Este trabalho foi apoiado por um prêmio de estudioso de V (V2014-004) e um estudioso V plus award (D2016-030) da Fundação para pesquisa do câncer de V e um americano câncer sociedade institucional bolsa de investigação (ACS IRG Grant 58-006-53) para o centro da Universidade de Purdue para câncer Pesquisa. E. G. P. foi apoiado pelo prêmio Borch pós doação ao departamento de farmacologia Molecular e Química Medicinal de Universidade de Purdue.

1. preparações <ol><li>preparar 100 mL de solução hipotônica Buffer r.: 0,3 M de sacarose, o 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA e 0,5% NP-40. Loja a 4 ° c. 
	Nota: Algumas linhas celulares, tais como HEK293T, exigem condições menos rigorosas de Lise. Se núcleos lyse facilmente, utilize d. modificado Buffer r: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 e 10% de glicerol.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 250 mL de solução de x mRIPA 2: pH de Tris 100mm 8.0, 2% NP-40 e 0,5% de sódio Deoxycholate do.</li>
	<li>Preparar um 100 mL de solução de NaCl 5 de M.</li>
	<li>Usando o x mRIPA 2 e soluções de NaCl 5m, preparar 50 mL de solução de x mRIPA 1 para cada uma das seis sal concentrações: 0 mM, 100mm, 200mm, 300mm, 400mm e 500 mM de NaCl. Antes de iniciar o experimento, cool todas as soluções na Ice.</li>
	Linhas sob condições desejadas de células <li>crescer. 
	Nota: Ao determinar os efeitos de derrubando uma proteína, SSE para a linha "knockdown" deve ser comparado com sua células. Estes SSE deve ser executadas lado a lado. Para obter exemplos usando inibidores químicos ou estímulos, consulte seções 3-5.</li>
</ol> 2. Extração de sal sequencial básica <ol><li>colheita 8 milhões de células de cada condição e lavar duas vezes com 5 mL de PBS frio gelo. 
	Nota: É fundamental ter igual número de células que possuem concentrações de proteína equivalente. O número exato de células pode precisar de ser otimizado para linhas de célula individual ou proteínas específicas. É importante não ter muitos, como o aumento nas concentrações de proteína impedirá a observação da curva de eluição, que depende de ligação do equilíbrio. No entanto, com muito poucas células não pode haver proteína suficiente para detectar a curva, e a pelota de cromatina é mais difícil de isolar e podem ser perdidos entre fracções.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão A + inibidores da protease, transferir para tubos de centrífuga de micro de 1,5 mL e top giram sobre inferior a 4 ° c durante 10 min.</li>
	<li>Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g por 5 min a 4 ° c. 
	Nota: Após esta etapa o envelope nuclear ainda deve estar intacto. Se o envelope nuclear está intacto, a pelota re-irá suspender totalmente; no entanto, quando o envelope é lysed e a cromatina é liberada, a pelota não irá re-suspender. Se o envelope nuclear não está intacto após incubação de tampão A, usar modificado A. Buffer</li>
	Inibidores de <li>Adicionar 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl + protease cada pellet de núcleos antes de re-suspender o sedimento. Homogeneizar a amostra cada pipetando 15 vezes com uma pipeta de 1 mL. A pelota deve Ressuspender facilmente, no entanto, os núcleos serão lyse como ele é pipetado e a amostra se tornará espesso e pegajoso e difícil de colocar.
	<ol><li>a fim de elaborar a pelota na ponta, toque final da ponta da pipeta contra o fundo do tubo. A pelota não irá dissolver totalmente uma vez que o DNA é liberado do núcleo, mas pipetagem quebrará cima</li>
	</ol></li> <li>Quando todas as amostras têm sido homogeneizadas, incubar todas as amostras no gelo por 3 min. 
	Nota: O tempo de incubação pode precisar de ser otimizada dependendo da proteína de interesse.</li>
	<li>Pellet de cromatina isolado por centrifugação das amostras por 3 min a 6500 x g a 4 ° c.</li>
	<li>Transferência de sobrenadante para uma centrífuga limpa 1,5 mL tubo. Esta será a fração de 0 mM. Esta solução de mRIPA de 0 mM pode atuar como uma etapa de lavagem para lise dos núcleos e remover qualquer proteínas soltas não associadas com cromatina.</li>
	Inibidores de <li>Adicionar 200 µ l de mRIPA 100 mM NaCl + protease cada pellet de cromatina antes de re-suspender o sedimento. Romper a pelota de cromatina pipetando a pelota e descer 15 vezes. 
