Questo lavoro è supportato da K-INBRE P20GM103418, Kansas soia Commissione (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polimero chimica avvio fondo, tutti a SS. Ringraziamo il videografo di università, il signor Jacob Anselmi, per il suo eccezionale lavoro con il video. Ringraziamo anche il signor Roger Heckert e la signora Katha Heckert per il loro generoso sostegno per la ricerca.

1. sintesi e funzionalizzazione di multi-parametrico Magneto-fluorescente nanosensori (MFnS).
<ol><li>Sintesi di ossido di ferro superparamagnetico nanoparticelle (IONPs) <ol><li>per preparare per la sintesi IONP, preparare le seguenti 3 soluzioni: soluzione 1: FeCl 3 (0,70 g) e FeCl 2 H 2 O (2 mL), soluzione 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) in H 2 O (15 mL) e soluzione 3: acido poliacrilico (0,855 g) H 2 O (5ml).</li>
		<li>µ L 90 di 2 M di acido cloridrico (HCl) alla soluzione 1 e quindi miscelare immediatamente con soluzione 2 mentre nel Vortex a 875 giri/min. Quindi aggiungere la soluzione 3. Continuare su vortex per 60 min.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min a 1.620 x g. Centrifugare il surnatante per 20 min a 2.880 x g.</li>
		<li>Purificare il surnatante finale tramite dialisi. Aggiungere il surnatante di un sacchetto di dialisi (MWCO 6 &#8722; 8 K) e posizionarlo in un becher contenente tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.4) e spin bar. Lasciare in ammollo per 12 h, sostituendo con tampone fresco ogni 2-3 h.</li>
	</ol></li> <li>Coniugazione degli anticorpi specifici per la destinazione alla superficie del IONPs <ol><li>preparare le seguenti quattro soluzioni: soluzione a: 5 mg di 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide cloridrato (EDC) in 250 µ l MES [2-(N- buffer di morpholino) ethanesulfonic acido] (0,1 M, pH = 6,8), soluzione b: 3 mg di N-Idrossisuccinimide (NHS) a 250 µ l di tampone MES (0,1 M, pH = 6,8), soluzione c: 5 µ g di IgG1, il mAb di e. coli, in 225 µ l di tampone fosfato salino (PBS) (pH 7.4) e soluzione d: 4 mL di IONP (5,0 mmol) in 1 mL di PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Aggiungere 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) del buffer alla soluzione A, quindi immediatamente aggiungere soluzione alla soluzione D in piccoli incrementi entro 15 s, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.</li>
		<li>Immediatamente iniziare ad aggiungere soluzione B alla soluzione D in piccoli incrementi per un periodo di tre minuti. Mix invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta.</li>
		<li>Aggiungere soluzione C soluzione con incrementi di 5 µ l, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.</li>
		<li>Consentire reazione continuare per 3 ore a temperatura ambiente e poi continuare l'incubazione a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Purificare il IONPs Ab-coniugato risultante tramite colonna magnetica utilizzando PBS (pH = 7,4, finale [Fe] = 3,5 mmol) per rimuovere eventuali anticorpi non coniugate.
		<ol><li>Lavare la colonna magnetica con PBS (1 mL). Fissare la colonna alla piastra magnetica ed aggiungere la soluzione IONP.</li>
			<li>Lavare nuovamente la colonna magnetica con PBS (1 mL). Rimuovere la colonna magnetica dalla piastra magnetica. Aggiungere la colonna di PBS e raccogliere la soluzione. Conservare a 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>incapsulamento di 1,1 fluorescente &#39; - Diottadecilbis - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-colorante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) nel rivestimento (PAA) l'acido poliacrilico dell'anticorpo coniugato IONPs utilizzando un Metodo di diffusione di solvente.
	<ol><li>A 4 mL della IONPs, aggiungere goccia a goccia 2.0 µ l di colorante DiI (2 mmol) in 100 µ l di DMSO con miscelazione continua a 1100 giri/min.</li>
		<li>Dializzare la soluzione risultante (MWCO 6-8 KDa, 12h) contro PBS, creando una soluzione di MFnS finale con una concentrazione di ferro finale di [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol></li> <li>Caratterizzazione di MFnS <ol><li>per l'analisi spettrofotometrica, utilizzare un lettore di piastre per rilevare incapsulato DiI tintura con l'emissione di fluorescenza a 595 nM.</li>
		<li>Dynamic Light Scattering <ol><li>inserire un esempio della soluzione MFnS in un zetasizer per determinare la dimensione media e la carica superficiale della MFnS. 
