この研究はテキサス州ヒューストンのテキサス大学MDアンダーソンがんセンター（スタートアップファンド、BB）の支援を受けていました。

1.ソリューションの準備<ol><li> 実験ごとに以下の解決策を用意してください。 <ol><li> 固定溶液は37％ホルムアルデヒドを調製し、室温で保存します。 1.42％の最終濃度になるように1倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。 注意：ホルムアルデヒドは刺激性、腐食性、突然変異誘発性、催奇性、発癌性に分類されます。摂取しないでください。ガス/フューム/蒸気/スプレーを吸入してはならない。換気が不十分な場合は、適切な呼吸器を着用する。皮膚や眼との接触を避ける。酸化剤、還元剤、酸、アルカリ、水分などの不適合物を避けてください。 </li><li>グリシン停止 - 固定溶液については、1×PBS溶液中に0.125Mグリシンを調製し、室温で保存する。 </li><li>細胞掻爬溶液のために、dH 2 O中の1 × PBS溶液を調製し、氷上に保存する。使用直前に、プロテイナーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）t0.5mMの最終濃度。 注意：PMSFは腐食性および有毒性に分類されています。保護服を着用し、換気の良い場所で使用すること。 </li><li>細胞溶解バッファー（20 mM Tris-HCl; pH 8.0,85 mM KClおよび0.5％NP40）を使用する直前に、1Xプロテアーゼインヒビターカクテル（PIC;ジメチルスルホキシド（DMSO）中100Xストック溶液：104 mM 4- （AEBSF）、80μMアプロチニン、4mMベスタチン、1.4mM E-64,2mMロイペプチン、および1.5mMペプスタチンA）および0.5mM PMSFを添加した。 </li><li>核溶解緩衝液（50mM Tris-Cl; pH8.0,10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および1％SDS）を使用する直前に、1X PICおよび0.5mM PMSFを加える。 </li></ol></li></ol> 2.細胞固定およびせん断<ol><li> 10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80％のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。 </li><li>組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。 </li><li>固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1x PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。 </li><li>グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。 </li><li> 600 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。あるいは、液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80℃で保存します。 </li><li>ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。 </li><li>細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、2,400 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37℃で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼ（1U /μL）を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37℃で5〜20分間インキュベートする。 2分ごとにサンプルを反転させる。 注：時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。 </li><li> あるいは、市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。 注：超音波条件は最適化が必要です。 300μLのサンプル容量と25％のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。 <ol><li>ステップ2.10の後、上清を捨て、nを再懸濁する1.0mLの商業的剪断緩衝液中に溶解した。 </li><li> 300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。 </li><li>最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25％出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する： それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。 </li><li>以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。 </li></ol></li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために7μLの氷冷0.5M EDTAを加える。 </li><li>剪断したDNAで16,200 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。 50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断（セクション3）。免疫沈降（セクション4）のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。 </li></ol> 3.せん断効率の確認<ol><li>ステップ2.16のせん断された染色質の50μLアリコートに150μLのヌクレアーゼフリーdH 2 Oおよび10μLの5M NaClを加える。 </li><li>サンプルを65℃で4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。 </li><li> 2μLのRNase A（10μg/μL）を添加し、サンプルを37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>プロテイナーゼK（0.5μg/μL）10μLを添加し、サンプルを42℃で90分間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う12 。 <ol><li>ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。 200μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。 </li><li>室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。 </li><li> 0.1M容の3M酢酸ナトリウム（NH 4 OAc）（pH4.2）を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。 2.5容量の氷冷した100％エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。サンプルO / Nを-20℃でインキュベートするか、-80℃で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃、16,000 xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。 </li><li>ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。 1mLのRT、70％エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。 </li><li> 4℃、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。 </li><li>ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。ペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 </li></ol></li><li> 1％TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。 注：成功したクロマチン剪断は、200-1,500 bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程（ステップ2.12）のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。 </li><li>残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する（ステップ2.16）。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる（セクション4）。 </li></ol>免疫沈降<ol><li> 25μLのChIPグレードプロテインG磁気ビーズ、10μLの免疫沈降希釈緩衝液（ストック溶液：0.01％SDS、1.1％Triton X-100,16.7mM）と10-25μgの剪断架橋クロマチン（ステップ2.16）トリス-HCl; pH8.0,1.2mM EDTA、および167mM NaCl）、および1μLのPICを含む。 </li><li> 4時間のインキュベーションの後、1〜10μgの抗体（抗体濃縮物抗体の親和性に基づいて変化する;製造業者の推奨に従って最初に使用し、必要に応じて実験的に最適化する）を1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、dH 2 Oを最終容量100μLに加える。 注：上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。 </li><li>サンプルを4〜12時間4℃でエンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li></ol>溶出<ol><li>磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。 </li><li>洗浄緩衝液1（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA pH8,20mM Tris-HCl; pH8,150mM NaCl）800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li> 800μLの洗浄緩衝液2（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA; pH8,20mM Tris-HCl pH8および500mM NaCl）でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li>ビーズを50μLの溶出バッファー（1％SDSおよび100mM NaHCO 3 ）に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。 </li><li> 6μLの5M NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK（0.5μg/μL）を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65℃で2時間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、phenol /クロロホルム抽出12 （ステップ3.5）、続いてペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 注：サンプルはタンパク質結合部位（セクション5）について直接解析することも、-20℃で保存することもできます。 </li></ol> 6.結合部位分析<ol><li> PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。目的のタンパク質結合部位を架橋する150〜400 bpのアンプリコンを合成するためのプライマーを設計します （ 図1 ）。 </li><li>目的の抗体で免疫沈降したChIP由来のDNA、非特異的なIgG抗体で免疫沈降させたChIP由来のDNA、iii）入力DNA、およびiv）H 2 Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。汚染を排除するためのPCRの陰性対照。経路刺激の場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。 注：c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）でPCRを行う。 </li></ol>