	Nota: É fundamental para ser consistente com o número de vezes que a pelota em pipetado.</li>
	<li>Incubar no gelo por 3 min. Esta etapa de incubação permite que todas as amostras alcançar um estado de equilíbrio, que é particularmente importante quando existem múltiplos exemplos.</li>
	<li>Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.</li>
	<li>Repetir 2.6-2.10 para as concentrações de sal restantes. 
	Nota: Após 400 mM NaCl, mRIPA a pelota deve ser clara e como e não vai ficar no fundo do tubo. O sedimento pode ser colocado na tampa do tubo de centrífuga enquanto o sobrenadante isolado.</li>
	<li>Adicionar 70 µ l de 4x do carregamento de proteína tingir de cada fração e carregar 30 µ l de cada fração em um gel do acrilamido do SDS para análise ocidental do borrão. 
	Nota: Para determinar o perfil de ligação da proteína, é fundamental para carregar volumes equivalentes das concentrações de proteína igual lisado, ao invés de carregamento.</li>
	<li>Realizar um western blot padrão transferindo para uma membrana e usar os anticorpos primários para proteínas de interesse.</li>
	<li>Para dosar a proteína eluída da cromatina, incubar o borrão em anticorpos secundários de fluorescência infravermelho IRDye e borrão de imagem com uma câmera. Enquanto podem ser utilizados outros métodos de desenvolvimento, nós recomendamos fluorescência ou imagiologia por infravermelhos, como é mais quantitativa na natureza.</li>
	<li>Uso ImageJ ou software similar para calcular a intensidade para a proteína eluída em cada concentração de sal. Pela representação gráfica da intensidade da banda contra a concentração de sal, pode ser determinado o padrão de eluição de sua proteína do interesse.</li>
</ol> 3. Extração de sal sequencial na presença de um &#34; leitor &#34; inibidor <ol><li>colheita dois conjuntos de células (4 milhões) e isolar os núcleos como um padrão SSE.</li>
	<li>Re-suspender ambos os conjuntos em 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl e incubar durante 3 min. Isso permitirá que a remoção de qualquer proteína livre nos núcleos.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l mRIPA 0 mM de NaCl para cada pellet. Adicionar o inibidor (2 µ l (+) JQ1 a 1 mm) de uma amostra e DMSO para o conjunto de controle.</li>
	<li>Agitar o sedimento por pipetagem 15 vezes e incubar no gelo por 5 min.</li>
	<li>Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.</li>
	<li>Repetir 3.3-4 para todas as concentrações de sal e realizar um western blot padrão.</li>
</ol> 4. Extração de sal sequencial na presença de um &#34; escritor &#34; inibidor <ol><li>tratar as células com o inibidor (10 µM SAHA) ou DMSO por 3 h.</li>
	<li>Colher células 4 milhões para cada tratamento.</li>
	<li>Realizar um SSE padrão para as amostras com o inibidor adicionado para todos os buffers.</li>
</ol> 5. Sequencial sal extração seguinte dano do ADN <ol><li>tratar células com 1 doxorrubicina µM por 1 h.</li>
	<li>Alterar os meios de comunicação sobre as células e lhes permitem recuperar para 3h.</li>
	<li>Colher 8 milhões de células e executar o SSE básico.</li>
</ol> 6. Extração de sal não-sequencial <ol><li>colher 12 milhões de células e lave com PBS.</li>
	<li>Dividir células que existem 2 milhões de células por tubo de centrífuga micro.</li>
	<li>Ressuspender em 500 µ l de tampão A e incubar durante 10 min.</li>
	<li>Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g..</li>
	<li>Re-suspender aglomerados em um 200 µ l de cada um dos buffers de mRIPA + NaCl.</li>
	<li>Homogeneizar cada amostra pipetando 15 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Incubar no gelo por 3 min.</li>
	<li>Isolar a cromatina por centrifugação a 6500 x g e transferir o sobrenadante para limpar os tubos. Adicionar 70 µ l de corante a carregar e executar 30 µ l em um gel de SDS-page para análise ocidental do borrão.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. 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J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Caracterização das interações da proteína e cromatina através da extração de sal é um método comum que tem sido utilizado por décadas de14,15; no entanto, isso não foi sistematicamente otimizado antes de revelar sua utilidade completa. Vamos demonstrar como este método sequencial fornece uma maneira rápida e barata de distinguir entre alterações na ligação de cromatina quando a proteína ou o ambiente é alterado. SSE é altamente adaptável e otimizável e importante, é tecnicamente simples e exige nenhum equipamento especializado. São os principais aspectos que precisam ser otimizadas antes de começar: começando o número do celular, tampão hipotônica condições e tempo de incubação.
