioctadecyl - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) Farbstoff in die Polyacryl-Säure (PAA)-Beschichtung von der Antikörper konjugiert IONPs mit einem Lösungsmittel-Diffusion-Methode.
	<ol><li>Hinzufügen 4 mL der IONPs, tropfenweise 2.0 µL DiI Farbstoff (2 Mmol) in 100 µL von DMSO mit kontinuierlichen Vermischung bei 1100 u/min.</li>
		<li>Dialyse die resultierende Lösung (MWCO 6-8 KDa, 12 h) gegen PBS, erstellen eine endgültige Lösung der MFnS mit einer endgültigen Eisenkonzentration von [Fe] = 2 Mmol.</li>
	</ol></li> <li>Charakterisierung von MFnS <ol><li>für photometrische Analyse, benutzen Sie einen Platte Reader gekapselte DiI Farbstoff mit Fluoreszenz-Emission bei 595 erkennen nM.</li>
		<li>Dynamische Lichtstreuung <ol><li>legen Sie eine Probe der MFnS Lösung in einem Zetasizer zur Bestimmung der durchschnittlichen Größe und Oberflächenladung der MFnS. 
			Hinweis: Hier die Durchschnittsgröße und Oberflächenladung der funktionalen MFnS erwiesen sich 77.09 nm und-22.3 mV, bzw..</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Bakterielle Culturing und Vorbereitung der Lager-Lösung <ol><li>bakterielle Kultivierung <ol><li>Hydrat einen gefriergetrockneten Pellet (E. Coli O157: H7) in 1 mL der Nährbouillon und fügen Sie dann eine zusätzliche 5 mL Brühe.</li>
		<li>Gelten 100 µL dieser Lösung zu einer Nährbodenplatte und Streifen mit Hilfe einer sterilen Impfschlinge, gefolgt von Inkubation bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Nach 24 h, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte und eine 15 mL Kultur Brühe hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C für ca. 4-6 h, während der Überwachung des optischen Dichte-Wert (Extinktion bei 600 nm).</li>
		<li>Das gewonnene ein optische Dichte-Wert von 0,1 ist Kultivierung zu stoppen, und führen Sie Verdünnungsreihen.</li>
	</ol></li> <li>Verdünnungsreihen <ol><li>Hinzufügen 900 µL Nährbouillon, acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Hinzufügen 100 µL Bakteriensuspension auf das erste Rohr (Verdünnung 10 -1).</li>
		<li>Nehmen 100 µL vom ersten Rohr und fügen Sie es in die zweite, eine Verdünnung von 10 -2 zu erhalten. Dieses Muster für die restlichen Rohre, endend mit einer Endverdünnung von 10 -8 weiter.</li>
		<li>Transfer 100 µL aus jeder Tube Agarplatten zu trennen, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 ° c</li>
		<li>Am nächsten Tag zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) auf jeder Platte. Wählen Sie die Platte mit ~ 100 KBE. Verwenden Sie die entsprechende Verdünnungen für weitere Experimente (100 µL = ~ 100 KBE). 
		Hinweis: Hier war es die 10 -6 Verdünnung, die ~ 100 KBE führten.</li>
	</ol></li></ol> 3. Schnelle Erkennung von E. coli O157: H7 mit MFnS <ol><li>Spike verschiedenen PBS-Lösungen (1 X, pH 7,4, 300 µL) mit steigenden Mengen der 10 -6 bakterielle Lager, wodurch KBE reicht von 1-100. Fügen Sie eine konsistente Menge von MFnS (100 µL) zu diesen Lösungen.</li>
	<li>Schaffen eine Basislösung, die enthält nur PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) und MFnS (100 µL).</li>
	<li>Lösungen für 30 min bei 37 ° C inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.</li>
	<li>Transfer individueller Lösungen für die magnetische Relaxometer (0,47 Tesla) und Datensatzänderungen in Relaxationszeiten (T2) im Verhältnis zu der KBE in jeder Lösung.
	<ol><li>Änderungen in T2 Werte erfassen, beginnen durch die Messung des T2-Wertes der Basislösung, die nur PBS und MFnS enthält.
		<ol><li>Ort die Lösung in der magnetischen Relaxometer. Öffnen Sie die jeweilige Software, wählen Sie die &#34; T2 Entspannung &#34; Einstellung, und drücken Sie &#34; Maßnahme. &#34;</li></ol></li> <li>nach der Auflistung der Baseline T2, T2-Werte der zusätzliche Lösungen, die mit verschiedenen gespickt waren messen Konzentrationen von Bakterien. 
		Hinweis: Die Veränderung der T2 ist äquivalent zum Ausgangswert subtrahiert die Spikes T2 T2.</li>
	</ol></li> <li>Proben aus der magnetischen Relaxometer entfernen und Zentrifugieren der Rohre bei 2880 X g für 10 min.</li>
	<li>Den Überstand abgießen und Aufschwemmen bakterielle Pellets in 100 µL PBS (1 X, pH 7,4).</li>
	<li>Hinzufügen 80 µL jeder Wiederfreisetzung einer 96-Well-Platte und Rekord Fluoreszenz-Intensitäten bei 595 nM. 
	Hinweis: Prüfung wiederholt werden kann mit verschiedenen Lösungsmitteln, einschließlich Seewasser, Milch und andere, wie beschrieben im Abschnitt "Ergebnisse"</li></ol>