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

この報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。 クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合を誘導する刺激を特徴づけ、タンパク質が結合するDNA配列を特徴付ける強力なツールである。後者の情報は、目的の特定のタンパク質によって調節される遺伝子の同定を助けることができ、ChIP-on-chip、ChIP-seq、またはクローニング戦略7,8,9の使用によって達成される。 ChIPとDNA-タンパク質結合を実証する他の方法との大きな利点の1つ例えばEMSAまたはDNase Iのフットプリントは、ChIP技術において、結合がインビボで捕捉され 、他のものではインビトロで行われるということである 。したがって、ChIPは、細胞の状況でのDNA-タンパク質の結合についての洞察を提供するが、他の技術は単離されたシステムを表す。 しかし、ChIP分析は複雑で、結果に影響を与える可能性のある複数のステップが必要であり、最適化と経験が必要です。成功したChIPにとって重要な第1のステップの1つは架橋ステップ（ステップ2.2）である。 UV架橋は不可逆的であり、したがって、ChIPには不適当である。ホルムアルデヒド架橋が好ましいが、ホルムアルデヒド濃度および架橋時間は両方ともクロマチン剪断および抗原沈降の効率に影響を及ぼし得る。一般に、低いホルムアルデヒド濃度（1％w / v）およびより短い架橋時間（5〜10分）が、せん断効率を改善するので、好ましい。しかしながら、ホルムアルデヒドは効率的ではないタンパク質とタンパク質との架橋において、したがってDNA16に直接結合しないタンパク質に対しては最適ではない。そのような場合、ChIPは2段階アプローチで行うことができます。このアプローチでは、最初にグルタール酸ジスクシンイミジルなどの架橋剤を使用してタンパク質 - タンパク質架橋を行い、続いてホルムアルデヒド媒介DNA-タンパク質架橋を行います17 。 次の重要なステップはクロマチン剪断である。我々の研究では、マイクロコッカスヌクレアーゼを用いた酵素的剪断を用いた。酵素的剪断は、超音波処理がDNA-タンパク質結合を破壊する非架橋ネイティブChIP（N-ChIP）に特に有用である。 N-ChIPは主にヒストンおよびヒストン修飾因子の分析に使用されます18 。ミクロコッカールヌクレアーゼは比較的非特異的エンドエキソヌクレアーゼと考えられているが、配列特異的切断を誘発することが示されている19 。これは、結果として生じるフラに配列依存性のバイアスをもたらす可能性がある特定の遺伝子座の過剰表現20 。超音波処理は、配列偏りを伴わずに無作為にサイズの決められたDNA断片を作製し、一般に架橋ChIP（X-ChIP）に好ましい。しかし、音波処理条件は、各細胞または組織タイプおよび超音波処理機モデルについて経験的に決定されなければならず、得られるDNAフラグメントは一般に酵素的せん断よりも大きい16 。