Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.
Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, fechados sapatos).
1. fabricação e caracterização de modificado eletrodo usando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparação e caracterização de PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Rapidamente, adicionar 10 mL de solução de citrato de sódio (38,8 mM) para 100 mL de solução de Ácido cloroáurico aquosa (1 mM) a ferver e esfriar até a temperatura ambiente. Observe as alterações na cor da solução de AuNPs preparado, que começa como amarelo, alterações enegrecido e finalmente termina como vermelho rubi escuro.</li>
		<li>Coloque as bolinhas PLA em um molde de aço inoxidável para o processo de fusão e pré-aqueça-os a uma temperatura de 190 ° C por 10 min. siga com o procedimento de prensagem: colocá-los sob uma pressão de 2,2 MPa para 1 min como parte da preparação de folha PLA. A folha PLA estará pronta para uso após arrefecimento para cerca de 3 h.</li>
		<li>Mexendo vigorosamente, dissolva 0,68 mg das folhas de PLA em 5 mL de clorofórmio à temperatura ambiente. Misture o PLA dissolvido com 10 mL da solução de AuNPs previamente preparada e homogênea, misture-o à temperatura ambiente. As misturas homogéneas podem então ser denotadas como PLA-AuNPs e caracteriza-se usando o UV-Vis, XRD, temperatura e FESEM com EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação e caracterização de eletrodos modificados carbono serigrafado Nota: A SPCE utilizado neste estudo é composto por um sistema do três-elétrodo: um contador elétrodo, um carbono trabalho e um eletrodo de referência Ag/AgCl.<ol>
<li>Rapidamente, Pipetar 25 µ l da solução homogênea de PLA-AuNPs para a SPCE e, em seguida, ar secá-la por 24 h antes da utilização.</li>
		<li>Eletroquimicamente caracterizam os eletrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, em cianeto de potássio ferro (K3[Fe(CN)6]-3/4 -) para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. desenvolvimento do Biosensor eletroquímico DNA
<ol><li>
Preparação de sonda Nota: As sequências do DNA complementar e ssDNA sonda foram escolhidas com base na informação do centro nacional para o banco de dados Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Compra oligonucleotides sintéticos (20-mer ssDNA sonda, DNA complementar mer-20, 20-mer incompatível DNA e DNA não-complementar 21-mer) como pó liofilizado de laboratórios comerciais, com base na seguintes sequências: thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementar: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - um-base DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - três bases DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA não-complementar: 3 ' 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Prepare as soluções de todos os oligonucleotides (100 µM) usando uma solução estéril e TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), dividida em parcelas analíticas. Manter a-4 ° C e então fazer as diluições apropriadas apenas antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Otimização de imobilização e hibridação Nota: Um SPCE modificado com PLA-AuNPs, denotado como SPCE/PLA-AuNPs, foi usado para este estudo e um método de fundição gota foi usado para a imobilização de DNA e a hibridação.<ol>
<li>Primeiro, imobilizar 25 µ l de thiolated ssDNA sonda sobre a SPCE/PLA-AuNPs e então ar secar por 24 horas à temperatura ambiente, depois que ele vai ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar a otimização da condição imobilização por meio de três fatores: a concentração do ssDNA (variando de 0,2 a 1,4 µM), tempo (variando de 30 a 210 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipete 25 µ l do DNA complementar sobre a superfície da SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para realizar o evento de hibridação, após o qual pode ser finalmente denotada como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determine a otimização da condição da hibridação através de dois fatores de tempo (variando de 5 a 30 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Mergulhe o imobilizado e eletrodos hibridizados em 20 µM MB por 30 min. remover o DNA não-especificamente adsorvido e excesso MB por lavagem com 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada. Medida da corrente de pico de redução MB usando a técnica DPV. Executar a medição de DPV usando PBS 0,1 M (pH 7) não contendo nenhum indicador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização do biosensor DNA fabricado
	<ol>
