Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondi di avvio, BB).

1. Preparazione delle soluzioni <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni fresche per ogni esperimento. <ol><li> Per la soluzione di fissazione , preparare la formaldeide al 37% e conservarla a RT. Diluire in 1x salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad una concentrazione finale di 1,42%. ATTENZIONE: La formaldeide è classificata come irritante, corrosiva, mutagena, teratogena e cancerogena. Non ingerire. Non respirare gas / fumo / vapore / spray. In caso di ventilazione insufficiente, indossare apparecchiature respiratori adeguate. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Tenere lontano da incompatibili, come agenti ossidanti, agenti riducenti, acidi, alcali e umidità. </li><li> Per la soluzione di stop-fix della glicina, preparare 0.125 M glicina in soluzione 1x PBS e conservarla a RT. </li><li> Per la soluzione di raschiatura cellulare, preparare una soluzione 1x PBS in dH 2 O e conservarla su ghiaccio. Direttamente prima dell&#39;uso, aggiungere fenilmetilsolfonilfluoruro (PMSF) inibitore della proteinaO una concentrazione finale di 0,5 mM. ATTENZIONE: PMSF è classificato come corrosivo e tossico; Indossare indumenti protettivi e utilizzarlo in un&#39;area ventilata. </li><li> Prima di utilizzare il tampone di lisi di cellule (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% NP40), aggiungere 1 x Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X soluzione in dimetilsolfossido (DMSO): 104 mM 4- 2-amminoetil) benzensolfonil fluoruro di cloruro (AEBSF), 80 μM aprotinina, 4 mM bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptina e 1,5 mM peprostatin A) e 0,5 mM PMSF. </li><li> Direttamente prima di utilizzare il tampone di lisi nucleare (50 mM di Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) e 1% di SDS), aggiungere 1X PIC e 0,5 mM PMSF. </li></ol></li></ol> 2. Fissazione e strappo delle celle <ol><li> Crescere le cellule alla confluenza del 70-80% su piastre di coltura tissutale da 10 cm. Stimolare le cellule per gli scopi sperimentali. </li><li> Rimuovere il mezzo di coltura tissutale, aggiungere 5 ml di soluzione di fissazione e incubareLe cellule per 10 minuti a RT su una piattaforma di agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione di fissazione e lavare due volte le cellule con 10 ml di PBS 1x gelato. </li><li> Rimuovere il 1x PBS, aggiungere 5 mL di soluzione di stop-fix della glicina e incubare le cellule per 5 minuti a RT su una piattaforma di agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione di stop-fix della glicina e lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS 1x ghiaccio freddo. </li><li> Rimuovere il 1x PBS, aggiungere 2 ml di soluzione di raschiamento cellulare e raccogliere le cellule utilizzando un raschiatore di cellule. Trasferire le cellule raccolte in un tubo conico su ghiaccio. </li><li> Centrifugare i campioni per 10 minuti a 600 xg e 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi di cellule 1X e incubare su ghiaccio per 30 minuti. In alternativa, congelare il pellet in azoto liquido e conservarlo a -80 ° C. </li><li> Una volta che il pellet viene risospeso nel tampone di lisi delle cellule, trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore di riflusso ghiaccio e sfilare per 10 colpi utilizzando un pestl di tipo BE per la distruzione delle cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga e centrifugare i campioni per 10 minuti a 2.400 xg e 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 350 μL di tampone di digestione del nucleo e incubare i campioni per 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere la nuclease micrococcica (1 U / μL) e mescolare per vortexing. Incubare i campioni a 37 ° C per 5-20 min; Mescolare i campioni ogni 2 minuti per inversione. NOTA: la concentrazione di tempo e enzima