また、サンプルの超音波処理または乳化は、タンパク質の変性および分解による抗体エピトープの消失をもたらし得る。 免疫沈降工程は、ChIPの結果に大きく影響する別の重要なステップである。アガロースビーズはDNAを非特異的に結合し、添加されるビーズの数の変動は特定のシグナル対バックグラウンド比に影響を及ぼし得る。したがって、アガロースビーズ「スラリー」をDNA-タンパク質サンプルに添加する際に十分に懸濁された状態に保つことが重要である。本発明に使用される抗体一般に、ChIP等級の抗体を用いるべきであり、これらが入手できない場合には、少なくとも免疫沈降グレードの抗体が好ましいはずである。特定のエピトープは架橋中にマスクすることができるので、ポリクローナル抗体はいくつかのエピトープを認識するので有利である。添加される抗体の量は、沈殿する因子を超えるべきであり、したがって、各因子/抗体について経験的に決定されるべきである。また、抗体結合の平衡に達するための動力学は各抗体ごとに異なるので、最適なインキュベーション条件を各抗体について決定しなければならない。 いくつかのコントロールを実験セットアップに含めることができます。特定のDNA-タンパク質結合反応の誘導が評価される場合、最終分析（ すなわち、 PCRまたはqRT-PCR）において等しい鋳型DNA量を示すために、入力DNA対照を含むことが重要である。抗体コントロールが必要です目的のタンパク質の免疫沈降の特異性を確認する。通常、アイソタイプが一致した免疫グロブリンはネガティブコントロールとして適していますが、アガロースビーズも使用できます。場合によっては、陽性対照を用いてChIPの機能的実験フローを確認し、この目的のために抗ヒストン抗体が頻繁に使用される。刺激実験において、好ましい陽性対照は、関心対象のタンパク質の免疫沈降であり、引き続いて、タンパク質が刺激の際に結合する既知のDNA領域についての配列分析である。我々の代表的な結果では、PAI-1プロモーター内のSBEを、TGF-β1誘導SMAD結合の既知の標的として使用した。刺激されたタンパク質結合のない実験では、目的のタンパク質の標的ではないことが分かっているDNA配列を、その後のDNA分析に使用することができる。 DNA分析に関しては、汚染を排除するために鋳型DNAなしの反応を含めることが重要である。 ChIPは目的のタンパク質の遺伝子への結合を直接実証する優れた技術です。しかし、それは機能的な研究ではない。目的のタンパク質が調節的役割を有すると考えられる場合、レポーター遺伝子に基づくアッセイ（ 例えば、ルシフェラーゼ）などの機能的アッセイもまた必須である。これらのプロトコルでは、目的の遺伝子がレポーター遺伝子の調節位置にクローン化される。関心のある遺伝子の誘導は、それが調節機能を有する場合、レポーター遺伝子の発現をもたらす。対象の特異的タンパク質の調節的役割のさらなる確認のために、DNA結合タンパク質が遺伝子的にサイレンシングされるノックダウン細胞またはノックイン細胞を生成することができる。追加の対照として、調節遺伝子中のタンパク質結合部位を突然変異させて目的のタンパク質の結合を防止することができる。後者の2つの実験設計のいずれにおいても、細胞刺激は、マーカーgの発現をもたらさないエン