O aspecto mais importante do número do celular é que é consistente entre todas as amostras. Quando se olha para complexos de BAF, usando células 8 milhões dá um bom perfil de como estes complexos são obrigatórias; no entanto, o número de células (ou a quantidade de buffer) pode precisar ser ajustada dependendo da abundância da proteína de interesse. É importante notar que usar menos células é um desafio porque é difícil de visualizar a pelota de cromatina em 400 mM e 500 mM de NaCl. É vital para garantir que o sedimento não é transferido com o sobrenadante após 400 mM de NaCl.
Para avaliar com precisão as proteínas nucleares, os núcleos devem permanecer intacto até eles lysed com 0 mM NaCl mRipa solução. Muitas soluções hipotônicas comumente usadas são ásperas demais linhas de células como as células HEK293T e HeLa. Para estas linhas de celular, é aconselhável usar o tampão modificado A.
Finalmente, o tempo de incubação pode variar dependendo da experiência. Para subunidades BAF o padrão de eluição não muda entre um 3 min e 10 min de incubação; no entanto, a eluição do complexo PRC1 altera drasticamente dependendo de quanto tempo as amostras são incubadas. Além disso, ao avaliar o efeito de um inibidor da ligação de seu alvo, o tempo de incubação pode precisar ser otimizada dependendo da cinética de inibidor.
Ao realizar o experimento, é importante ser tão consistente quanto possível com o tratamento das amostras. Para cada fração, o buffer de sal deve ser adicionado para cada amostra antes da homogeneização, para que cada amostra é igualmente exposta. O ponto de pipetagem é interromper o lançamento de cromatina e ajuda as proteínas acopladas. É importante se certificar de que a pelota passa a ponta da pipeta. Especialmente quando se utiliza um maior número de células, a pelota de cromatina é um desafio para passar a ponta da pipeta nas primeiras vezes. Achamos que uma dica de 1ml funciona melhor para isso, como com menor batida da ponta contra o fundo do tubo de centrífuga micro, somos capazes de elaborar a pelota na ponta. Depois de passar a pelota de cromatina pela ponta quinze vezes, a pelota deve percorrer suavemente a ponta, embora não se dissolverá. Após a incubação as amostras no gelo e isolando a cromatina por centrifugação, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta 200 µ l permite a máxima remoção sem interromper a pelota de cromatina.
Embora SSE requer consistência técnica, é simples, direta e podem ser executada com recursos de laboratório comuns. É importante notar que o verdadeiro poder deste método é quando está acoplada com outros exames fenotípica. Por exemplo, usando esta técnica, comparamos os perfis de ligação de PBRM1, quando cada um dos seus seis bromodomains foram uma mutação, determinamos que todos os bromodomains estavam envolvidos na ligação de PBRM1 para diferentes graus7. Curiosamente, descobrimos que o bromodomains que foram as mais importantes para vinculação também foram essenciais para PBRM1 regulação da expressão gênica e controle de proliferação celular7. Nós também validado as alterações na ligação dos mutantes para um locus genômico discreto pelo quantitativo ChIP-qPCR7.
Mostramos apenas alguns exemplos de como esta técnica pode ser usada para estudar as interações proteína-cromatina; no entanto, em nosso laboratório, nós encontramos que o SSE é uma ferramenta versátil para investigar um vasto leque de perguntas sobre a cromatina leitor de proteínas. Em combinação com outras análises, essa técnica facilita nossa capacidade elucidar a funcionalidade dos componentes compreendendo estas elaborar complexos da proteína. Compreendendo a importância dos domínios individuais, podemos identificar se eles são alvos terapêuticos para o desenvolvimento de um inibidor que bloqueia a associação de cromatina.