			Nota: Qui, la dimensione media e la carica superficiale di MFnS funzionale sono stati trovati per essere 77.09 nm e -22,3 mV, rispettivamente.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Batterica Culturing e preparazione di soluzione Stock <ol><li><ol>coltura batterica <li>idratare un pellet liofilizzato (e. coli O157: H7) in 1 mL di brodo nutritivo e quindi aggiungere un ulteriore 5 mL di brodo.</li>
		<li>Applicare 100 µ l di questa soluzione a una piastra di agar e striscia utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, seguito da incubazione a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Dopo 24 h, selezionare una colonia isolata dalla piastra di agar e aggiungerlo a un 15 mL di brodo di coltura. Incubare a 37 ° C per 4-6 h, mentre si controlla il valore di densità ottica (assorbanza a 600 nm).</li>
		<li>Una volta ottenuto un valore di densità ottica di 0,1, interrompere la coltura ed eseguire diluizioni seriali.</li>
	</ol></li> <li>Diluizioni seriali <ol><li>aggiungere 900 µ l di brodo nutritivo per otto microcentrifuga sterile.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica al primo tubo (diluizione 10 -1).</li>
		<li>Prendere 100 µ l dalla prima provetta e aggiungerlo al secondo, per ottenere una diluizione di 10 -2. Proseguire in questo modo per i rimanenti tubi, terminando con una diluizione finale di 10 -8.</li>
		<li>Trasferire 100 µ l da ciascuna provetta per separare le piastre di agar e incubare per 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Il giorno successivo, contare la Colonia formando unità (CFUs) su ogni piatto. Selezionare il piatto con CFUs ~ 100. Utilizzare le diluizioni corrispondente per ulteriori esperimenti (100 µ l = ~ 100 CFUs). 
		Nota: Qui era la diluizione di 10 -6 che ha provocato CFUs ~ 100.</li>
	</ol></li></ol> 3. Rapido rilevamento di E. coli O157: H7 utilizzando MFnS <ol><li>Spike varie soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) con quantità crescenti di stock batterici 10 -6, conseguente CFU varia da 1-100. Aggiungere una quantità costante di MFnS (100 µ l) di queste soluzioni.</li>
	<li>Creare una soluzione di base che contiene solo PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).</li>
	<li>Incubare soluzioni a 37 ° C per 30 minuti e poi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferimento soluzioni individuali per la relaxometer magnetica (0,47 Tesla) e registrare le modifiche in tempi di rilassamento (T2) riguardante il CFUs in ogni soluzione.
	<ol><li>Per registrare le modifiche nei valori di T2, iniziare misurando il valore di T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS.
		Relaxometer <ol><li>posto la soluzione in magnetico. Aprire il rispettivo software, selezionare il &#34; rilassamento T2 &#34; impostazione e premere &#34; misura. &#34;</li></ol></li> <li>dopo la raccolta della linea di base T2, misurare i valori di T2 delle soluzioni aggiuntive che sono stati diluiti con vari concentrazioni di batteri. 
		Nota: Il cambiamento in T2 è equivalente al basale T2 sottratto dal T2 spiked.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere i campioni dalla relaxometer magnetica e centrifugare le provette a 2880 x g per 10 min.</li>
	<li>Decantare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 100 µ l di PBS (1 X, pH 7.4).</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l di ogni risospensione di una piastra a 96 pozzetti e intensità di fluorescenza record a 595 nM. 