differisce tra linee cellulari e potrebbe richiedere l&#39;ottimizzazione in caso di taglio enzimatico non ottimale. </li><li> In alternativa, ottenere la cricatura di cromatina per ultrasuoni utilizzando sonicatori disponibili in commercio. NOTA: Le condizioni di sonicazione richiedono l&#39;ottimizzazione. Di seguito viene fornito un protocollo di esempio di ottimizzazione utilizzando un volume di campionamento di 300 μL e una potenza di elaborazione del campione del 25%. <ol><li> Seguire il punto 2.10, scartare il surnatante e risospendere il nPellicola uclear in 1,0 mL di tampone commerciale. </li><li> Aliquota 300 μL del pellet nucleare risospeso in tre tubi di microcentrifuga da 1,7 ml. Posizionarli su ghiaccio. </li><li> Scorri le 3 aliquote di cromatina fissa al 25% di potenza utilizzando 3 condizioni diverse per determinare le condizioni ottimali di sonicazione: 5 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso. 10 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso. 20 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso. </li><li> Continuare con il passo 2.15 come descritto di seguito. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;incubazione con la nucleasi micrococcica, aggiungere 7 μl di 0.5 M EDTA ghiacciata per fermare la reazione. </li><li> Centrifugare i campioni con il DNA triturato per 10 min a 16.200 xg e 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante contenente DNA in un tubo di microcentrifuga fresco. Aliquota 50 μL in un tubo di microcentrifuga separato per confermare la suTaglio ccesso del DNA (sezione 3). Usare immediatamente il residuo volume per l&#39;immunoprecipitazione (sezione 4) o conservarlo a -80 ° C. </li></ol> 3. Conferma dell&#39;efficienza di taglio <ol><li> Aggiungere 150 μL di dH2O senza nucleasi e 10 μL di 5 M NaCl alla aliquota di 50 μl della cromatina tagliata dalla fase 2.16. </li><li> Incubare i campioni a 65 ° C per 4 ore per invertire i collegamenti incrociati. </li><li> Aggiungere 2 μL di RNasi A (10 μg / μL) e incubare i campioni a 37 ° C per 15 min. </li><li> Aggiungere 10 μL di proteinasi K (0,5 μg / μL) e incubare i campioni a 42 ° C per 90 min. </li><li> Per la purificazione del DNA, eseguire un&#39;estrazione di fenolo / cloroformio 12 . <ol><li> Aggiungere acqua senza nucleasi a un volume finale di 200 μL. Aggiungere 200 μl di fenolo: cloroformio: isoamilico (25: 24: 1) al campione e vortexare per 20 sec. </li><li> Centrifugare in camera temPerature per 5 min a 16.000 x g. Rimuovere con cautela la fase acquosa superiore e trasferirla in un tubo fresco. Assicurarsi di non portare alcun fenolo durante la pipettazione. </li><li> Aggiungere 0,1 volumi di 3 M di sodio acetato (NH 4 OAc), pH 5,2 e mescolare agitando il tubo più volte con un dito. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% di ghiaccio e mescolare per vortice per 5 s. Incubare il campione O / N a -20 ° C o per almeno 1 h a -80 ° C. </li><li> Centrifugare il campione per 30 minuti a 4 ° C e 16.000 xg per il pellet di cDNA. </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante senza interrompere il pellet. Aggiungere 1 ml di RT, il 70% di etanolo e invertire il tubo più volte. </li><li> Centrifugare il campione per 2 min a 4 ° C e 16.000 x g. Rimuovere con cautela il surnatante. </li><li> Asciugare il pellet per 5-10 minuti a RT. Resuspendere il pellet in 30 μl di dH 2 O. </li></ol></li><li> Utilizzare un&#39; aliquota di 5 e 10 μl del DNA purificato per l&#39;elettroforesi con gel con un TAE dell&#39;1%Gel agarosio. NOTA: La successiva cottura di cromatina provoca un DNA pattern di 200-1.500 bp. Se la tranciatura non è riuscita, determinare le condizioni di taglio ottimali per le celle specifiche modificando il tempo di incubazione della fase di taglio (passo 2.12) a 5, 10 e 15 min. </li><li> Utilizzare il campione rimanente per analizzare la concentrazione del DNA del