Este trabalho foi apoiado pelo University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Funds, BB).

1. Preparação de soluções <ol><li> Prepare as seguintes soluções frescas para cada experiência. <ol><li> Para a solução de fixação , prepare 37% de formaldeído e guarde-o à RT. Dilúcle-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,42%. CUIDADO: O formaldeído é classificado como irritante, corrosivo, mutagênico, teratogênico e cancerígeno. Não ingerir. Não respire gases / fumaça / vapor / spray. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. Evitar o contato com a pele e os olhos. Mantenha longe de incompatibilidades, como agentes oxidantes, agentes redutores, ácidos, álcalis e umidade. </li><li> Para a solução de fixação de glicina, prepare glicina 0,125 M em 1x solução de PBS e guarde-a à TA. </li><li> Para a solução de raspagem celular, prepare uma solução 1x PBS em dH 2 O e guarde-a em gelo. Diretamente antes do uso, adicione inibidor de proteinase fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tUma concentração final de 0,5 mM. CUIDADO: PMSF é classificado como corrosivo e tóxico; Use roupas de proteção e use-a em uma área ventilada. </li><li> Diretamente antes de usar o tampão de lise celular (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM e NP40 a 0,5%), adicione 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; Solução de estoque 100X em dimetilsulfóxido (DMSO): 104 mM 4- ( Cloridrato de fluoreto de 2-aminoetil) benzenossulfonilo (AEBSF), aprotinina 80 uM, bestatina 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptina 2 mM e pepstatina A 1,5 mM e PMSF 0,5 mM. </li><li> Diretamente antes de usar o tampão de lise de núcleos (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA) e 1% de SDS), adicione PIC 1X e PMSF 0,5 mM. </li></ol></li></ol> 2. Fixação e cisalhamento celular <ol><li> Cresça as células para uma confluência de 70-80% em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Estimule as células pelos objetivos experimentais. </li><li> Remova o meio de cultura de tecido, adicione 5 mL de solução de fixação e incubaAs células por 10 min na RT em uma plataforma de agitação. </li><li> Remova a solução de fixação e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado. </li><li> Remova o 1x PBS, adicione 5 mL de solução de solução de retenção de glicina e incube as células por 5 minutos à TA em uma plataforma de agitação. </li><li> Remova a solução de retenção de glicina e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado. </li><li> Remova o 1x PBS, adicione 2 mL de solução de raspagem celular e colhe as células usando um raspador de células. Transfira as células colhidas para um tubo cônico no gelo. </li><li> Centrifugue as amostras por 10 min a 600 xg e 4 ° C. </li><li> Remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 1 mL de tampão de lise celular 1X e incube em gelo durante 30 min. Alternativamente, congele o sedimento em nitrogênio líquido e guarde-o a -80 ° C. </li><li> Uma vez que o sedimento é ressuspenso no tampão de lise celular, transfira a suspensão celular para um homogeneizador de densa gelado e dente por 10 golpes usando um pestl de tipo BE para a interrupção celular. </li><li> Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as amostras por 10 min a 2.400 xg e 4 ° C. </li><li> Descarte o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 350 μL de tampão de digestão de núcleos e incube as amostras durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Adicione nuclease microcócica (1 U / μL) e misture por vortex. Incubar as amostras a 37 ° C durante 5-20 min; Misture as amostras a cada 2 min por inversão. NOTA: O tempo e a concentração da enzima diferem entre as linhas celulares e podem exigir otimização em casos de cárie enzimática sub-ótima. </li><li> Alternativamente, obtenha o cisalhamento de cromatina por sonicação usando sondas sonoras comercialmente disponíveis. NOTA: As condições de sonicação exigirão otimização. Um protocolo de exemplo de otimização é fornecido abaixo usando um volume de amostra de 300 μL e uma potência de processamento de amostra de 25%. <ol><li> Seguindo o passo 2.10, descarte o sobrenadante e ressuspenda o nPílula de uclear em 1,0 mL de tampão de cisalhamento comercial. </li><li> Alíquota 300 μL do sedimento nuclear ressuspenso em três tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Coloque-os no gelo. </li><li> Corte as 3 alíquotas de cromatina fixa com 25% de potência usando 3 condições diferentes para determinar as condições ideais de