	Nota: Test può essere ripetuto utilizzando solventi vari, tra cui Lago di acqua, latte e altri come descritto nella sezione risultati</li></ol>

<ol>
	<li>Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens:+principles,+applications,+advantages+and+limitations.">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front Microbiol. 5, 770 (2014).</li><li>Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+water+resources+by+pathogenic+bacteria.">Contamination of water resources by pathogenic bacteria.</a> AMB Express. 4, 51 (2014).</li><li>Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. 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B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+bead-based+multiplex+PCR+assay+for+combined+subtyping+and+oseltamivir+resistance+genotyping+(H275Y)+of+seasonal+and+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).</li><li>Alvarez, M. 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J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+surface+plasmon-enhanced+fluorescence+spectroscopy+biosensor+for+ultrasensitive+detection+of+E.+coli+O157:H7.">Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7.</a> Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+visual+detection+of+highly+pathogenic+Streptococcus+suis+serotype+2+isolates+by+use+of+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification.</a> J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).</li><li>Han, F., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+potentially+virulent+Vibrio+vulnificus+strains+in+raw+oysters+by+quantitative+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+pathogenic+bacteria+and+screening+of+phage-derived+peptides+using+microcantilevers.">Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers.</a> Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).</li><li>Banerjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Magneto-fluorescent+Nanosensors+for+the+Ultrasensitive+Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7.">Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7.</a> ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).</li><li>Shelby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+magnetic+relaxation+nanosensors:+an+unparalleled+&amp;#34;spin&amp;#34;+on+influenza+diagnosis.">Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled &amp;#34;spin&amp;#34; on influenza diagnosis.</a> Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).</li><li>Bui, M. 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A., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-enhanced+Raman+scattering+based+ligase+detection+reaction.">Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction.</a> J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+bacteria+quantification+using+immunomagnetic+separation+and+electrochemical+detection+of+guanine-labeled+secondary+beads.">Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads.</a> Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).</li><li>Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Photothermal+and+Antibiotic+Killing+of+Biofilm-Associated+Staphylococcus+aureus+Using+Targeted+Antibiotic-Loaded+Gold+Nanoconstructs.">Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs.</a> ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).</li><li>Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+inhibition+assay+for+the+detection+of+E.+coli+O157:H7+using+surface+plasmon+resonance.">Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+bioassay+for+single+bacterial+cell+quantitation+using+bioconjugated+nanoparticles.">A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).</li></ol>

L'applicazione ha dimostrato di questa nanotecnologia non è stato ancora approvato dalla FDA.

Questo protocollo è stato progettato per produrre completamente funzionale MFnS semplicemente come possibile. Tuttavia, ci sono molti punti chiave in cui alterazione del protocollo può essere utile, a seconda dell'obiettivo finale dell'utente. Ad esempio, l'uso di anticorpi differenti consentirebbe per il targeting di molti altri agenti patogeni. Inoltre, questo protocollo non è limitato all'uso di anticorpi come molecole di targeting. Qualsiasi molecola che ha affinità di legame specifico per agenti patogeni bersaglio, come recettori di host, può essere utilizzato anche come molecole di targeting. Purché la molecola targeting è un'ammina primaria o gruppo alcolico, o possa essere funzionalizzata per avere uno, può essere coniugato alla superficie delle nanoparticelle di ossido di ferro secondo la chimica di coniugazione di EDC/NHS elencata nel protocollo. In secondo luogo, la quantità di MFnS utilizzato in ogni soluzione di rilevamento può essere variata. È importante usare abbastanza in modo che il valore di T2 per la soluzione di base (contenente solo il solvente e il nanosensore senza agente patogeno bersaglio) è nella gamma di 100-250 ms. se il valore basale è inferiore a 100, allora i cambiamenti nei valori di T2 sarà meno sensibili , a causa di una sovrabbondanza di nanosensori. Per aumentare il valore di T2 della linea di base, ridurre la quantità di nanosensori in soluzione. Se, tuttavia, la linea di base è superiore a 250, diventa eccessivamente sensibile, e falsi positivi possono diventare più probabile. Per questi motivi, si consiglia di puntare ad una soluzione di base valore T2 tra 100-250 ms.
Attuali limiti del presente protocollo, se si considera il suo uso come una diagnostica point-of-care, sono la dipendenza la corrente relaxometer magnetico benchtop. Mentre stabile ed efficace, questa piattaforma di rilassamento magnetico potrebbe essere ridotto nelle dimensioni per aumentare la portabilità. Questo aumenterebbe la facilità con cui questa piattaforma potrebbe essere utilizzata in ambienti diversi, come alle fonti d'acqua o nei mercati di generi alimentari, per lo screening batterico in loco efficace. Questo potrebbe anche ridurre il costo di questa macchina, rendendola più fattibile per il rilevamento del patogeno di point-of-care.