campione. Calcola invertire la concentrazione del DNA nel campione di cromatina tritato (punto 2.16); Utilizzare gli stessi valori di DNA per ogni gruppo di trattamento per l&#39;immunoprecipitazione (sezione 4). </li></ol> 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Combinare 10-25 μg di cromatina triturata e incrociata (passo 2.16) con 25 μL di branchi magnetici di proteina ChIP-grado G, 10 μl di tampone di diluizione immunoprecipitanti (soluzione di riserva: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA e 167 mM NaCl) e 1 μl di PIC. </li><li> Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere 1-10 μg di anticorpo (il concentrato anticorpaleVariazione in base all&#39;affinità dell&#39;anticorpo; Si dovrebbe inizialmente essere utilizzato per raccomandazioni del produttore e ottimizzato sperimentalmente se necessario) ad un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere dH 2 O ad un volume finale di 100 μL. NOTA: Invece del metodo di immunoprecipitazione diretta sopra descritto, il metodo immunoprecipiation indiretto può essere utilizzato combinando prima la cromatina con gli anticorpi e successivamente aggiungendo branchi magnetici della proteina G. </li><li> Incubare i campioni su un rotatore end-to-end per 4-12 h a 4 ° C. </li></ol> 5. Eluzione <ol><li> Posizionare i tubi su un supporto magnetico. Una volta che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo, rimuovono attentamente e scartano il surnatante. </li><li> Lavare le perle tre volte con 800 μL di tampone di lavaggio 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 e 150 mM NaCl); Mescolare invertendo il tubo diverse volte. Mettere il tubo sul supporto magnetico aEliminare con cura e scartare il tampone di lavaggio una volta che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo. </li><li> Lavare le perle una volta con 800 μl di tampone di lavaggio 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 e 500 mM NaCl); Mescolare invertendo il tubo diverse volte. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e rimuovere accuratamente e scartare il tampone di lavaggio dopo che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo. </li><li> Resuspendere le perle in 50 μl di tampone di eluizione (1% SDS e 100 mM NaHCO3) e incubare i campioni su un rotatore end-to-end per 15 minuti a RT. </li><li> Posizionare i tubi su un supporto magnetico, e una volta che le perle magnetiche si raccolgono sul lato del tubo, trasferire il surnatante su un tubo fresco. </li><li> Aggiungere 6 μl di 5 M NaCl, per invertire il reticolazione e 2 μL di proteinasi K (0,5 μg / μL). Dopo aver mescolato i campioni, incubare i campioni per 2 ore a 65 ° C. </li><li> Per la purificazione del DNA, eseguire un pheNol / cloroformio 12 (fase 3.5) e successivamente risospendere il pellet in 30 μl di dH2O. NOTA: i campioni possono essere analizzati direttamente per siti di legame proteico (sezione 5) o possono essere conservati a -20 ° C. </li></ol> 6. Analisi del sito di rilegatura <ol><li> Eseguire un&#39;analisi per specifici siti di legame all&#39;interno di una sequenza acido nucleico noto usando PCR o qRT-PCR. Per la progettazione primer, seguire protocolli PCR o qRT-PCR convenzionali. Progettare i primers per sintetizzare un amplicone da 150-400 bp che si unisce al sito di interesse legato alla proteina ( Figura 1 ). </li><li> Impostare il PCR usando quattro diversi modelli di DNA per assicurare la specificità: i) DNA da ChIP immunoprecipitato con l&#39;anticorpo interessato, ii) DNA da ChIP immunoprecipitato con un anticorpo IgG non specifico, iii) DNA in ingresso e iv) H 2 O come un Controllo negativo per il PCR per escludere la contaminazione. Nel caso della stimolazione del percorso, Scegliere una quinta maschera usando un set diverso di primer specifici per un sito di legame noto della proteina immunoprecipitata. NOTA: Nel caso dell&#39;analisi del promotore di ligandi del c-KIT, utilizzare il PCR convenzionale per dimostrare l&#39;associazione di SMAD indotta da TGF-β all&#39;SBE all&#39;interno della regione promotore del ligand di c-KIT. Come controllo positivo, eseguire PCR sull&#39;inhibitor-1 (PAI-1) dell&#39;attivatore di plasminogeno come un bersaglio noto del legame SMAD indotto da TGF-β. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo rapporto dimostriamo il legame di SMAD2 indotto da TGF-β1 a un SBE all&#39;interno del promotore di ligandi del c-KIT e del legame di STAT3 indotto da TGF-β1 alla sua sequenza di riconoscimento all&#39;interno del gene ligand TGF-β1. Abbiamo dimostrato la legame di entrambi i fattori di trascrizione con citocina indotta da immunoprecipitazione cromatina. L&#39;immunoprecipitazione di cromatina è un potente strumento per dimostrare il legame diretto di una proteina di interesse per il DNA, per caratterizzare gli stimoli che inducono la legame delle proteine ​​al DNA e per caratterizzare la sequenza di DNA a cui la proteina si lega. Queste ultime informazioni possono aiutare nell&#39;identificazione di geni regolati da una proteina specifica di interesse e si ottiene utilizzando ChIP-on-chip, ChIP-seq, o strategie di clonazione 7 , 8 , 9 . Uno dei principali vantaggi della ChIP rispetto ad altri metodi di dimostrazione della legame delle proteine ​​del DNA, Come EMSA o DNase I, è che, nella tecnologia ChIP, il legame viene catturato in vivo , mentre con gli altri viene eseguito in vitro . Quindi, ChIP fornisce una visione della legame di proteine ​​del DNA all&#39;interno del contesto cellulare, mentre le altre tecniche rappresentano un sistema isolato. Tuttavia, l&#39;analisi ChIP è complessa, comporta passaggi multipli che possono influenzare i risultati e richiede ottimizzazione ed esperienza. Uno dei primi passi critici per il successo di ChIP è il passaggio crosslink (passaggio 2.2). Il reticolazione UV è irreversibile e pertanto inadatto per il ChIP. È preferibile la reticolazione di formaldeide, ma la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione possono influire sia sull&#39;efficienza della cottura di cromatina e sulle precipitazioni di antigene. In generale, sono preferibili concentrazioni di formaldeide inferiori (1% w / v) e tempi di reticolazione più brevi (5-10 minuti), poiché migliorano l&#39;efficienza di taglio. Tuttavia, la formaldeide non è efficienteA crosslinking proteina-proteina e pertanto è poco ottimale per le proteine ​​che non si legano direttamente al DNA 16 . Per questi casi, ChIP può essere fatta in un approccio a due fasi, in cui la reticolazione proteico-proteica viene fatta prima utilizzando crosslinkers come il glucutato disuccinimidilico, seguito da reticolazione di DNA-proteina mediata da formaldeide 17 . Il prossimo passo critico è la cricatura di cromatina. Nel nostro studio abbiamo utilizzato tagli enzimatici utilizzando la nucleasi micrococcica. La cimatura enzimatica è particolarmente utile per il ChIP nativo non collegato (N-ChIP), quando la sonicazione interromperà la legame delle proteine ​​del DNA. N-ChIP è prevalentemente utilizzato per l&#39;analisi di istoni e modificatori istoni 18 . Mentre la nucleasi micrococcica è considerata una endo-esonucleasi relativamente non specifica, è stato dimostrato che elimina la scissione sequenziale-specifica 19 . Ciò può provocare una polarizzazione dipendente dalla sequenza nella frazione risultante, Con sovrapresentazione di determinati gene loci 20 . La sonicazione crea frammenti di DNA casuali, senza bias di sequenza, ed è generalmente preferibile per ChIP reticolato (X-ChIP). Tuttavia, le condizioni di sonicazione devono essere determinate empiricamente per ogni modello di cellule o tipo di tessuto e del sonicatore e i frammenti di DNA risultanti sono generalmente più grandi che con la tranciatura enzimatica 16 . Inoltre, la