Nós demonstramos como SSE pode ser expandido para avaliar a eficácia de um inibidor de pequena molécula na ligação às proteínas a cromatina. Além disso, inibindo escritores epigenéticas e borrachas, SSE pode determinar a relação entre os níveis PTM e proteínas do leitor. Também mostramos que o SSE pode ser usado para determinar as alterações na ligação em resposta a estímulos externos, tais como danos ao DNA. Embora esta é uma técnica simples, quando aplicado em condições adequadas, isso pode extremamente aumentar o nosso conhecimento da cromatina e suas proteínas reguladoras.

Regulamento de ADN em células eucarióticas é um sistema complexo e sofisticado que é rigidamente controlado por uma variedade de proteínas que coordenar as respostas aos estímulos intracelulares e extracelulares. DNA é acondicionada em torno do histone octamers para os nucleossomas formulário, que podem ser livremente distribuídos ao longo do DNA ou compactados em bobinas apertado1. Este arranjo estrutural do DNA e histonas é conhecido como cromatina, que é regulada por uma rede de proteínas que ler, escrever e apagar post modificações translacional (PTM) em histonas2. Alguns histona PTMs, tais como a acetilação, mudar a carga de aminoácidos que são depositados, alterando as interações entre histonas e DNA2. Histona PTMs servem também para recrutar reguladores transcricionais, empresas de reestruturação da cromatina, maquinaria de reparo de dano de DNA e maquinaria de replicação do DNA para regiões específicas do genoma3.
A maioria dos métodos para o estudo de interações de cromatina ou sonda interações de pequena escala ou envolvem grandes análises de todo o genoma. Estudos de ligação in vitro , frequentemente, utilizam domínios individuais recombinantes com peptídeos de histona ou DNA, em ensaios, tais como ensaios de turno electroforese mobilidade (EMSA), Calorimetria de Titulação Isotérmica, polarização de fluorescência e peptídeo pulldowns. Porque estes ensaios geralmente se concentram em um domínio de proteínas individuais, eles facilitam a compreensão de uma pequena peça do puzzle, mas não nos permitem compreender a natureza cooperativa de proteínas de vários domínios, muito menos seu papel em várias proteínas complexos. Outra camada de complexidade é adicionada pela composição heterogênea dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Esta heterogeneidade de proteína, em combinação com a natureza dinâmica da paisagem da cromatina, torna desafiador para recapitular o na vivo vinculando interações de proteínas da cromatina a cromatina em vitro.
Métodos in vivo têm feito avanços significativos; no entanto, eles são muitas vezes caro, demorado e tecnicamente desafiador. Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq) é muito útil para determinar a localização de proteínas e modificações do histone através do genoma, porém requer substancial otimização4. As proteínas são frequentemente quitosana a cromatina para preservar as interações; no entanto, isto pode produzir interações artificiais e pode causar o epítopo mascaramento5. Além disso, as moleculas (IP) requerem anticorpos altamente específicos e otimização extensiva de DNA cisalhamento e condições IP por ChIP-qPCR usando um sítio de ligação conhecida, que muitas vezes não é disponível a priori. Após a otimização das condições de ChIP, processamento das amostras é dispendioso e requer várias semanas ou meses para sequenciar e analisar. Embora este método é inestimável para identificar a localização da cromatina ligado proteínas através do genoma, o custo e compromisso de torná-lo proibitivo para usar esse método para gerar hipóteses sobre como pequenas mudanças podem afetar Propriedades de associação global .
Neste artigo, descrevemos como um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) pode ser usado para examinar os perfis de ligação global de proteínas da cromatina-limite e distinguir como as alterações em uma proteína, complexo, ou global PTM perfil podem alterar interações. Apesar de extração de sal é uma técnica comum e amplamente utilizada, demonstraremos como esse método sequencial é altamente reprodutível e versátil. SSE nos permite caracterizar como uma única subunidade de um complexo ou até mesmo um único domínio contribui para afinidade geral do complexo da cromatina em massa. SSE pode também ser usado para determinar se a ligação de uma proteína é influenciada pelas alterações na paisagem de cromatina, fornecendo hipóteses interessantes para o direcionamento de marca de histona que podem ser confirmados usando ChIP-seq e outros estudos de ampla do genoma.