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</ol>

Die nachweisliche Anwendung der dieser Nanotechnologie ist noch nicht von der FDA zugelassen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um voll funktionsfähige MFnS produzieren so einfach wie möglich. Allerdings gibt es viele wichtige Punkte, die bei denen Änderung des Protokolls möglicherweise nützlich, je nach Ziel des Benutzers. Beispielsweise würde die Verwendung von verschiedenen Antikörpern für die Ausrichtung von vielen anderen Krankheitserregern ermöglichen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht beschränkt auf die Verwendung von Antikörpern als targeting Moleküle. Jedes Molekül hat spezifische Bindungsaffinität für Zielerreger, wie Host-Zell-Rezeptoren, kann auch als Moleküle gezielt verwendet werden. Solange das targeting Molekül ein primäres Amin oder Alkohol-Gruppe hat oder funktionalisiert werden kann, um ein zu haben, kann es an der Oberfläche von Eisenoxid-Nanopartikeln nach der EDC/NHS Konjugation Chemie im Protokoll aufgeführten konjugiert. Zweitens kann die Menge an MFnS verwendet in jeder Erkennung Lösung variiert werden. Es ist wichtig, genug zu verwenden, so dass der T2-Wert für die Basislösung (mit nur Lösungsmittel und Nanosensor ohne Ziel Erreger) im Bereich von 100-250 Ms. ist ist der Baselinewert unter 100, dann werden die Änderungen im T2 Werte weniger empfindlich , durch eine Überfülle von Nanosensor. Um die Basislinie T2 Wert zu erhöhen, reduzieren Sie die Menge des Nanosensor in Lösung. Wenn jedoch die Grundlinie über 250 liegt, wird es übermäßig empfindlich und Fehlalarme können wahrscheinlicher geworden. Aus diesen Gründen wird vorgeschlagen, eine Basislösung T2 Wert zwischen 100-250 ms anzustreben.
Derzeitigen Einschränkungen dieses Protokolls, wenn man seine Verwendung als ein Point-of-Care-Diagnostik sind die Abhängigkeit von der aktuellen Benchtop magnetische Relaxometer. Effektive und stabile, könnte diese magnetischen Entspannung-Plattform um die Portabilität zu erhöhen verkleinert werden. Dies würde die Benutzerfreundlichkeit erhöhen, mit der diese Plattform in verschiedenen Umgebungen, wie z. B. an Wasserquellen oder im Lebensmittelgeschäft Märkte für effektive bauseitige bakterielle Abschirmung verwendet werden könnte. Dies könnte auch die Kosten für diese Maschine, so dass es mehr möglich für Point-of-Care Keimnachweis reduzieren.
Bezug auf Krankheit Diagnose und Erreger-Nachweis in ressourcenschonende Einstellungen hat diese Plattform das Potenzial, wirksamer sein als aktuelle Erreger Diagnose verwendeten Techniken heute, einschließlich PCR und ELISA. Während diese traditionellen Techniken weitgehend effizient erwiesen haben, sind sie höchst komplex, teuer und langsam. So gibt es eine Notwendigkeit für eine präzise Diagnose Plattform, die für den Einsatz in niedrigen Ressourceneinstellungen für Point-of-Care-Erkennung von Krankheitserregern und Diagnose von Krankheiten entwickelt werden könnte. Diese Plattform ist relativ einfach zu bedienen, kostengünstig und schnell. Abgesehen von Erstinbetriebnahme Kosten der erforderlichen Maschinen (Relaxometer und Platte Leser) sind die tatsächlichen MFnS relativ billig und sehr stabil. Darüber hinaus die Auflistung von Werten der T2 ist einfach und erfordert keine professionelle Laborantin.
Zusammenarbeit mit chemischen und biologischen Ingenieure werden in der Zukunft fortgesetzt werden, um mehr tragbare, handgeführte Geräte zu entwickeln, die für den magnetischen und fluoreszierenden Nachweis der bakteriellen Kontamination mit MFnS verwendet werden könnte. Die Entwicklung von einem kleineren Gerät würde helfen, weiter reduzieren die Kosten für diese Erkennung Plattform und erhöhen ihre Wirksamkeit auf dem Gebiet. Darüber hinaus hat diese Plattform das Potenzial, die verwendet werden, um die Wirksamkeit der Entwicklung Biozide Wirkstoffe zu analysieren. Wie unsere Daten zeigt, unsere MFnS konnten nur mit live-gezielt Bakterien binden und produziert wenig bis gar kein Signal, wenn mit Hitze getötet Bakterien inkubiert. Basierend auf dieser, unserer Plattform genutzt werden, die Wirksamkeit der Biozid-Kandidaten zu testen, und wir planen, dies in Zukunft weiter zu erforschen.
Wichtige Schritte in diesem Protokoll sind die erste Synthese von MFnS und Datensammlung T2. Es ist wichtig, richtig zu reinigen die MFnS um sicherzustellen, dass frei schwebenden Antikörper T2 Datenerhebung nicht stören. Darüber hinaus muss die Höhe der MFnS in jeder Probe gestellt, übereinstimmen wie Veränderungen in der Konzentration MFnS T2 Werte, riskieren falsche positive/negative verändern werden.
Abschließend MFnS sind ein neuer Schritt im Kampf gegen bakterielle Kontamination, und wird weiter ausgebaut werden, da die Ausrichtung der zusätzliche Erreger erreicht wird und die Gestaltung mobiler Maschinen verfolgt. Die geringen Kosten und geringer Komplexität verbunden mit dem Einsatz von MFnS macht sie einen brauchbarer Kandidat für vor-Ort-Nachweis der bakteriellen Kontamination verwendet werden. Während die Synthese von diesen Nanosensoren sorgfältigen Vorbereitung erfordert, ihre tatsächliche Verwendung ist relativ einfach, und gibt ihnen das Potenzial, Lebensmittelvergiftungen und Wasser übertragenen Krankheiten zu reduzieren. Bei der Weiterentwicklung die Umsetzung dieser Nanosensoren kann in der Vorführung von Wasserbecken zu sehen und kommerziell produzierte Lebensmittel Verpackung Websites, Verkaufsstellen, und vielleicht sogar Häuser.