<li>Mergulhe a SPCE/PLA-AuNPs em µM de 20 MB por 30 min, lavar com 0,5 M de ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada antes da medição. Segui um procedimento semelhante para todas as interações, incluindo a sonda DNA, DNA complementar, DNA incompatível e amostras de DNA não-complementares.</li>
		<li>Medir a redução eletroquímica. Nota: Nós medimos DPV usando um Autolab comercialmente fabricado com software de interface. As medições de DPV da redução eletroquímica MB realizada em um potencial que varia de -0,5 V a 0,25 V, com um potencial de passo de 0.005 V, amplitude de modulação de 0,05 V e uma taxa de varredura de 7,73 mVs-1 em PBS 0,1 M (pH 7), não contendo nenhum indicador. A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade térmica do biosensor DNA fabricado foram mais estudados. Resultados relatados foram apresentados como média de valor de medições em três repetições.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. validação do Biosensor DNA fabricado usando amostras reais
<ol><li>Preparação de cepas bacterianas
	<ol>
<li>Selecione amostras bacterianas baseadas sua contaminação significativa de frutos do mar31,32 . Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referência e 8 outras estirpes bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, enterite de Salmonella, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse Vibrio alginolyticus) da origem alimentar comum patógeno foram empregados para a validação de biosensor eletroquímica do DNA neste estudo.</li>
		<li>Realizar uma rotina sub-cultura de estirpes bacterianas em seu respectivo agar quinzenalmente para manter a sua viabilidade, consulte a tabela 1 para condições de cultura.</li>
		<li>Manter a preservação a longo prazo das cepas bacterianas em seus respectivos caldos crescentes contendo 20% (v/v) glicerol a-80 ° C, como glicerol protege bactérias, impedindo a formação de cristais de gelo que podem danificá-los durante o processo de congelamento. Em seguida, inocule um loop da cultura de pilha bacteriana conservados em estoque de glicerol para os respectivos caldos. Incube os caldos de acordo com seu respectivo crescimento tempo e temperatura, quando precisar de reviver as bactérias.</li>
		<li>Determine a quantidade de V. parahaemolyticus células usando uma placa de expansão técnica33, um padrão e um método conhecido para enumerar derivados de uma série de diluições de microorganismos.<ol>
<li>Cultura V. parahaemolyticus trypcase soja caldo (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C, num estado de agitação 140-rpm. Em seguida, transferir 1 mL de cultura de células de bactérias para 9ml de TSB + 3% NaCl para obter um fator de diluição 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita essa etapa nove vezes para obter uma série completa de factor de diluição até 10-10 . Em seguida, espalhe 0,1 mL de cada fator de diluição (a partir de 10-1 a 10-10) na placa de ágar seletivo do Vibrio uma colônia contando, respectivamente. Incube as placas incubadas a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Use um contador de colônia para contagem das colónias individuais e depois volta-calcular (contagem a quantidade CFU/pipetado x fator de diluição) para obter uma unidade formadoras de colônia por mililitro densidade (CFU mL-1). Derive a concentração da colônia formando unidades (CFUs) nas suspensões celulares de bactérias do terreno de calibração do UFC mL-1 contra absorvância.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do ensaio do PCR
	<ol>
<li>Extrair DNA genômico seguindo uma modificada fervido lise procedimento34. Primeira, raia uma bacterianas individuais Coe em meios de ágar e inoculá-lo na mídia de caldo, seguida por incubando-lo em sua condição de crescimento relativo, um 140 rpm tremendo condição.</li>
		<li>Pipete uma cultura de 1 mL de caldo de carne para um tubo de centrífuga de micro. Centrifugar-isto a 4830 x g e 4 ° C, durante 1 min obter Pelotas. Use cerca de 500 µ l de tampão estéril de TE para re-suspensão com a pelota. Segure a suspensão resultante durante 10 minutos no 98 ± 2 ° C em um bloco de aquecimento e chill-lo imediatamente a-18 ° C por 10 min lisar as células e liberar o DNA.</li>
		<li>Centrifugar o DNA genômico a 4830 x g e 4 ° C por 3 min obter uma suspensão clara e manter o sobrenadante a-20 ° C para utilização posterior. Use uma medida de biophotometer com absorção de UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as proteínas de absorção de luz de comprimento de onda) para determinar a concentração e pureza do extraído DNA genômico e então identificar todas as estirpes utilizando ensaios bioquímicos padrão35 e verificá-los por 16S rRNA gene sequenciamento36. Finalmente, desnaturar o DNA genômico a 92 ° C por 2 min e resfriá-lo rapidamente em água gelada antes da aplicação para o biosensor.</li>