sonicação: 5 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso. 10 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso. 20 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 segundos no gelo entre cada pulso. </li><li> Continue com a Etapa 2.15, conforme descrito abaixo. </li></ol></li><li> Após a incubação com a nuclease microcócica, adicione 7 μL de EDTA 0,5 M gelado para parar a reação. </li><li> Centrifugue as amostras com o DNA cortado por 10 min a 16.200 xg e 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante que contém o DNA cortado para um tubo de microcentrífuga fresco. Alíquota 50 μL em um tubo separado de microcentrífuga para confirmar o suCessão excessiva do DNA (seção 3). Use o volume restante imediatamente para imunoprecipitação (seção 4) ou guarde-o a -80 ° C. </li></ol> 3. Confirmação da Eficiência de Cisalha <ol><li> Adicionar 150 μL de dH2O livre de nuclease e 10 μL de NaCl 5 M até a alíquota de 50 μL da cromatina cortada a partir do passo 2.16. </li><li> Incubar as amostras a 65 ° C durante 4 h para reverter as reticências. </li><li> Adicionar 2 μL de RNase A (10 μg / μL) e incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Adicionar 10 μL de proteinase K (0,5 μg / μL) e incubar as amostras a 42 ° C durante 90 min. </li><li> Para a purificação do DNA, realize uma extração de fenol / clorofórmio 12 . <ol><li> Adicione água livre de nuclease a um volume final de 200 μL. Adicione 200 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) à amostra e vortex por 20 s. </li><li> Centrífuga no quartoPor 5 min a 16 000 x g. Retire cuidadosamente a fase aquosa superior e transfira-a para um tubo fresco. Certifique-se de não transportar qualquer fenol durante a pipetagem. </li><li> Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (NH 4 OAc), pH 5,2 e misture movendo várias vezes o tubo com um dedo. Adicione 2,5 volumes de etanol a 100% gelado e misture com vortex por 5 s. Incubar a amostra O / N a -20 ° C, ou durante pelo menos 1 h a -80 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra por 30 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar o cDNA. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante sem interromper a pelotização. Adicione 1 mL de RT, 70% de etanol e inverta o tubo várias vezes. </li><li> Centrifugar a amostra por 2 minutos a 4 ° C e 16.000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Secar o grânulo por 5-10 minutos à TA. Ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O. </li></ol></li><li> Use uma alíquota de 5 e 10 μL do DNA purificado para eletroforese em gel com TAE a 1%Gel de agarose. NOTA: O sucesso do corte de cromatina resulta em um padrão de DNA de 200-1.500 pb. Se o corte não for bem sucedido, determine as condições de corte ideal para as células específicas, modificando o tempo de incubação do passo de corte (etapa 2.12) para 5, 10 e 15 min. </li><li> Use a amostra restante para analisar a concentração de DNA da amostra. Calcular de forma inversa a concentração de DNA na amostra de cromatina cortada (etapa 2.16); Use as mesmas quantidades de DNA para cada grupo de tratamento para a imunoprecipitação (seção 4). </li></ol> 4. Imunoprecipitação <ol><li> Combine 10-25 μg da cromatina cortada e reticulada (passo 2.16) com 25 μL de pérolas magnéticas de proteína G de grau ChIP, 10 μL de tampão de diluição de imunoprecipitação (solução de reserva: 0,01% de SDS, 1,9% de Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM e NaCl 167 mM) e 1 μL de PIC. </li><li> Após 4 h de incubação, adicione 1-10 μg de anticorpo (o concentrador de anticorpoAção variará com base na afinidade do anticorpo; Deve ser inicialmente usado por recomendações do fabricante e otimizado experimentalmente se necessário) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicionar dH2O até um volume final de 100 μL. NOTA: Em vez do método de imunoprecipitação direta descrito acima, o método de imunoprecipação indireta pode ser usado pela primeira combinação da cromatina com os anticorpos e subsequentemente adicionando grânulos magnéticos de proteína G. </li><li> Incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 4-12 h a 4 ° C. </li></ol> 5. Eluição <ol><li> Coloque os tubos em um suporte magnético. Uma vez que os grânulos magnéticos se agregam no lado do tubo, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. </li><li> Lavar as esferas três vezes com 800 μL de tampão de lavagem 1 (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA pH 8, 20 mM de Tris-HCl, pH 8 e 150 mM de NaCl); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético aE retire cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo. </li><li> Lavar as esferas uma vez com 800 μL de tampão de lavagem 2 (SDS a 0,1%, Triton X-100 a 1%, EDTA 2 mM, pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8 e NaCl 500 mM); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético e remova cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo. </li><li> Ressuspender as esferas em 50 μL de tampão de eluição (SDS a 1% e NaHCO3 100 mM) e incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 15 minutos à TA. </li><li> Coloque os tubos em um suporte magnético, e uma vez que os grânulos magnéticos se acumulam no lado do tubo, transfira o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Adicione 6 μL de NaCl 5 M, para reverter a reticulação e 2 μL de proteinase K (0,5 μg / μL). Depois de misturar as amostras, incubar as amostras durante 2 h a 65 ° C. </li><li> Para a purificação do DNA, execute um pheExtracção nol / clorofórmio 12 (passo 3.5) e subsequentemente ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O. NOTA: As amostras podem ser analisadas diretamente para locais de ligação de proteínas (seção 5) ou podem ser armazenadas a -20 ° C. </li></ol> 6. Análise do site de ligação <ol><li> Realizar uma análise para locais de ligação específicos dentro de uma sequência conhecida de ácido nucleico usando PCR ou qRT-PCR. Para o projeto do primer, siga os protocolos convencionais de PCR ou qRT-PCR. Desenhe os iniciadores para sintetizar um amplicon de 150-400 pb que faz uma ponte sobre o local de ligação da proteína de interesse ( Figura 1 ). </li><li> Configure a PCR usando quatro modelos de DNA diferentes para assegurar a especificidade: i) DNA de ChIP imunoprecipitado com o anticorpo de interesse, ii) DNA de ChIP imunoprecipitado com um anticorpo IgG não específico, iii) DNA de entrada e iv) H2O como um Controle negativo para o PCR para excluir a contaminação. No caso da estimulação do caminho, Escolha um quinto modelo usando um conjunto diferente de primers específicos para um site de ligação conhecido da proteína imunoprecipitada. NOTA: No caso da análise do promotor do ligando c-KIT, use PCR convencional para demonstrar a ligação SMAD induzida por TGF-β no SBE dentro da região promotora do ligando c-KIT. Como um controlo positivo, realizar PCR no inibidor-1 do activador do plasminogénio (PAI-1) como um alvo conhecido da ligação de SMAD induzida por TGF-p. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina. A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, para caracterizar os estímulos que induzem a ligação das proteínas ao DNA e caracterizar a seqüência de DNA à qual a proteína se liga. A última informação pode ajudar na identificação de genes regulados por uma proteína específica de interesse e é alcançada pelo uso de ChIP-on-chip, ChIP-seq, ou estratégias de clonagem 7 , 8 , 9 . Uma das principais vantagens do ChIP versus outros métodos de demonstração da ligação DNA-proteína, Como a pegada EMSA ou DNase I, é que, na tecnologia ChIP, a ligação é capturada in vivo , enquanto com outras, é realizada in vitro . Assim, o ChIP fornece informações sobre a ligação da proteína do DNA no contexto celular, enquanto as outras técnicas representam um sistema isolado. No entanto, a análise ChIP é complexa, envolve várias etapas que podem afetar os resultados e requer otimização e experiência. Uma das primeiras etapas que é crítica para o sucesso do ChIP é a etapa de reticulação (passo 2.2). A reticulação UV é irreversível e, portanto, inadequada para ChIP. É preferida a reticulação de formaldeído, mas a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação podem influenciar a eficiência do cisalhamento da cromatina e a precipitação do antígeno. Em geral, são preferíveis concentrações mais baixas de formaldeído (1% p / v) e tempos de reticulação mais curtos (5-10 min), pois melhoram a eficiência de corte. No entanto, o formaldeído não é eficienteNa reticulação proteína-proteína e, portanto, é subóptima para proteínas que não se ligam diretamente ao DNA 16 . Para tais casos, o ChIP pode ser feito em uma abordagem de dois passos, em que a reticulação proteína-proteína é feita primeiro usando reticulantes tais como glutarato de disuccinimidilo, seguido de reticulação de proteína de DNA mediada por formaldeído 17 . O próximo passo crítico é o corte por cromatina. Em nosso estudo, utilizamos cisalhamento enzimático usando nuclease microcócica. O cisalhamento enzimático é especialmente útil para o ChIP nativo