Das dauerhafte auftreten der bakteriellen Kontamination in beiden kommerziell produzierte Lebensmittel und Wasser-Quellen müssen zunehmend schnellen und spezifischen diagnostischen Plattformen geschaffen hat. 1 , 2 einige der häufigeren bakterielle Verunreinigungen für Nahrung und Wasser Kontamination verantwortlich sind aus den Salmonellen, Staphylokokken, Listerien, Vibrio, Shigella, Bacillus und Escherichia Gattungen. 3 , 4 bakterielle Kontamination durch diese Erreger häufig führt zu Symptomen wie Durchfall, Fieber, Cholera und Gastroenteritis. 4 Kontamination von Wasser-Quellen oft hat drastische und nachteilige Auswirkungen auf die Gemeinden ohne Zugang zu ausreichend gefiltertes Wasser und Kontamination von Lebensmitteln führte zu zahlreichen Erkrankungen und Produkt-Rückruf-Bemühungen. 5 , 6
Um das Auftreten von Erkrankungen durch bakterielle Kontamination zu reduzieren, wurden eine Reihe von Maßnahmen, Methoden zu entwickeln, mit denen Wasser und Nahrung effizient vor Verkauf oder Verbrauch gescannt werden können. 3 Techniken wie PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung) Lampe),13,14 u. a.15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 haben vor kurzem für die Erkennung von verschiedenen Krankheitserregern verwendet worden. Im Vergleich zu traditionellen bakterielle Kultivierung Methoden, sind diese Techniken wesentlich effizienter im Hinblick auf Spezifität und Zeit. Diese Techniken kämpfen noch mit falsch positive und negative, komplexe Verfahren und Kosten. 1 , 3 , 25 es ist aus diesem Grund, dass multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) als eine alternative Methode für bakterielle Erkennung vorgeschlagen werden.
Diese Nanosensoren Paaren eindeutig zusammen magnetische Entspannung und fluoreszierende Modalitäten, so dass für eine Dual-Erkennung-Plattform, die eine schnelle und genaue. Mit E. Coli O157: H7 als eine Verunreinigung der Probe, zeigt die Fähigkeit des MFnS, so wenig wie 1 KBE innerhalb von Minuten erkennen. Erreger-spezifischen Antikörper werden verwendet, um die Spezifität zu erhöhen, und die Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Bereichen Low - und High-Kontamination. 16 bei bakteriellen Kontamination werden die Nanosensoren um die Bakterien durch die gezielten Fähigkeiten der Erreger-spezifischen Antikörper schwärmen. Die Bindung zwischen der magnetische Nanosensoren und Bakterien schränkt die Interaktion zwischen der magnetischen Eisenkern und die umliegenden Wasser Protonen. Dies bewirkt eine Erhöhung der T2-Relaxationszeiten von magnetischen Relaxometer aufgenommen. Da die Konzentration von Bakterien in Lösung steigt zu zerstreuen die Nanosensoren mit der erhöhten Anzahl von Bakterien, was zu niedrigeren T2-Werten. Im Gegensatz dazu erhöht Fluoreszenzemission proportional mit der Konzentration von Bakterien durch die gestiegene Zahl der Nanosensoren direkt pathogen gebunden. Zentrifugation der Proben und Isolation des bakteriellen Pellets werden nur die Nanopartikel direkt angeschlossen, die Bakterien, entfernen alle schwebenden Nanosensoren und direkt korrelieren die Fluoreszenz-Emission mit der Anzahl der sparen Bakterien in Lösung. Eine schematische Darstellung dieses Mechanismus ist in Abbildung 1dargestellt.