		<li>Confirmar a presença de V. parahaemolyticus usando PCR para o gene toxR-alvo. Execute esse procedimento em um thermocycler usando um par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Otimize a amplificação por PCR em um volume total de reação de 25 μL, consistindo de água esterilizada (15,5 µ l), tampão (5 µ l), primeira demão (1 µ l, 10 µM), dNTP mix (1 µ l), modelo de DNA (2 µ l) e Taq DNA polimerase (0,2 µ l, 10x).</li>
		<li>Misture os componentes bem e organizar a amplificação por PCR da sequência de destino em um thermocycler programado para 30 ciclos de amplificação. Em nosso estudo, cada ciclo consistiu em três etapas de reações , ou seja,., desnaturação inicial (94 ° C, 3 min), seguido de 30 ciclos de desnaturação (94 ° C, 1 min), recozimento (63 ° C, 1,5 min) e extensão (72 ° C, 1,5 min), seguido pela extensão final (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Determine os produtos amplificados e seus tamanhos através de electroforese em gel de agarose 1,5%. Capture as imagens de gel com um sistema de gel-documentação produzidos comercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras de berbigão
	<ol>
<li>Obter amostras frescas. Nota: Nosso berbigão fresco (Anadara granosa) foram obtido a partir do mercado molhado em Serdang, Selangor e rapidamente trazido para o laboratório em uma caixa de gelo mais fresca para análise. Divida as amostras em 2 grupos, ou seja, o grupo tratado e não tratado, assumindo que o berbigão foram colhida uniformemente desde o início da safra até colocá-los em armazenamento frio.</li>
		<li>Pré-tratamento berbigão no grupo tratado, armazenando-os em-20 ° C por 24 h, seguido de exposição à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA. Nota: A temperatura de congelamento e exposição aos raios UV, usado para a controlada grupo mata ou pelo menos limita a naturalmente acumular V. parahaemolyticus nas amêijoas. Não aplica um regime mais elevado de pasteurização de 70 ° C como o objetivo da condição controlada neste estudo é imitar a situação real das amêijoas frescas. Entretanto, analise amostras diretamente do grupo não tratado sem qualquer tratamento prévio, assim que eles chegam no laboratório.</li>
		<li>Subcultura de uma estirpe de V. parahaemolyticus ATCC 17802 em TSB (3% NaCl). Determinar o nível de células viáveis em inóculo através de chapeamento de diluições apropriadas de TSB (3% NaCl) na CA a fim de obter um inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berbigão em água destilada e esfrega-lo livre de sujeira antes de usar a pinça estéril em um fluxo laminar para remover os tecidos da casca.</li>
		<li>Homogeneizar a cerca de 10 g de amostras de tecido de berbigão com um homogeneizador em 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) por 60 s. adicionar uma quantidade conhecida de V. parahaemolyticus para 9 mL do caldo para as amostras cravados de amostra homogeneizada. Use as amostras bilirrrubina como controlo negativo. Estimar a contagem de células de V. parahaemolyticus cravado para as amostras de berbigão por chapeamento 0,1 mL das amostras na CA, e posteriormente, Pipetar 1 mL de amostras em um tubo de microcentrifugadora de DNA da amostra extração, para ser usado na biosensor e ensaio PCR.</li>
		<li>Extrai o DNA genômico do V. parahaemolyticus das amostras cravadas e bilirrrubina seguindo um modificado de fervido lise procedimento36. Finalmente, determinar a concentração de DNA e pureza, usando uma medição do Fotômetro de bio com absorção UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as comprimento de onda de absorção de proteínas).</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.
Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de um biosensor eletroquímico sensível e seletivo do DNA, é a otimização da condição imobilização e hibridação. Neste trabalho, usamos MB como o complexo de redox. Existem vários princípios de interações MB-DNA: (i) pela interação eletrostática da carga catiônica MB com a carga aniônica espinha dorsal de fosfato do ssDNA e dsDNA; (ii) pela intercalação MB através de inserção bem sucedida de MB entre alternando pares de bases G-C em dsDNA; (iii) por ligação covalente à extremidade do ssDNA alvo, que produz uma densidade baixa rótulo (um ou dois MB moléculas por uma cadeia de DNA); e (iv) por interações MB com uma base em ssDNA desvinculado da guanina. Nós aplicamos o quarto princípio, que identifica com precisão V. parahaemolyticus da Cruz reatividade de bactérias e de berbigão fresco. Após oxidação de particular interesse, houve uma forte afinidade entre MB e ssDNA. Hibridação do ssDNA com sua sequência complementar substitui as moléculas MB ligadas e assim reduz o sinal.