sovra-sonicazione o l&#39;emulsionazione del campione può provocare la perdita di epitopi anticorpali a causa della denaturazione e del degrado della proteina. La fase di immunoprecipitazione è un altro passo critico che può influenzare notevolmente i risultati di ChIP. Le perle di agarosio legano il DNA in modo non specifico e la variazione del numero di brani aggiunti può influire sul rapporto specifico tra segnale e background. Quindi, è importante mantenere sospesa la &quot;slurry&quot; del grano agarosio quando viene aggiunta ai campioni di proteine ​​del DNA. Per quanto riguarda l&#39;anticorpo utilizzato per iIn genere, le precipitazioni, in generale, devono essere utilizzate anticorpi ChIP-grade e, nel caso in cui questi non siano disponibili, almeno l&#39;anticorpo di immunoprecipitazione deve essere preferito. Come epitopi specifici possono essere mascherati durante il reticolazione, gli anticorpi policlonali sono vantaggiosi, in quanto riconoscono diversi epitopi. La quantità di anticorpo aggiunto dovrebbe essere superiore al fattore precipitato e quindi deve essere determinato empiricamente per ogni fattore / anticorpo. Inoltre, poiché la cinetica per raggiungere l&#39;equilibrio del legame degli anticorpi si differenzia per ogni anticorpo, occorre determinare le condizioni ottimali di incubazione per ciascun anticorpo. Diversi controlli possono e devono essere inclusi nella configurazione sperimentale. Nei casi in cui viene valutata l&#39;induzione di una specifica reazione di legame con la DNA, è importante includere un controllo del DNA di input per dimostrare l&#39;equivalente di DNA di template nell&#39;analisi finale ( vale a dire PCR o qRT-PCR). È necessario un controllo anticorpaleConfermano la specificità dell&#39;immunoprecipitazione della proteina di interesse. Normalmente le immunoglobuline corrispondenti all&#39;isotipo sono ben adattate come controlli negativi, ma possono essere utilizzati anche branchi di agarosio. Occasionalmente, controlli positivi vengono utilizzati per confermare un flusso sperimentale funzionale del ChIP, e spesso vengono utilizzati anticorpi anti-istone a questo scopo. Negli esperimenti di stimolazione, un preferibile controllo positivo è l&#39;immunoprecipitazione della proteina di interesse, con successiva analisi di sequenza per una regione di DNA nota le proteine ​​si legano alla stimolazione. Nei nostri risultati rappresentativi, l&#39;SBE all&#39;interno del promotore PAI-1 è stato usato come un bersaglio noto per il legame SMAD indotto da TGF-β1. Negli esperimenti senza legame proteico stimolato, una sequenza DNA nota per non essere un bersaglio per la proteina di interesse può essere utilizzata per la successiva analisi del DNA. Per quanto riguarda l&#39;analisi del DNA, è importante includere una reazione senza template DNA per escludere la contaminazione. ChIP è una tecnica eccellente per dimostrare direttamente il legame di una proteina di interesse a un gene. Tuttavia, non è uno studio funzionale. Nei casi in cui una proteina di interesse si pensa di avere un ruolo regolatore, è indispensabile eseguire anche test funzionali, come i test reporter a base di gene ( ad es. Luciferasi). In questi protocolli, il gene di interesse è clonato in una posizione regolatoria di un gene reporter. L&#39;induzione del gene di interesse provoca l&#39;espressione del gene reporter se ha una funzione regolatoria. Per ulteriore conferma del ruolo di regolamentazione della proteina specifica di interesse, si possono generare cellule di abbattimento o di colpi in cui la proteina legante del DNA viene geneticamente tacitata. Come un ulteriore controllo, il sito di legame delle proteine ​​nel gene regolatore può essere mutato per impedire il legame della proteina di interesse. In uno dei due ultimi progetti sperimentali, la stimolazione cellulare non determinerà l&#39;espressione del marcatore gene.