não reticulado (N-ChIP), quando a sonicação interromperia a ligação da proteína do DNA. N-ChIP é predominantemente utilizado para análise de histonas e modificadores de histonas 18 . Embora a nuclease microcócica seja considerada uma endo-exonuclease relativamente não específica, demonstrou-se que provoca a clivagem específica da sequência 19 . Isso pode resultar em um viés dependente da sequência no fra resultanteGmentes, com uma representação excessiva de certos loci dos genes 20 . A sonicação cria fragmentos de DNA de tamanho aleatório, sem tendência de sequência, e é geralmente preferido para ChIP (X-ChIP) reticulado. No entanto, as condições de sonicação devem ser determinadas empiricamente para cada modelo de célula ou tecido e sonicador, e os fragmentos de DNA resultantes são geralmente maiores do que com o corte por enzimas 16 . Além disso, a sobre-sonicação ou emulsificação da amostra pode resultar na perda de epítopos de anticorpos devido à desnaturação e degradação de proteínas. O passo de imunoprecipitação é outro passo crítico que pode influenciar muito os resultados do ChIP. Os grânulos de agarose ligam o DNA de forma não específica, e a variação no número de pérolas adicionadas pode afetar a relação sinal-fundo específico. Por isso, é importante manter a &quot;pasta&quot; de grânulos de agarose bem suspensa quando é adicionada às amostras de proteína de DNA. Em relação ao anticorpo utilizado para o iEm geral, os anticorpos de grau ChIP devem ser usados ​​e, nos casos em que estes não estejam disponíveis, pelo menos os anticorpos de grau de imunoprecipitação devem ser preferidos. Como epitopos específicos podem ser mascarados durante a reticulação, os anticorpos policlonais são vantajosos, pois reconhecem vários epítopos. A quantidade de anticorpo adicionado deve ser superior ao fator que está sendo precipitado e, portanto, deve ser determinado empiricamente para cada fator / anticorpo. Além disso, como a cinética para atingir o equilíbrio da ligação do anticorpo é diferente para cada anticorpo, as condições de incubação ótimas devem ser determinadas para cada anticorpo. Vários controles podem e devem ser incluídos na configuração experimental. Nos casos em que a indução de uma reação especifica de ligação à proteína de DNA é avaliada, é importante incluir um controle de DNA de entrada para demonstrar quantidades de DNA de modelo iguais na análise final ( ou seja, PCR ou qRT-PCR). É necessário um controle de anticorpos paraConfirmar a especificidade da imunoprecipitação da proteína de interesse. Normalmente, as imunoglobulinas compatíveis com isotipo são bem adequadas como controles negativos, mas também podem ser usadas grânulos de agarose. Ocasionalmente, controles positivos são usados ​​para confirmar um fluxo experimental funcional do ChIP, e os anticorpos anti-histona são freqüentemente usados ​​para este propósito. Em experimentos de estimulação, um controle positivo preferível é a imunoprecipitação da proteína de interesse, com análise subsequente de seqüência para uma região de DNA conhecida, as proteínas se ligam após a estimulação. Em nossos resultados representativos, o SBE dentro do promotor PAI-1 foi utilizado como um alvo conhecido para a ligação SMAD induzida por TGF-β1. Em experimentos sem ligação de proteína estimulada, uma sequência de DNA conhecida por não ser um alvo para a proteína de interesse pode ser usada para análise de DNA subsequente. Em relação à análise de DNA, é importante incluir uma reação sem modelo de DNA para descartar a contaminação. ChIP é uma excelente técnica para demonstrar diretamente a ligação de uma proteína de interesse para um gene. No entanto, não é um estudo funcional. Nos casos em que uma proteína de interesse é pensada para ter um papel regulador, é imperativo também realizar ensaios funcionais, como ensaios baseados em genes repórter ( por exemplo, luciferase). Nestes protocolos, o gene de interesse é clonado numa posição reguladora de um gene repórter. A indução do gene de interesse resulta na expressão do gene repórter se tiver uma função reguladora. Para uma confirmação adicional do papel regulador da proteína específica de interesse, podem ser geradas células knock-down ou knock-in em que a proteína de ligação ao DNA é geneticamente silenciada. Como um controlo adicional, o sítio de ligação à proteína no gene regulador pode ser mutado para prevenir a ligação da proteína de interesse. Em qualquer um dos dois últimos desenhos experimentais, a estimulação celular não resultará na expressão do marcador gEne.