Adaptamos, originalmente, esse método de Wu et al., para examinar a função de Polybromo1 (PBRM1) na ligação do PBAF cromatina remodeler6,7. Usando esta técnica, determinou o papel de PBRM1 para ligação de cromatina dentro a cromatina PBAF remodelação complexa e determinado a contribuição relativa das seis bromodomains individuais para esta função7.
Aqui descrevemos como otimizar esse método para explorar a ligação da cromatina em diferentes tipos de células, para avaliar a afinidade obrigatória relativa da cromatina semelhante modificando complexos, para examinar o deslocamento de uma proteína de cromatina por um inibidor químico, e para determinar os efeitos da ligação de cromatina após alterações à paisagem da cromatina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Elucidação das propriedades de ligação de proteínas da cromatina-direcionamento pode ser muito desafiador devido à natureza complexa da cromatina e a heterogeneidade dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Para superar estes obstáculos, adaptámos um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) para avaliar as afinidades de ligação relativo dos complexos ligados a cromatina. Este ensaio fácil e simples pode ser usado por não-especialistas para avaliar a diferença relativa na vinculação afinidade de dois complexos relacionados as mudanças na afinidade de um complexo quando uma subunidade é perdida ou um domínio individuais é inativado e a mudança na afinidade de ligação após alterações à paisagem da cromatina. Suspendendo sequencialmente re-cromatina em massa no aumento da quantidade de sal,... somos capazes de perfil de eluição de uma proteína específica da cromatina. Usando esses perfis, somos capazes de determinar como as alterações em um complexo de cromatina-modificando ou alterações no ambiente de cromatina afetam as interações de ligação. SSE de acoplamento com outros ensaios in vitro e em vivo , podemos determinar os papéis de domínios individuais e proteínas sobre a funcionalidade de um complexo em uma variedade de ambientes de cromatina.

Neste artigo, vamos demonstrar as vantagens e aplicações do método comumente usados extração sequencial de sal (SSE) que nós adaptamos do literatura6. Na Figura 1, comparamos a reprodutibilidade do SSE para extrair proteínas não sequencial, detectando os padrões de eluição de ARID1a e PBRM1. Consistentemente, observamos que ARID1a, uma subunidade BAF, elutes principalmente em 200 mM NaCl e PBRM1, uma subunidade PBAF exclusiva, elutes principalmente a 300 mM de NaCl. A Figura 1a mostra três repetições independentes de SSE com 8 milhões de células de OVCA429. Figura 1b retrata uma extração de sal não-sequencial onde núcleos isolados de 2 milhões de células foram re-suspensos em um único buffer de sal. Embora ambos os métodos concluem que ARID1a elutes em 200mm e PBRM1 elutes a 300mm, SSE produz um perfil de ligação bem definidas e permite uma distinção clara da ligação destes dois complexos. Além disso, o método não-sequencial, a quantidade de proteína eluída nos buffers de NaCl de 400 mM e 500 mM é inferior a 300 mM e é inconsistente entre as três repetições. Embora esse problema pode ser resolvido com mais otimização de velocidade de tempo e centrifugação de incubação, isto ilustra a vantagem de reprodutibilidade de SSE.
Através da nossa otimização, achamos que outros complexos de cromatina podem exigir mais tempo para ser eluídos. Na Figura 2, podemos demonstrar que o ativador transcricional, PBAF, elutes de cromatina consistentemente entre Zee com tempos de incubação de 3 min e 10 min. Em contraste, a eluição do transcricional repressor, Polycomb 1 complexo repressivas (PRC1), indicada pela BMI-1, requer um tempo de incubação para ser liberado de cromatina8. Este fenômeno pode ser devido a PRC1 sendo localizado em regiões mais compactas e inacessíveis do genoma, ou poderia ser devido à cinética de ligação diferencial para os dois complexos.
Após a otimização para uma proteína particular, Zee pode ser usado para estudar como a força de ligação às proteínas é alterado em condições diferentes. SSE pode ser usado para examinar a eficácia de um inibidor de interações da proteína-proteína. Para demonstrar este conceito, utilizamos o (+) JQ1, que é um inibidor de bromodomain de BRD4, para examinar como ele alterado BRD4 ligação (Figura 3a)9. Estamos isolados de núcleos de células de OVCA429 4 milhões. Para remover qualquer BRD4 não acoplado, realizou-se uma lavagem inicial 0 mM em ambas as amostras. Em seguida, uma norma que SSE foi realizada com DMSO ou 1 µM (+) JQ1 adicionado para cada fração. As amostras foram incubadas por 5 min. Observamos que BRD4 elutes anteriormente na presença de inibidor em comparação com DMSO. Para mostrar que (+) JQ1 é específico para BRD4, nós apagados para ARID1a e não vi nenhuma mudança na eluição (Figura 3b).