Diese MFnS-Plattform wurde mit Point-of-Care-Screening im Auge, was zu Low-Cost und tragbaren Eigenschaften entwickelt. MFnS sind bei Raumtemperatur stabil und müssen dann nur in sehr geringen Konzentrationen für präzise Erkennung von bakteriellen Verunreinigungen. Darüber hinaus nach der Synthese, Einsatz von der MFnS ist einfach und erfordert nicht die Verwendung von ausgebildeten Fachleuten auf dem Gebiet. Schließlich ermöglicht dieses Diagnoseplattform für hochgradig anpassbare targeting, ein Mittel, durch welche diese eine Plattform verwendet werden, um Krankheitserreger aller Art in vielen verschiedenen Einstellungen zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>Ferrous Chloride Tetrahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I90-500</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyacryllic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157270250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O111 antibody&amp;nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td><td>ATCC</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Relaxomteter&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Column&amp;nbsp;</td><td>QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 Series</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Floor Model Shaking Incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Open-Air Rocking Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 wurde für beide wasserbasierte verbunden und lebensmittelbedingten Erkrankungen, und bleibt eine Bedrohung trotz der Nahrung und Wasser-Screening-Methoden verwendet derzeit. Während konventionelle bakterielle Nachweisverfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) speziell Pathogene Verunreinigungen erkennen können, benötigen sie umfangreiche Probenvorbereitung und lange Wartezeiten. Darüber hinaus sind diese Praktiken fordern anspruchsvolle Laborgeräte und Einstellungen, und müssen von ausgebildeten Fachleuten ausgeführt werden. Hierin wird ein Protokoll für eine einfachere diagnostische Technik vorgeschlagen, die die einzigartige Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Parameter in ein Nanopartikel-basierte Plattform bietet. Die vorgeschlagenen multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) erkennt E. Coli O157: H7 Kontamination mit so wenig wie 1 koloniebildenden Einheit in Lösung innerhalb von weniger als 1 h vorhanden. Darüber hinaus die Fähigkeit der MFnS hochfunktionelle in komplexen Medien bleiben wie Milch und Wasser des Sees verifiziert wurde. Weitere Besonderheit Assays dienten auch die Fähigkeit des MFnS, nur zu erkennen, die gezielt Bakterien, auch in Gegenwart von ähnlichen Bakterienarten nachweisen. Die Kopplung der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von Pathogenkontamination in einer Vielzahl von Zusammenschlüssen, seine hohe Leistung in beiden frühen und späten Stadium Fremdkörpererkennung ausstellen. Wirksamkeit, Erschwinglichkeit und Übertragbarkeit von der MFnS machen sie einen idealen Kandidat für Point-of-Care-Screening für bakterielle Verunreinigungen in einer Vielzahl von Einstellungen, von aquatischen Stauseen zu kommerziell verpackten Lebensmitteln.