Nel nucleo degli eucarioti, il DNA interagisce con proteine ​​dell&#39;istone e proteine ​​non-istone ed è condensato in cromatina. Nel contesto fisiologico, patofisiologico e biologico delle cellule, le funzioni cellulari sono controllate spazialmente e temporaneamente dall&#39;espressione genica coordinata con cromatina. Le interazioni tra proteine ​​del DNA hanno un ruolo essenziale nella regolazione dei processi cellulari, come la replicazione del DNA, la ricombinazione e la riparazione, così come l&#39;espressione di proteine. Pertanto, l&#39;analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è uno strumento indispensabile nella valutazione dell&#39;espressione genica e della funzione cellulare. Esistono diverse tecniche per valutare le interazioni proteiche del DNA in vitro , come l&#39;EMPE (Electrophoresis (Gel)) e DNase I footprinting 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche non analizzano l&#39;interazione proteina-DNA all&#39;interno del contesto cromatina e cellulare. ChIP iTecnica che cattura le proteine ​​legate ai loro specifici siti di legame del DNA e quindi facilita l&#39;identificazione delle interazioni tra proteine ​​del DNA all&#39;interno del contesto cromatico. La tecnica è stata originariamente sviluppata da Gimour e Lis per la valutazione della RNA polimerasi II legata a geni specifici in Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . Viene effettuata mediante la fissazione dei complessi proteici del DNA, seguita dall&#39;estrazione di cromatina e tagliando il DNA in frammenti di 200 paia di base (bp). Successivamente, la proteina di interesse legata al DNA viene isolata mediante immunoprecipitazione. Dopo l&#39;inversione del DNA-protein crosslink, il DNA viene purificato e analizzato. Diversi metodi possono essere utilizzati per l&#39;analisi dei siti di legame delle proteine ​​e dipendono dalla sequenza di acido nucleico del sito di legame della proteina all&#39;interno del gene bersaglio 5 . Nei casi in cui è nota la sequenza del DNA, standard PolPossono essere applicate reazioni a catena ymerase (PCR), utilizzando coppie di primer specifiche che fiancheggiano il noto sito di legame. È possibile utilizzare anche il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) 6 . Nei casi in cui la sequenza è sconosciuta, ChIP può essere combinato con microarray di DNA (ChIP-on-chip), sequenza di DNA (ChIP-seq) o tecniche di clonazione 7 , 8 , 9 . Il percorso TGF-β ha potenti funzioni di soppressione del tumore ed è un percorso chiave nella differenziazione cellulare. Viene attivato attraverso il legame del legante TGF-β1 al suo complesso recettore cognato, con conseguente fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3. Dopo la loro associazione con il mediatore comune, SMAD4, il complesso SMAD trasloca al nucleo e si lega all&#39;SBE all&#39;interno della regione promotore dei geni bersaglio, dove regola i geni che controllano il ciclo cellulare, l&#39;apoptosi e le cellule differenziatesopra. La risposta trascrizionale alla stimolazione TGF-β è tipologia di cellule e contesto-specifico 10 . Recentemente abbiamo descritto un ciclo di feedback positivo tra TGF-β e il percorso c-KIT 11 . In questo modello, SMAD2 attivato da TGF-β1 si lega al promotore di ligandi del c-KIT e induce la sua espressione e secrezione. Successivamente, il ligando c-KIT attiva il recettore c-KIT in modo auto- e para-crinico. L&#39;attivazione del recettore del c-KIT determina la presenza di STAT3 Tyr 705- fosforilazione tramite JAK1 / 2. A seguito dell&#39;attivazione STAT3 e della traslocazione nucleare, STAT3 si lega al gene ligand TGF-β1 e regola la sua espressione. Qui dimostriamo il ruolo essenziale dell&#39;analisi ChIP per l&#39;identificazione della legame SMAD2 al promotore del ligando del recettore c-KIT e per l&#39;identificazione del trasduttore del segnale (e) attivatore (di) della trascrizione 3 (legame STAT3 al TGF-β1- gene).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">HepG2 cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Hep3B cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">TGF-&#946;1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>101-B1</td>
			<td>Used at a concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-SMAD2 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5339</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4904</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">37490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&#8217;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

Molti processi cellulari, compresa la replicazione e la riparazione del DNA, la ricombinazione del DNA e l&#39;espressione genica, richiedono interazioni tra proteine ​​e DNA. Pertanto, le interazioni proteine ​​del DNA regolano molteplici funzioni fisiologiche, patofisiologiche e biologiche, come la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la stabilità del cromosoma, la regolazione epigenetica dei geni e la trasformazione cellulare. Nelle cellule eucariotiche, il DNA interagisce con proteine ​​istone e non-istone e viene condensato in cromatina. Diversi strumenti tecnici possono essere utilizzati per analizzare le interazioni tra proteine ​​del DNA, come l&#39;EMSS (Electrophoresis (Gel)) e DNase I (footprinting). Tuttavia, queste tecniche analizzano l&#39;interazione proteina-DNA in vitro , non all&#39;interno del contesto cellulare. L&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è una tecnica che cattura le proteine ​​nei loro siti specifici di legame del DNA, consentendo così l&#39;identificazione dell&#39;interazione tra proteine ​​del DNAAll&#39;interno del loro contesto cromatico. Viene fatta con la fissazione dell&#39;interazione tra proteine ​​del DNA, seguita da immunoprecipitazione della proteina di interesse. Successivamente, si caratterizza il sito genomico cui è legata la proteina. Qui descriviamo e discutiamo il ChIP e dimostriamo il suo valore analitico per l&#39;identificazione del legame di trasformazione Factor-β (TGF-β) del fattore di trascrizione SMAD2 a SMAD Binding Elements (SBE) all&#39;interno della regione promotore della tirosina- Proteina chinasi Kit (c-KIT) del recettore del fattore cellule staminali (SCF).