Em seguida, examinamos como o emperramento da proteína pode ser alterado quando a paisagem da cromatina é modificada. BRD4 contém dois bromodomains que reconhecer resíduos de lisina acetilado em caudas de histona10. Para aumentar o nível de acetilação da histona, tratámos de células OVCA429 com 10 µM de histona deacetilase inibidor suberanilohydroxamic ácido (SAHA) por 3 h. SAHA (10 µM) foi adicionado para todos os buffers durante o SSE. Ao aumentar os níveis de acetilação da histona global, observamos um aumento na BRD4 de ligação (figura 4a). Quando a mancha para ARID1a, observamos a vinculação mais apertada de ARID1a, bem como, que não é surpreendente porque subunidades do complexo, como BRG1, BRM e BRD9, o BAF todos contêm bromodomains10,11 (figura 4b).
Por último, para expor como SSE pode ser usado para olhar como o emperramento da proteína muda quando células experimentam alterações genômicas, induzimos quebras de DNA encalhadas dobro com o inibidor de topoisomerase II, doxorrubicina12. Nós tratados HEK293T células com 1 µM de doxorrubicina por uma hora e permitido células para recuperar durante três horas. Depois de executar o SSE, estamos destruídos por PBRM1, que está envolvida no DNA de reparação de danos13. Observamos dois picos para ligação de PBRM1: uma para 300 mM e uma de 500 mM de NaCl (Figura 5). Isto sugere que uma parte da população PBRM1 é obrigatório normalmente, mas um subconjunto de PBRM1 é mais rigidamente vinculado a cromatina seguindo o dano do ADN. Este é apenas um exemplo de como usar SSE para examinar como interações de cromatina são alteradas em resposta a diferentes estímulos externos.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55369/55369fig1.jpg"> 
Figura 1: Não-sequencial em comparação com extrações sal sequenciais em células OVCA429 A) Immunoblots e quantificação de independente de três Replica de perfis de eluição ARID1a e PBRM1 pelo método de extração de sal sequencial. B) Immunoblots e quantificação de três repetições independentes de perfis de eluição de ARID1a e PBRM1 no método de extração de sal não-sequencial. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/55369fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55369/55369fig2.jpg"> 
Figura 2: Comparação dos tempos de incubação de perfis de eluição PBAF e PRC1 A) comparação dos perfis de eluição PBAF (PBRM1) com tempos de incubação de 3 e 10 minutos. B) a comparação de PRC1 perfis de eluição (IMC-1) com tempos de incubação de 3 e 10 minutos. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/55369fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55369/55369fig3.jpg"> 
Figura 3: Eficácia do (+) JQ1 em inibir a ligação BRD4 A) padrão de eluição de BRD4 na presença de 1 µM (+) JQ1 em relação ao controle de DMSO em células OVCA429. B) perfil de eluição de ARID1a na presença de 1 µM (+) JQ1 em relação ao controle de DMSO em células OVCA429. Intensidade da banda é indicada para 0 mM - fração de 500 mM com DMSO ou (+) JQ1.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/553 href=""></a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/553>69fig3large.jpg"target = blank" &gt; clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55369/55369fig4.jpg"> 
Figura 4: Alterações na ligação quando cromatina ajardinada é modificada A) comparação da eluição de BRD4 de OVCA429 células tratadas com 10 µM SAHA por 3 horas em relação ao tratamento de DMSO. B) perfis de eluição de ARID1a de OVCA429 células trataram µM with10 SAHA comparado com DMSO. Intensidade da banda é indicada para fração mM 0-500 mM com DMSO ou Santos. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/55369fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55369/55369fig5.jpg"> 
Figura 5: Alterações na ligação de PBRM1 depois de dano do ADN SSE resultados para ligação de PBRM1 de HEK293T células tratadocom com 1 µM doxorrubicina. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55369/55369fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K visualizações.  Purdue University. Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genética

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...