真核生物の核において、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。生理学的、病態生理学的および細胞生物学的状況において、細胞機能は、クロマチン配位遺伝子発現によって空間的および一時的に制御される。 DNA-タンパク質相互作用は、DNA複製、組換え、および修復、ならびにタンパク質発現などの細胞プロセスの調節において必須の役割を果たす。したがって、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子発現および細胞機能の評価において不可欠なツールである。 電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリンティング1,2など、インビトロでのDNA-タンパク質相互作用を評価するいくつかの技術が存在する。しかしながら、これらの技術は、クロマチンおよび細胞の状況におけるタンパク質-DNA相互作用を分析しない。チップI特定のDNA結合部位に結合したタンパク質を捕捉し、それによってクロマチンの状況におけるDNA-タンパク質相互作用の同定を容易にする技術である。この技術は、もともとGimourとLisによって、 Escherichia coliおよびDrosophila melanogaster 3,4 における特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼII結合の評価のために開発されました。これは、DNA-タンパク質複合体の固定化、その後のクロマチン抽出および約200塩基対（bp）断片へのDNAの切断によって行われる。続いて、目的のDNA結合タンパク質を免疫沈降によって単離する。 DNA-タンパク質架橋の逆転後、DNAを精製し、分析する。タンパク質結合部位の分析にはいくつかの方法を用いることができ、標的遺伝子5内のタンパク質結合部位の核酸配列に依存する5 。 DNA配列が既知である場合、標準的なPol既知の結合部位に隣接する特定のプライマー対を用いて、イメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用することができる。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）も使用できます6 。配列が未知である場合、ChIPはDNAマイクロアレイ（ChIP-on-chip）、DNA配列決定（ChIP-seq）、またはクローニング技術7,8,9と組み合わせることができる。 TGF-β経路は強力な腫瘍抑制機能を有し、細胞分化の鍵となる経路である。それはTGF-β1リガンドの同族受容体複合体への結合によって活性化され、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらす。共通のメディエーターであるSMAD4との会合後、SMAD複合体は核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内のSBEに結合し、細胞周期、アポトーシスおよび細胞の区別を制御する遺伝子を制御するに。 TGF-β刺激に対する転写応答は、細胞型および状況特異的である10 。最近、我々は、TGF-βとc-KIT経路11との間の正のフィードバックループを記載した。このモデルでは、TGF-β1活性化SMAD2はc-KITリガンドプロモーターに結合し、その発現および分泌を誘導する。続いて、c-KITリガンドは、c-KIT受容体を自己および準クリニック様式で活性化する。 c-KIT受容体活性化は、JAK1 / 2を介したSTAT3 Tyr705リン酸化をもたらす。 STAT3活性化および核移行後、STAT3はTGF-β1リガンド遺伝子に結合し、その発現を調節する。 ここでは、我々は、c-KIT受容体リガンドプロモーターへのSMAD2結合の同定、およびシグナルトランスデューサー（および）転写3（TGF-β1-遺伝子）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">HepG2 cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Hep3B cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">TGF-&#946;1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>101-B1</td>
			<td>Used at a concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-SMAD2 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5339</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4904</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">37490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&#8217;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

DNA複製および修復、DNA組換えおよび遺伝子発現を含む複数の細胞プロセスは、タンパク質とDNAとの相互作用を必要とする。したがって、DNA-タンパク質相互作用は、細胞分化、細胞増殖、細胞周期制御、染色体安定性、エピジェネティックな遺伝子調節、および細胞形質転換などの複数の生理学的、病態生理学的および生物学的機能を調節する。真核細胞では、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリントなど、いくつかの技術的ツールを用いてDNA-タンパク質相互作用を分析することができる。しかし、これらの技術は、細胞内ではなく、インビトロでタンパク質-DNA相互作用を分析する。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、特定のDNA結合部位でタンパク質を捕捉し、それによってDNA-タンパク質相互作用の同定を可能にする技術であるそれらのクロマチンの文脈内にある。これは、DNA-タンパク質相互作用の固定化、続いて目的のタンパク質の免疫沈降によって行われる。続いて、タンパク質が結合したゲノム部位が特徴付けられる。ここで、我々はChIPを記載し、議論し、チロシンキナーゼのプロモーター領域内のSMAD結合要素（SBE）への転写因子SMAD2の形質転換成長因子-β（TGF-β）誘導結合の同定のための分析値を示す。プロテインキナーゼキット（c-KIT）受容体リガンド幹細胞因子（SCF）。