Per quanto riguarda l'individuazione della malattia diagnosi e patogeno nelle impostazioni di risorse limitate, questa piattaforma ha il potenziale per essere più efficace del patogeno diagnosi tecniche correnti utilizzati oggi, tra cui PCR ed ELISA. Mentre queste tecniche tradizionali hanno dimostrato di essere in gran parte efficiente, sono altamente complesso, costoso e lento. Come tale, c'è bisogno di una piattaforma diagnostica accurata che poteva essere sviluppato per l'uso nelle impostazioni di risorse limitate per il rilevamento di point-of-care degli agenti patogeni e diagnosi della malattia. Questa piattaforma è relativamente semplice da usare, conveniente e rapida. A parte costi di messa in servizio delle macchine richieste (lettore di piastra e relaxometer), il MFnS reale sono relativamente a buon mercato e molto stabile. Inoltre, l'insieme di valori di T2 è semplice e non richiede un tecnico di laboratorio professionale.
In futuro, sarà perseguito collaborazione con gli ingegneri chimici e biologici per la progettazione di un dispositivo più portatile, tenuto in mano che possa essere utilizzato per entrambi il rilevamento magnetico e fluorescente di contaminazione batterica utilizzando MFnS. Lo sviluppo di un dispositivo più piccolo contribuirebbe a ridurre i costi associati a questa piattaforma di rilevamento ulteriormente e aumentare la sua efficacia nel campo. Inoltre, questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzato per analizzare l'efficacia di sviluppare agenti biocidi. Come illustrato nella nostra banca dati, nostri MFnS erano solo in grado di legarsi con targeting per vivere i batteri e non prodotto poco o nessun segnale quando incubati con calore-ucciso i batteri. Sulla base di questo, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzato per testare l'efficacia dei candidati di biocida, e abbiamo intenzione di esplorare questo ulteriormente in futuro.
Punti critici in questo protocollo sono la sintesi iniziale di MFnS e raccolta dei dati di T2. È importante purificare correttamente il MFnS per garantire che gli anticorpi digalleggiante non interferiscano con raccolta dati T2. Inoltre, la quantità di MFnS collocato in ogni campione deve essere coerenza, come cambiamenti nella concentrazione MFnS modificherà i valori di T2, rischiando di falsi positivi/negativi.
In conclusione, MFnS sono un nuovo passo avanti nella lotta contro la contaminazione batterica e sarà ulteriormente sviluppato come il targeting di ulteriori agenti patogeni è raggiunto e il design più portatile macchine sono perseguita. Il basso costo e bassa complessità associati all'uso di MFnS li rende un valido candidato per essere utilizzato per il rilevamento in loco di contaminazione batterica. Mentre la sintesi di questi nanosensori richiede un'attenta preparazione, loro uso effettivo è relativamente semplice e dà loro il potenziale di ridurre di origine alimentare e le malattie a base acquosa. Con ulteriore sviluppo, l'implementazione di questi nanosensori può essere visti nello screening di serbatoi d'acqua e cibi nei centri di confezionamento, punti vendita e forse anche case di prodotti commercialmente.

La presenza persistente di contaminazione batterica in entrambi il cibo prodotto commercialmente e fonti d'acqua ha creato la necessità di piattaforme diagnostiche sempre più rapide e specifiche. 1 , 2 alcuni dei più comuni contaminanti batterici responsabili della contaminazione di cibo e acqua sono dei generi Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus ed Escherichia. 3 , 4 contaminazione batterica di questi agenti patogeni spesso provoca sintomi quali febbre, colera, gastroenterite e diarrea. 4 contaminazione delle fonti d'acqua spesso ha effetti drastici e negativi sulle comunità senza accesso all'acqua sufficientemente filtrata e contaminazione degli alimenti ha portato ad un gran numero di malattie e sforzi di richiamo del prodotto. 5 , 6
Al fine di ridurre l'occorrenza di malattie causate dalla contaminazione batterica, ci sono stati una serie di sforzi per sviluppare metodi che acqua e cibo possono essere efficientemente acquisiti prima della vendita o consumo. 3 tecniche come la PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 (amplificazione isotermica mediata da loop LAMPADA),13,14 , tra gli altri,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente sono state usate per il rilevamento di vari agenti patogeni. Rispetto al tradizionale batteriche metodi di coltura, queste tecniche sono molto più efficiente per quanto riguarda la specificità e l'ora. Tuttavia, queste tecniche ancora lottano con falsi positivi e negativi, procedure complesse e costo. 1 , 3 , 25 è per questo motivo che multiparametriche magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) sono proposti come metodo alternativo per rilevazione batterica.