No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular. Existem várias técnicas para avaliar as interações DNA-proteína in vitro , como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I 1 , 2 . No entanto, essas técnicas não analisam a interação proteína-DNA dentro da cromatina e do contexto celular. ChIP iUma técnica que captura proteínas ligadas aos seus locais de ligação de ADN específicos e, assim, facilita a identificação de interações DNA-proteína dentro do contexto da cromatina. A técnica foi originalmente desenvolvida por Gimour e Lis para avaliação da ligação da ARN polimerase II a genes específicos em Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . É feito por fixação dos complexos DNA-proteína, seguido de extração de cromatina e corte do DNA em ~ 200 fragmentos de pares de bases (pb). Posteriormente, a proteína de interesse do DNA de interesse é isolada por imunoprecipitação. Após a reversão da reticulação de proteína de DNA, o DNA é purificado e analisado. Podem ser utilizados vários métodos para a análise dos sítios de ligação à proteína e dependem da sequência de ácido nucleico do sítio de ligação à proteína dentro do gene alvo 5 . Nos casos em que a sequência de DNA é conhecida, Pol padrãoReações de cadeia de imerase (PCR) podem ser aplicadas, utilizando pares de iniciadores específicos que flanqueiam o site de ligação conhecido. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usada 6 . Nos casos em que a seqüência é desconhecida, o ChIP pode ser combinado com microarrays de DNA (ChIP-on-chip), sequenciação de DNA (ChIP-seq) ou técnicas de clonagem 7 , 8 , 9 . A via TGF-β possui potentes funções de supressão de tumores e é uma via chave na diferenciação celular. É ativado através da ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptores cognatos, resultando na fosforilação de serina de fatores de transcrição SMAD2 / 3. Após a sua associação com o mediador comum, SMAD4, o complexo SMAD se transloca para o núcleo e se liga ao SBE dentro da região promotora dos genes alvo, onde regula os genes que controlam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular.em. A resposta transcricional à estimulação de TGF-β é de tipo celular e específica do contexto 10 . Recentemente, descrevemos um loop de feedback positivo entre TGF-β e a via C-KIT 11 . Neste modelo, o SMAD2 activado por TGF-β1 liga-se ao promotor do ligando c-KIT e induz a sua expressão e secreção. Posteriormente, o ligando c-KIT activa o receptor c-KIT de forma auto-para-crinica. A ativação do receptor c-KIT resulta em STAT3 Tyr 705 -fosforilação via JAK1 / 2. Após a ativação STAT3 e a translocação nuclear, STAT3 se liga ao gene do ligando TGF-β1 e regula sua expressão. Aqui, demonstramos o papel essencial da análise de ChIP para a identificação da ligação de SMAD2 ao promotor do ligando do receptor c-KIT e para a identificação do Transdutor de sinal (e) Activador (da) Transcrição 3 (ligação de STAT3 ao TGF-β1- gene).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">HepG2 cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Hep3B cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">TGF-&#946;1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>101-B1</td>
			<td>Used at a concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-SMAD2 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5339</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4904</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">37490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&#8217;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).

A ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptor cognato resulta na fosforilação de serina de fatores de transcrição de SMAD2 / 3, seguidos de sua associação com o mediador comum, SMAD4. O complexo SMAD se transloca para o núcleo. O TGF-p pode regular a transcrição do gene, quer directamente através da ligação do SMAD aos SBEs dentro das regiões reguladoras dos genes alvo, quer indirectamente através da expressão regulada por SMAD de activadores transcricionais ou repressores que subsequentemente regulam a expressão do gene de interesse 10 . Para testar se o ligando c-KIT SCF é regulado transcriptionally pela ligação induzida por TGF-β1 direta de SMAD2 ao seu promotor, analisamos a região flanqueadora de 2,4 kb, 5 partes do promotor do SCF do gene SCF para o Motivo de ligação SMAD2, 5&#39;-AGAC-3 &#39;(SBE) 13 , 14 . Identificamos 7 supostos SBEs upsTream do codão de início SCF ( Figura 1A ). Para confirmar a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 ao promotor SCF, o ensaio ChIP aqui descrito foi realizado. O tratamento com TGF-β1 resultou em ligação de SMAD2 ao promotor de SCF em linhas de câncer de fígado humano, HepG2 e Hep3B, células ( Figura 1B ). Na ausência de estimulação com TGF-β1, não foi observada ligação de SMAD. Como um controle positivo para a ativação de SMAD induzida por TGF-β1, ChIP para PAI-1 foi realizado. O promotor PAI-1 é um alvo conhecido de TGF-β / SMAD 13 . Para confirmar a especificidade da imunoprecipitação com SMAD2, utilizaram-se anticorpos IgG inespecíficos; Não se observou ligação de SMAD2 ao SBE após imunoprecipitação