Der Wirkmechanismus von MFnS wird in Abbildung 1dargestellt. Die Wechselwirkungen zwischen den Magnetic cores der MFnS und die umliegenden Wasserstoffkerne stört das clustering von MFnS um die Oberfläche der bakteriellen Verunreinigungen. Diese Cluster, magnetische Entspannung erhöht die Werte. Mit zunehmender Konzentration der bakteriellen Verunreinigungen clustering verringert, und T2 Wertewandel senkt. Daher ist die Zugabe von einem fluoreszierenden Modalität entscheidend. Mit zunehmender die Bakterienkonzentration erhöht die Festigkeit des das Fluoreszenzsignal von MFnS produziert, so dass für den empfindlichen Nachweis von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Konzentrationsbereichen niedriger und hoher.
Nach dem Protokoll wurden16 MFnS synthetisiert und zuerst in Lösungen von PBS (1 X, pH 7,4) getestet. Die erste Modalität verwendet für die Erkennung von magnetischen Entspannung, wurde verwendet, um Änderungen im T2 Werte aufgezeichnet werden. Gemäß dem Protokoll die Proben wurden dann zentrifugiert, Pellets wurden Nukleinsäuretablette und Fluoreszenz-Daten wurden gesammelt. Die entsprechenden ΔT2 und Fluoreszenz-Emissionswerte sind in Abbildung 2dargestellt. Wie gezeigt, der ΔT2 Wert war größte bei niedrigeren Konzentrationen von bakterieller Verunreinigung, und Sättigung auf ca. 20 KBE erreicht. Fluoreszenz-Emission wurde auf der anderen Seite, genauer am &#62; 20 KBE, zeigt wie wichtig es ist, diese zwei Modalitäten zu kombinieren. Im Anschluss an diese primäre Assays wurden ähnliche Tests in komplexen Medien, einschließlich Seewasser und Milch durchgeführt. Dies wurde getan, um sicherzustellen, dass die Nanosensoren in komplexer Medien noch wirksam sind. Die Daten aus diesen Tests sind in Abbildung 3 dargestellten und sind ähnlich wie die Assays in PBS durchgeführt. Dadurch wird sichergestellt, dass diese Nanosensoren in komplexen Medien wirksam.
Nachdem Sie bestätigt haben, dass MFnS das Vorhandensein von bakteriellen Verunreinigungen in einfache und komplexe Medien erkennen konnte, wurden eine Reihe von Tests dann durchgeführt, um den Grad der Spezifität, verwaltet von der Nanosensoren bestimmen. Zu diesem Zweck wurden MFnS in Lösungen mit Ziel Bakterien, Hitze getötet Ziel Bakterien, Nichtziel-Bakterien (nicht-pathogenen E. Coli und S. Typhimurium) und eine Mischung inkubiert. Da dies nur eine Spezifität-Assay, die Datenerhebung magnetische Entspannung allein genügte, und die entsprechenden Daten werden in Abbildung 4dargestellt. Wie man sehen kann, die MFnS verpflichtet nur um E. Coli O157: H7, zu leben und nicht auf die andere Hitze getötet oder Nichtziel-Bakterien. Diese Spezifität ist zurückzuführen auf die konjugierte targeting Antikörper, und weiter bestätigt, dass MFnS bei der Erkennung von spezifischen Erreger Verunreinigungen, auch bei nicht-pathogenen Bakterienarten wirksam wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Magneto-fluoreszierende Erkennungsmechanismus. Schematische Darstellung des MFnS Synthese und der Dual-Modal-Mechanismus der bakteriellen Erkennung. Nach einer kurzen Inkubationszeit (30 min) sind MFnS sensibel die Ziel-Bakterien über eine Kombination von Magnetresonanz und Fluoreszenzemission erkennen. Clustering von MFnS um die Oberfläche der bakteriellen Verunreinigungen verursacht Änderungen im magnetischen Entspannung Werte, die durch eine magnetische Relaxometer nachweisbar sind. Darüber hinaus können fluoreszierende Signale aus dem MFnS direkt verpflichtet, bakterielle Verunreinigungen erfasst werden. Dies bietet eine Dual-Modal-Erkennung-Plattform Erkennung bakterieller Verunreinigungen in beiden Konzentrationsbereichen niedriger und hoher fähig. 16 diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig2v3.jpg"> 