Questi nanosensori unicamente insieme coppia rilassamento magnetico e modalità fluorescente, permettendo per una piattaforma dual-rilevazione che sia rapida e accurata. Utilizzando e. coli O157: H7 come contaminante campione, la capacità di MFnS per rilevare appena 1 CFU in minuti è dimostrata. Patogeno-specifiche anticorpi sono usati per aumentare la specificità e la combinazione delle modalità sia magnetiche che fluorescente permette per la rilevazione e quantificazione di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di bassa e alta contaminazione. 16 nel caso di contaminazione batterica, i nanosensori saranno sciame intorno i batteri a causa della capacità di targeting degli anticorpi patogeni specifici. L'associazione tra i nanosensori magnetico e batteri limita l'interazione tra il nucleo di ferro magnetico e i protoni dell'acqua circostante. Questo provoca un aumento i tempi di rilassamento T2, come registrato da una relaxometer magnetica. Come la concentrazione di batteri in soluzione aumenta, i nanosensori disperdono con l'aumento del numero di batteri, con conseguente più bassi valori di T2. Al contrario, l'emissione di fluorescenza aumenterà in proporzione con la concentrazione dei batteri, dovuto il numero aumentato di nanosensori direttamente legati al patogeno. Centrifugazione dei campioni e l'isolamento del pellet batterico, conserverà solo le nanoparticelle direttamente collegate ai batteri, rimuovendo qualsiasi nanosensori digalleggiante e direttamente correlare l'emissione di fluorescenza con il numero di batteri presenti nella soluzione. Una rappresentazione schematica di questo meccanismo è rappresentata nella Figura 1.
Questa piattaforma di MFnS è stata progettata con lo screening di point-of-care nella mente, con conseguente caratteristiche portatile e a basso costo. MFnS sono stabili a temperatura ambiente e sono necessarie solo in concentrazioni molto basse per accuratezza nel rilevamento di contaminanti batterici. Inoltre, dopo la sintesi, uso del MFnS è semplice e non richiede l'utilizzo di professionisti qualificati nel settore. Infine, questa piattaforma diagnostica permette per il targeting altamente personalizzabile, fornendo un mezzo da cui questa una piattaforma può essere utilizzata per rilevare gli agenti patogeni di tutti i tipi, in molti contesti diversi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ferrous Chloride Tetrahydrate</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">I90-500</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ferric Chloride Hexahydrate</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td>I88-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ammonium Hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">A669S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Polyacryllic Acid</td>
			<td style="width:156px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:197px;">323667-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">EDC</td>
			<td style="width:156px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">NHS</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC157270250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-E. coli O111 antibody&#160;</td>
			<td style="width:156px;">sera care</td>
			<td>5310-0352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Abcam</td>
			<td style="width:197px;">ab75244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DiI Stain</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nutrient Broth</td>
			<td style="width:156px;">Difco</td>
			<td style="width:197px;">233000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td>
			<td style="width:156px;">ATCC</td>
			<td style="width:197px;">700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Magnetic Relaxomteter&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Bruker</td>
			<td style="width:197px;">mq20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Zetasizer</td>
			<td style="width:156px;">Malvern</td>
			<td style="width:197px;">NANO-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plate Reader&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Tecan</td>
			<td style="width:197px;">Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Magnetic Column&#160;</td>
			<td style="width:156px;">QuadroMACS</td>