TGF-β1リガンドのその同族受容体複合体への結合は、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。 SMAD複合体は核に移行する。 TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間接的に、遺伝子転写を調節することができる。 c-KITリガンドSCFがSMAD2のそのプロモーターへの直接的なTGF-β1誘発結合によって転写的に調節されるかどうかを試験するために、本発明者らは、SCF遺伝子のSCFプロモーターを含む2.4kb、5&#39;-フランキング領域をSMAD2結合モチーフ、5&#39;-AGAC-3 &#39;（SBE） 13,14 。我々は、7つの推定SBEsアップSCF開始コドンのトリム（ 図1A ）。 SCFプロモーターへのSMAD2のTGF-β1誘発結合を確認するために、本明細書に記載のChIPアッセイを行った。 TGF-β1処理は、ヒト肝臓癌細胞株HepG2およびHep3B細胞（ 図1B ）においてSCFプロモーターにSMAD2が結合する結果となった。 TGF-β1刺激の非存在下では、SMAD結合は認められなかった。 TGF-β1誘導SMAD活性化の陽性対照として、PAI-1に対するChIPが実施された。 PAI-1プロモーターは、TGF-β/ SMAD13の既知の標的である。 SMAD2免疫沈降の特異性を確認するために、非特異的IgG抗体を用いた。 SBEへのSMAD2の結合は、IgGによる免疫沈降後に認められなかった。 ChIP技術の別の実証のために、本発明者らは、TGF-βリガンド遺伝子の5 &#39;隣接領域を、STAT3コンセンサス結合モチーフ5&#39;-TT（N4）AA-3 &#39;および5&#39;-TT（N5）AA-3&#39; 15 。我々は、-4384 / -4373（STB-1）および-5365 / -5357（STB-2）の位置（ 図2A ）のTGFB開始コドンの2つの推定上のSTAT3結合部位を同定した。 STAT3のTGF-βリガンド遺伝子へのTGF-β1誘導結合を確認するために、TGF-β1処理HepG2およびHep3B細胞を用いてChIPアッセイを行った。 TGF-β1処理は、TGFB遺伝子の第2の推定上のSTAT3結合部位（STB-2）に結合するが、第1のもの（STB-1）には結合しなかった（ 図2B ）。この実施例では、STB-2への正のSTAT3結合が内部陽性対照として働く。上記のChIP実験と同様に、STB-2へのSTAT3の結合は、IgGを用いた免疫沈降後も見られなかった。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig1.jpg" /> 図1 <str<html> ong&gt;：SCFプロモーターへのTGF-β誘発SMAD2結合。 （ A ）開始コドンとの相対的な位置をボックス（白いボックス= AGAC）として示す推定SBEを有するSCFプロモーターの模式図。 ChIPプライマーの位置を以下に示し、 SCF開始コドンとPCR産物のサイズとの相対的な位置を示す。 （ B ） SCFプロモーターへのSMAD2結合のChIP。 TGF-β1処理および未処理のHepG2およびHep3B細胞のクロマチン - タンパク質複合体を抗SMAD2抗体で免疫沈降させた。 SCF特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、SMAD2免疫沈降特異性の確認のために、非特異的IgGによる免疫沈降後のPCR結果を示す。下のパネルに示すように、 PAI-1へのSMAD2結合に対するChIPを陽性対照として用いた。ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55689/55689fig2.jpg" /> 図2 ：TGF-β誘導TGF-β遺伝子へのSTAT3結合。 （ A ）TGF-β遺伝子の概略図であり、推定STAT3結合部位は、開始コドンに対するそれらの相対位置を有する灰色のボックスとして示されている。 ChIPプライマーの位置は、以下に示すTGF-β開始コドンおよびPCR産物サイズに対するそれらの相対的な位置とともに示される。 （ B ）TGF-β1がSTAT3とTGF-β遺伝子との結合を誘導するChIP。 TGF-β1処理および未処理のHepG2およびHep3B細胞のクロマチン - タンパク質複合体を抗STAT3抗体で免疫沈降させた。 TGF-β特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、PCR非特異的IgGによる免疫沈降後の結果が、STAT3免疫沈降特異性の確認のために示される。上のパネルはSTAT3結合部位1（STB-1）に特異的なプライマーを用いたPCR結果を示し、下のパネルはSTAT3結合部位2（STB-2）へのSTAT3結合の結果を示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55689/55689fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K ビュー.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。 

ビデオ: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

遺伝学

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mapping Alzheimer's Disease Variants to Their Target Genes Using Computational Analysis of Chromatin Configuration

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, because the majority of the genome-wide significant (GWS) loci fall onto the non-coding genome, the functional impact of many remain unknown. Three-dimensional chromatin interactions identified by Hi-C or its derivatives can provide useful tools to annotate these loci by linking non-coding variants to their actionable genes. Here, we outline a protocol to map GWAS non-coding variants to their putative genes using Alzheimer&#39;s disease (AD) GWAS and Hi-C datasets from human adult brain tissue. Putative causal single-nucleotide polymorphisms (SNPs) are identified by application of fine-mapping algorithms. SNPs are then mapped to their putative target genes using enhancer-promoter interactions based on Hi-C. The resulting gene set represents AD risk genes, as they are potentially regulated by AD risk variants. To garner further biological insights into molecular mechanisms underlying AD, we characterize AD risk genes using developmental brain expression data and brain single-cell expression profiles. This protocol can be expanded to any GWAS and Hi-C datasets to identify putative target genes and molecular mechanisms underlying various human traits and diseases.

We present a protocol to identify functional implications of non-coding variants identified by genome-wide association studies (GWAS) using three-dimensional chromatin interactions.

クロマチン構成の計算解析を用いたアルツハイマー病変異体の標的遺伝子へのマッピング

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, ...