A série de resultados experimentais apresentados acima enfoca o desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. O primeiro passo é a síntese e caracterização de polilático estabilizada ácido ouro nanopartículas (PLA-AuNPs) para a modificação do eletrodo (figuras 1-6 e tabela 2). A qualidade das nanopartículas de ouro foi avaliada usando espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), difração de raios x (XRD), microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FESEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), voltametria cíclica (CV) e Análise de impedância. A segunda parte do desenvolvimento envolveu uma caracterização eletroquímica do eletrodo modificado (figuras 7-12 e tabela 3-4) que determinou o reforço bem sucedido do eletrodo modificado em relação o eletrodo nu em termos de detectar o evento de hibridização.
A terceira etapa do DNA baseado biosensor desenvolvimento baseou-se na otimização das condições experimentais do evento hibridação e a aplicação do biosensor desenvolvido para a detecção do patógeno real (figuras 13-20). O evento de hibridização que determinou o sucesso da detecção do patógeno foi avaliado utilizando voltametria de pulso diferencial (DPV). A existência positiva do patógeno alvo foi indicada através da redução da corrente. A sensibilidade do biosensor desenvolvido foi avaliada através da construção de um plano de calibração e o cálculo de LOD (Figura 15). O biosensor fabricado foi capaz de distinguir especificamente V. parahaemolyticus de outros patógenos com base em diferentes níveis de redução atual (figuras 17 e 18). A avaliação da viabilidade do biosensor desenvolvido para detecção de V. parahaemolyticus em amostra de alimentos real é apresentada nas figuras 19 e 20 , e a existência positiva do patógeno alvo é indicada pela redução da corrente . O desenvolvimento bem sucedido de biossensores baseados em DNA é altamente dependente da seleção de sondas de DNA, realce do eletrodo modificado, bem como a otimização das condições experimentais. A sonda de DNA aqui foi adaptada da obra anterior de Nakano67. Aprimoramento dos eletrodos modificados foi realizado com nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático para permitir a padronização do nanosize. A função de nanopartículas de ouro como electro material catalítico68 e agir para aumentar a taxa de transferência do elétron e também fornecer uma superfície na qual a sonda de DNA de âncora. Os parâmetros experimentais foram otimizados em termos de tempo de incubação e temperatura que é crucial para o DNA para formar a frente e verso. A temperatura de hibridização afeta a separação entre a adsorção não específica e este aumenta a seletividade do sensor. Tempo de incubação da hibridação aumenta as chances da formação frente e verso. O procedimento de imobilização deve ser otimizado a fim de certificar que a sonda de DNA serão na orientação adequada para a formação de frente e verso para o formulário.
Tabela 5 compara uma amostra de recentemente desenvolvido eletroquímica DNA biosensores69,70,,71,72,73,74,75 ,. Biosensing baseado em DNA é um método promissor para substituir técnicas moleculares com base, embora existam algumas limitações que devem ser abordadas antes que o método pode ser portátil o suficiente para o uso no local. A principal limitação é a extração de DNA de processamento de amostra como a pureza e a quantidade de DNA extraído no site não é provável que seja tão bom como que extraído pelo método padrão em laboratório. Se, no entanto, uma alternativa promissora a electroforese do gel e PCR pode ser substituído com sistema de pré-tratamento da amostra como microfluidic.
Biossensores baseados no DNA são potencialmente útil para muitas aplicações, incluindo o diagnóstico médico, monitoramento ambiental e acompanhamento de comida. Esta técnica permitirá monitoramento on-line de processos de controle de qualidade, bem como point-of-care monitoração de pacientes. A portabilidade do sistema sensor todo permitirá a descentralização dos processos de diagnósticos onde o consumidor pode usar o sistema de detecção no conforto de sua casa.

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.
V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.
Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminoethane tetraacetic acid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M44907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>59435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate III</td>
			<td>R&#38;M Chemicals</td>
			<td>208019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate anhydrous salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td>
			<td>Norgen Biotek</td>
			<td>28240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolton Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Vibrio</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>VB910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin methylene blue agar&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Taq Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye 1kb DNA ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Promega</td>
			<td>91176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McConkey Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105458</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K visualizações.  Universiti Putra Malaysia. Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Vídeo: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform para testar as lentes de contato

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

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