Abbildung 2 : Proof of Concept. (A) magnetische Entspannung Daten (ΔT2) wurden zuerst von Verdünnungen von E. Coli O157: H7 (1-100 KBE) in PBS Lösungsmittel (1 X, pH = 7,4). Herr Nachweis von Bakterien wurde hochsensiblen am unteren KBE zählt (Einschub: von 1-20 KBE). Jedoch wurde die ΔT2 Lesungen bei höheren Bakterienkonzentration gesättigt (&#62; 20 KBE), darauf hinweist, dass Herr wertvoller für die Erkennung und Quantifizierung von Frühphasen-bakterielle Kontamination. (B) Fluoreszenz Emissionsdaten aus dem gleichen versetzt PBS Lösungen (Einschub: Linearität Plot). Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenz-Nachweismethode empfindlicher auf höhere KBE zählt, während es in der Empfindlichkeit für niedrige KBE Proben fehlt. Diese Daten zeigen zusammen, die Fähigkeit der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten zu erkennen und zu quantifizieren, bakterielle Kontamination im früh - und -Spätstadien der bakteriellen Kontamination. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig3v3.jpg"> 
Abbildung 3 : Bakterielle Erkennung in komplexen Medien. Magnetische Entspannung ΔT2 Daten aus komplexen Medien, einschließlich A) See Wasser und (B) Vollmilch. Ähnlich wie bei den Daten aus der bisherigen PBS-Lösungen, wurde es festgestellt, dass Nachweis von bakteriellen Verunreinigungen empfindlicher im Bereich von 1-20 KBE (Einsätze). Entsprechenden Fluoreszenz Emissionsdaten wurden für die C) Seewasser und D) Milch Proben (Einsätze: Linearität Grundstücke), die zeigten höheren Empfindlichkeit mit zunehmendem KBE zählt. Noch einmal diese Daten belegen die Wirksamkeit, mit der jeder Modalität das andere ergänzt, und überprüfen Sie ihre Fähigkeit, in komplexen Medien funktionsfähig bleibt. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig4v3.jpg"> 
Abbildung 4 : MFnS Spezifität. Die Besonderheit des MFnS wurde getestet mit Herrn Analyse in Nährbouillon Lösungen (A) eine Reihe von bakteriellen Kreuz-Kontaminationen und eine Mischung und (B) Hitze-Inaktivierung enthält E. Coli O157: H7. Wie gezeigt, ist es klar, dass die Nanosensoren wenig bis gar keine Bindung mit ungezielte Bakterien und sind noch in der Lage die Ziel-Bakterien in Gegenwart von anderen Verunreinigungen haben, um sicherzustellen, dass diese Form der Vorführung über wäreBle für den Einsatz in komplexen Medien, die eine Reihe von nicht-pathogenen Bakterienarten enthalten. (C) weitere Besonderheit Tests wurden durchgeführt durch Synthese MFnS mit einem Antikörper Isotype (rote Kreise: Anti - VirusEHEC O111), führte dazu, dass wenig bis keine Bindung im Vergleich zu den O157: H7 Antikörper konjugiert MFnS (schwarze Quadrate). Diese Daten zeigen, dass MFnS nur mit brauchbares Ziel Bakterien reagieren ihre Wirksamkeit als Point-of-Care Diagnostik Plattform weiter zu überprüfen. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16

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Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K Aufrufe.  Pittsburg State University. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Serie: Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Biotechnik

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Chemie

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologie

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular diagnostics. However, traditional PCR is very time-consuming because of the low-temperature variation efficiency. This work proposes a continuous-flow-PCR (CF-PCR) system based on a microfluidic chip. The amplification time can be greatly reduced by running the PCR solution into a microchannel placed on heaters set at different temperatures. Moreover, as capillary electrophoresis (CE) is an ideal way to differentiate positive and false-positive PCR products, a CE system was built to achieve efficient separation of the DNA fragments. This paper describes the process of amplification of Escherichia coli (E. coli) by the CF-PCR system built in-house and the detection of the PCR products by CE. The results demonstrate that the target gene of E. coli was successfully amplified within 10 min, indicating that these two systems can be used for the rapid amplification and detection of nucleic acids.

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

This protocol describes how to build a continuous-flow-polymerase chain system based on a microfluidic chip and how to build a capillary electrophoresis system in the lab. It presents a simple method for the analysis of nucleic acids in the lab.

Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Zusammenfassung

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