			<td style="width:197px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:156px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:197px;">5804 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">13-100-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Floor Model Shaking Incubator</td>
			<td style="width:156px;">SHEL LAB</td>
			<td style="width:197px;">SSI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:156px;">Metler Toledo</td>
			<td style="width:197px;">ME104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Open-Air Rocking Shaker</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">02-217-765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enteroemorragica Escherichia coli O157: H7 è stato collegato ad entrambi a base acquosa e malattie di origine alimentare e resta una minaccia nonostante i metodi di screening di cibo e di acqua utilizzata attualmente. Mentre i metodi convenzionali di rilevazione batterica, come reazione a catena della polimerasi (PCR) e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) in grado di rilevare specificamente patogeni contaminanti, richiedono preparazione dei campioni ampi e lunghi periodi di attesa. Inoltre, queste pratiche richiedono impostazioni e strumenti di laboratorio sofisticati e devono essere eseguite da professionisti qualificati. Nel presente accordo, un protocollo è proposto per una più semplice tecnica diagnostica che caratterizza la combinazione unica di parametri magnetici e fluorescente in una piattaforma basata su nanoparticelle. La proposta multiparametrica magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) in grado di rilevare e. coli O157: H7 contaminazione con appena 1 unità formanti colonie presenti in soluzione entro meno di 1 h. Inoltre, la capacità di MFnS di rimanere altamente funzionale in supporti complessi come latte ed acqua del lago è stata verificata. Ulteriori specificità analisi inoltre sono state usate per dimostrare la capacità di MFnS di rilevare solo i batteri specifici, anche in presenza di specie batteriche simili. L'abbinamento delle modalità magnetica e fluorescente permette per la rilevazione e la quantificazione di contaminazione da agenti patogeni in una vasta gamma di concentrazioni, esibendo le sue alte prestazioni nella rilevazione di contaminazione sia precoce e tardiva-stadio. L'efficacia, convenienza e portabilità della MFnS li rendono un candidato ideale per lo screening di point-of-care per contaminanti batterici in una vasta gamma di impostazioni, dai bacini acquatici per gli alimenti in commercio confezionati.

Nella Figura 1è rappresentato il meccanismo di azione di MFnS. Il clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici interferisce con le interazioni tra i nuclei del MFnS e i nuclei di idrogeno circostante. A seguito di questo rilassamento clustering, magnetico i valori aumentano. Man mano che aumenta la concentrazione di contaminanti batterici, clustering riduce, e il cambiamento nei valori di T2 diminuisce. Pertanto, l'aggiunta di una modalità fluorescente è fondamentale. La concentrazione batterica aumenta, aumenta la forza del segnale fluorescente prodotta da MFnS, consentendo la rilevazione sensibile di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta.
In seguito il protocollo,16 MFnS sono stati sintetizzati e analizzati in soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4). La modalità iniziale utilizzata per il rilevamento, rilassamento magnetico, è stata utilizzata per registrare le modifiche nei valori di T2. Conformemente al protocollo, i campioni sono stati poi centrifugati, pellet sono state risospese e fluorescenza dati sono stati raccolti. Il corrispondente ΔT2 e valori di emissione di fluorescenza sono presentati nella Figura 2. Come illustrato, il valore di ΔT2 era più grande alle concentrazioni più basse di contaminazione batterica e raggiunto la saturazione a circa 20 CFU. L'emissione di fluorescenza, d'altra parte, è diventato più preciso alle &#62; 20 CFU, l'importanza di combinare queste due modalità di visualizzazione. A seguito di queste analisi primarie, prove simili sono stati condotti in supporti complessi, compresi latte e acqua del lago. Questo è stato fatto per garantire che i nanosensori sono ancora efficaci nei mezzi di comunicazione più complesse. I dati raccolti da queste analisi sono presentati nella Figura 3 e sono molto simili per le analisi condotte in PBS. Ciò consente di verificare che questi nanosensori rimangano efficaci nel complesso media.