Il legame del TGF-β1 ligando al suo complesso recettore cognato determina la fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3, seguita dalla loro associazione con il mediatore comune, SMAD4. Il complesso SMAD trasloca al nucleo. TGF-β può regolare la trascrizione genica, direttamente tramite SMAD, legame a SBE all&#39;interno di regioni di regolazione dei geni bersaglio, oppure indirettamente attraverso l&#39;espressione regolata da SMAD di attivatori o repressori trascrizionali che regolano successivamente l&#39;espressione del gene di interesse 10 . Per verificare se il legame SCF di c-KIT è regolato trascrittivamente dal legame TGF-β1 indotto da SMAD2 al suo promotore, abbiamo analizzato la regione SCF contenente il 2,4-kb, 5&#39;-flanking del gene SCF Motivo di legame SMAD2, 5&#39;-AGAC-3 &#39;(SBE) 13 , 14 . Abbiamo identificato 7 SBE ups propostiTream del codone d&#39;inizio SCF ( Figura 1A ). Per confermare il legame TGF-β1-indotto di SMAD2 al promotore SCF, è stato eseguito il test ChIP qui descritto. Il trattamento TGF-β1 ha determinato l&#39;associazione SMAD2 al promotore SCF nelle linee di cancro del fegato umano, HepG2 e Hep3B, ( Figura 1B ). In assenza di stimolazione TGF-β1, non è stata osservata nessuna associazione SMAD. Come controllo positivo per l&#39;attivazione SMAD indotta da TGF-β1, è stata eseguita la ChIP per PAI-1. Il promotore PAI-1 è un bersaglio noto di TGF-β / SMAD 13 . Per confermare la specificità dell&#39;immunoprecipitazione SMAD2, sono stati utilizzati anticorpi IgG non specifici; Nessun SMAD2 legame all&#39;SBE è stato osservato dopo immunoprecipitazione con IgG. Per un&#39;altra dimostrazione della tecnologia ChIP, abbiamo analizzato la regione 5&#39;-flanking del gene del ligand TGF-β per i motivi di legame STAT3 di legame 5 &#39;-TT (N4) AA-3 &#39;e 5&#39;-TT (N5) AA-3&#39; 15 . Abbiamo identificato due siti di legame STAT3 a monte del codone di inizio TGFB in posizioni -4384 / -4373 (STB-1) e -5365 / -5357 (STB-2) ( Figura 2A ). Per confermare il legame TGF-β1-indotto di STAT3 sul gene ligand TGF-β, abbiamo eseguito test ChIP utilizzando cellule HepG2 e Hep3B trattate con TGF-β1. Il trattamento con TGF-β1 ha determinato il legame STAT3 al secondo sito di legame STAT3 (STB-2) del gene TGFB, ma non al primo (STB-1) ( Figura 2B ). In questo esempio, il legame STAT3 positivo a STB-2 serve come un controllo positivo interno. Simile al precedente esperimento ChIP, il legame STAT3 con STB-2 non è stato osservato dopo l&#39;immunoprecipitazione usando IgG. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig1.jpg" /> Figura 1 <str<html> Ong&gt;: SMAD2 indotta da TGF-β-binding al promotore SCF. ( A ) Rappresentazione schematica del promotore SCF , con SBE putativi mostrati come scatole (caselle bianche = AGAC) con la loro posizione relativa al codone iniziale. La posizione del primer ChIP è mostrata sotto, con le posizioni relative al codone di inizio SCF e la dimensione del prodotto PCR. ( B ) ChIP per SMAD2 legato al promotore SCF . I complessi di proteine ​​cromatiniche delle cellule HepG2 e Hep3B trattate con TGF-β1 e non trattate sono state immunoprecipitate con anticorpo anti-SMAD2. PCR è stata eseguita usando primers specifici SCF. Sulla sinistra vengono mostrati risultati PCR utilizzando il DNA di input. Nel mezzo, risultati PCR dopo immunoprecipitazione con IgG non specifico sono mostrati per la conferma della specificità immunoprecipitazione SMAD2. Nello schermo inferiore, ChIP per SMAD2 è stato utilizzato come controllo positivo.Ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig2.jpg" /> Figura 2 : legame STAT3 indotto da TGF-β per il gene TGF-β. ( A ) Schema del gene TGF-β, con siti di binding STAT3 indicati come scatole grigie con la loro posizione relativa al codone iniziale. Le posizioni dei primer ChIP sono mostrate con le loro posizioni relative al codone di inizio TGF-β e le dimensioni dei prodotti PCR indicati di seguito. ( B ) ChIP per il legame STAT3 indotto da TGF-β1 al gene TGF-β. I complessi di proteine ​​cromatiniche delle cellule HepG2 e Hep3B trattate e non trattate con TGF-β1 sono state immunoprecipitate con anticorpo anti-STAT3. La PCR è stata eseguita usando primers specifici TGF-β. A sinistra, vengono visualizzati i risultati del PCR utilizzando il DNA di input. Al centro, il PCRI risultati dopo immunoprecipitazione con IgG non specifico sono mostrati per confermare la specificità di immunoprecipitazione STAT3. Il pannello superiore mostra i risultati del PCR utilizzando primer specifici per il sito di legame STAT3 (STB-1) e il pannello inferiore mostra i risultati per il legame STAT3 al sito di legame STAT3 (STB-2). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55689/55689fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Le interazioni tra proteine ​​del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l&#39;analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni .

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Le interazioni tra proteine ​​del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l'analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni . 

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Ricerca

Genetica

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mapping Alzheimer's Disease Variants to Their Target Genes Using Computational Analysis of Chromatin Configuration

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, because the majority of the genome-wide significant (GWS) loci fall onto the non-coding genome, the functional impact of many remain unknown. Three-dimensional chromatin interactions identified by Hi-C or its derivatives can provide useful tools to annotate these loci by linking non-coding variants to their actionable genes. Here, we outline a protocol to map GWAS non-coding variants to their putative genes using Alzheimer&#39;s disease (AD) GWAS and Hi-C datasets from human adult brain tissue. Putative causal single-nucleotide polymorphisms (SNPs) are identified by application of fine-mapping algorithms. SNPs are then mapped to their putative target genes using enhancer-promoter interactions based on Hi-C. The resulting gene set represents AD risk genes, as they are potentially regulated by AD risk variants. To garner further biological insights into molecular mechanisms underlying AD, we characterize AD risk genes using developmental brain expression data and brain single-cell expression profiles. This protocol can be expanded to any GWAS and Hi-C datasets to identify putative target genes and molecular mechanisms underlying various human traits and diseases.

We present a protocol to identify functional implications of non-coding variants identified by genome-wide association studies (GWAS) using three-dimensional chromatin interactions.

Mappare le varianti della malattia di Alzheimer ai loro geni bersaglio utilizzando l'analisi computazionale della configurazione della cromatina

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, ...