com IgG. Para outra demonstração da tecnologia ChIP, analisamos a região flanqueadora 5 &#39;do gene do ligando TGF-p para os motivos de ligação de consenso STAT3 5&#39;-TT (N4) AA-3 &#39;e 5&#39;-TT (N5) AA-3&#39; 15 . Identificamos dois locais de ligação STAT3 putativos a montante do codão de início do TGFB nas posições -4384 / -4373 (STB-1) e -5365 / -5357 (STB-2) ( Figura 2A ). Para confirmar a ligação induzida por TGF-β1 de STAT3 ao gene do ligando TGF-β, realizamos ensaios ChIP utilizando células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1. O tratamento com TGF-β1 resultou na ligação de STAT3 ao segundo local de ligação de STAT3 putativo (STB-2) do gene de TGFB, mas não ao primeiro (STB-1) ( Figura 2B ). Neste exemplo, a ligação STAT3 positiva ao STB-2 serve como um controle positivo interno. Semelhante ao experimento CHIP acima, a ligação de STAT3 ao STB-2 não foi observada após a imunoprecipitação usando IgG. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig1.jpg" /> figura 1 <str<html> Ong&gt;: Ligação SMAD2 induzida por TGF-β ao Promotor SCF. ( A ) Representação esquemática do promotor SCF , com SBEs putativos mostrados como caixas (caixas brancas = AGAC) com sua posição relativa ao codão de início. A localização do primário ChIP é mostrada abaixo, com as posições relativas ao codão de partida SCF e ao tamanho do produto PCR. ( B ) ChIP para ligação SMAD2 ao promotor SCF . Os complexos de cromatina-proteína das células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1 e não tratadas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-SMAD2. A PCR foi realizada utilizando iniciadores específicos de SCF. À esquerda, são mostrados os resultados de PCR que utilizam DNA de entrada. No meio, os resultados de PCR após imunoprecipitação com IgG inespecífica são mostrados para a confirmação da especificidade de imunoprecipitação de SMAD2. Mostrado no painel inferior, a ligação ChIP para SMAD2 ao PAI-1 foi utilizada como um controle positivo.Ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig2.jpg" /> Figura 2 : Ligação STAT3 induzida por TGF-β ao gene TGF-β. ( A ) Esquema do gene TGF-β, com locais de ligação STAT3 putativos mostrados como caixas cinzentas com a sua posição relativa ao codão de início. As localizações de iniciadores de ChIP são mostradas com suas posições relativas ao codão de início de TGF-β e os tamanhos de produtos de PCR indicados abaixo. ( B ) ChIP para a ligação STAT3 induzida por TGF-β1 ao gene TGF-β. Os complexos de cromatina-proteína de células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1 e não tratadas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-STAT3. O PCR foi realizado utilizando iniciadores específicos de TGF-p. À esquerda, são mostrados os resultados de PCR que utilizam DNA de entrada. No meio, o PCRResultados após imunoprecipitação com IgG inespecífica são mostrados para confirmação da especificidade de imunoprecipitação STAT3. O painel superior mostra os resultados da PCR usando primers específicos para o local de ligação STAT3 1 (STB-1) e o painel inferior mostra os resultados para a ligação STAT3 ao site de ligação STAT3 2 (STB-2). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55689/55689fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K visualizações.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo. 

Vídeo: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genética

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mapping Alzheimer's Disease Variants to Their Target Genes Using Computational Analysis of Chromatin Configuration

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, because the majority of the genome-wide significant (GWS) loci fall onto the non-coding genome, the functional impact of many remain unknown. Three-dimensional chromatin interactions identified by Hi-C or its derivatives can provide useful tools to annotate these loci by linking non-coding variants to their actionable genes. Here, we outline a protocol to map GWAS non-coding variants to their putative genes using Alzheimer&#39;s disease (AD) GWAS and Hi-C datasets from human adult brain tissue. Putative causal single-nucleotide polymorphisms (SNPs) are identified by application of fine-mapping algorithms. SNPs are then mapped to their putative target genes using enhancer-promoter interactions based on Hi-C. The resulting gene set represents AD risk genes, as they are potentially regulated by AD risk variants. To garner further biological insights into molecular mechanisms underlying AD, we characterize AD risk genes using developmental brain expression data and brain single-cell expression profiles. This protocol can be expanded to any GWAS and Hi-C datasets to identify putative target genes and molecular mechanisms underlying various human traits and diseases.

We present a protocol to identify functional implications of non-coding variants identified by genome-wide association studies (GWAS) using three-dimensional chromatin interactions.

Mapeamento variantes da doença de Alzheimer para seus genes-alvo usando análise computacional da configuração de cromatina

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, ...