Dopo aver confermato che MFnS potrebbe rilevare la presenza di contaminanti batterici nei media sia semplici che complessi, una serie di test poi sono stati condotti per determinare il livello di specificità mantenuto dai nanosensori. A tal fine, MFnS sono state incubate in soluzioni contenenti batteri bersaglio, batteri bersaglio calore-ucciso, non bersaglio batteri (non patogeni di e. coli e S. typhimurium) e una miscela. Questa era solo un'analisi della specificità, la raccolta di dati di rilassamento magnetico da solo era sufficiente, e i dati corrispondenti sono presentati nella Figura 4. Come si può vedere, il MFnS associato solo a vivere e. coli O157: H7 e non per gli altri batteri calore-ucciso o non bersaglio. Questo livello di specificità è attribuito agli anticorpi coniugati targeting e conferma ulteriormente che MFnS sarà efficace nel rilevare contaminanti patogeni specifici, anche quando in presenza di specie di batteri non patogeni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig1.jpg"> 
Figura 1 : Meccanismo di rilevamento di magneto-fluorescente. Rappresentazione schematica della sintesi di MFnS e il meccanismo dual-modal di rilevazione batterica. Dopo un periodo di incubazione breve (30 min), MFnS sono in grado di rilevare con sensibilità i batteri di destinazione tramite una combinazione di risonanza magnetica e l'emissione di fluorescenza. Clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici provoca cambiamenti nei valori di rilassamento magnetico, rilevabili da una relaxometer magnetica. Inoltre, i segnali fluorescenti possono essere raccolti da MFnS direttamente associato a contaminanti batterici. Questo fornisce una piattaforma dual-modal rilevamento capace di contaminanti batterici di rilevamento in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta. 16 questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig2v3.jpg"> 
Figura 2 : Proof of Concept. A) dati magnetico relax (ΔT2) in primo luogo è stato raccolto da diluizioni di e. coli O157: H7 (1-100 CFU) in solvente PBS (1 X, pH = 7.4). Signor rilevazione dei batteri era altamente sensibile a bassa conta CFU (inserto: che vanno da 1-20 CFU). Tuttavia, le letture di ΔT2 è diventato saturo alle più alte concentrazioni batteriche (&#62; 20 CFU), che indica che il signor è più prezioso per la rilevazione e la quantificazione della fase iniziale di contaminazione batterica. B) dati di emissione di fluorescenza dallo stesso spillo soluzioni PBS (inserto: trama di linearità). I risultati hanno mostrato che il metodo di rilevazione di fluorescenza è più sensibile al più alto numero di CFU, mentre è privo di sensibilità per Bassi campioni di CFU. Insieme, questi dati dimostrano la capacità di modalità sia magnetiche che fluorescente per rilevare e quantificare la contaminazione batterica in precoce e tardiva-fasi di contaminazione batterica. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig3v3.jpg"> 
Figura 3 : Rilevazione batterica nel complesso Media. Rilassamento magnetico ΔT2 dati raccolti dai mezzi più complessi, compreso A) Lago acqua e B) di latte intero. Simile ai dati raccolti dalle precedenti soluzioni di PBS, è stato notato che la rilevazione di contaminanti batterici era più sensibile nella gamma di 1-20 CFU (inserti). Corrispondenti dati di emissione di fluorescenza è stato raccolto per la C) acqua del lago e D) campioni di latte (inserti: trame di linearità), che ha mostrato maggiore sensibilità con l'aumento del numero di CFU. Ancora una volta, questi dati dimostrano l'efficacia con cui ogni modalità complementare a altro e convalidare la loro capacità di rimanere funzionale in supporti complessi. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig4v3.jpg"> 
Figura 4 : MFnS specificità. La specificità del MFnS è stata testata utilizzando analisi signor nelle soluzioni di brodo nutritivo contenente A) un numero di croce-contaminanti batterici e una miscela e B) calore inattivanti Escherichia coli O157: H7. Come illustrato, è chiaro che i nanosensori non hanno poco o nessuna associazione con batteri non mirati e sono ancora in grado di rilevare i batteri di destinazione in presenza di altri contaminanti, assicurando che questa forma di screening sarebbe viaBLE per uso nei mezzi di comunicazione complessi che contengono un numero di specie di batteri non patogeni. C) ulteriore specificità test è stato condotto mediante la sintesi di MFnS con un isotipo dell'anticorpo (cerchi rossi: Anti -Escherichia coli O111), che ha provocato poco a nessuna associazione rispetto alla MFnS di anticorpo coniugato O157: H7 (quadrati neri). Questi dati dimostrano che MFnS solo reagire con batteri bersaglio praticabile, ulteriormente verificando la loro efficacia come una piattaforma diagnostica point-of-care. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16

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Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K Views.  Pittsburg State University. L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.