Os autores agradecem a Nandini Nallappan e a Sharon Yeo por ajudar com as etapas técnicas. O estudo foi financiado por um Subsídio de Início para KGC da Escola de Medicina Lee Kong Chian, da Universidade Tecnológica de Nanyang e por um Prêmio de Cientista de Clínicos Sênior do Conselho Nacional de Pesquisa Médica do Ministério da Saúde de Singapura (NMRC) para LT (NMRC / CSA / 045/2012) e por uma doação do NMRC e administrado pelo Centro Nacional de Inovação da Saúde para KGC e LT (NHIC-12D-1409007).

Todas as amostras oculares utilizadas neste estudo foram coletadas da Dry Eye Clinic no Singapore National Eye Center, aprovado pelo SingHealth Centralized Institutional Review Board e o Nanyang Technological University Institutional Review Board, em Cingapura. NOTA: Os indivíduos foram submetidos a testes clínicos para avaliar a extensão da inflamação e a gravidade da disfunção lacrimal antes da IC. Os testes clínicos incluíram o tempo de ruptura de lágrima não-invasivo (NI-TBUT) 14 e a vermelhidão conjuntival (hiperemia) 15 , 16 avaliados com um instrumento de diagnóstico, teste de Schirmer 17 , questionário padrão de avaliação de pacientes com secura (SPEED) 18 e córnea Manchas 19 . 1. Coleta de amostras oculares por IC <ol><li> Após a determinação do estado clínico, anestesiarOs olhos do participante aplicando 1 a 2 gotas de anestesia tópica, cloridrato de proparacaina, a conjuntiva bulbar superior e fórnix inferior. Aguarde 4 a 5 minutos para que a sensação de ardência do anestésico se desgaste. </li><li> Coletar amostras de conjuntiva bulbar nasal e temporal com dois dispositivos de citologia de impressão. NOTA: Um dispositivo é usado para a coleta de duas amostras de impressão. Aqui, foram utilizados dois dispositivos para a coleta de quatro membranas de impressão. <ol><li> Posicione o dispositivo de citação de impressão tangencialmente na conjuntiva. Pressione o botão suavemente e segure por 2 a 3 s. NOTA: O dispositivo vem com a membrana. A pressão é liberada automaticamente depois de pressionar o botão. Demora apenas alguns segundos para liberar a pressão e remover o dispositivo. </li></ol></li><li> Libere a membrana para um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de meio de cultura (meio do Instituto Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% de soro bovino fetal(FBS) + 1% de penicilina-estreptomicina (Pen Strep)) por um bisturi. </li><li> Isolar células da membrana do dispositivo por raspagem contínua durante cerca de 1 min com uma ponta de pipeta de 10 μL. NOTA: A raspagem é completada quando a superfície da membrana se torna desigual. Os números das células de cada membrana são variáveis ​​(100 a 500 células / membrana). Processe as amostras dentro de 2 a 3 horas de coleta. </li></ol> 2. Imunophenotyping Cells por Citometria de Fluxo <ol><li> Centrifugue as células a 400 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente para remover a mídia. Ressuspender o sedimento celular com 50 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,05% de albumina de soro bovino (BSA)). </li><li> As células manchadas com um painel de anticorpos ( p . Ex. , Violeta brilhante CD3 (BV) 510 (UCHT1), CD4 aloficocianina-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 ficoeritrina (PE) -A, CD45RO PE-cianina 7 (PE- Cy7) -A e marca de célula viva / morte 7-ADD) à temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos noSombrio. Use anticorpos diretamente do estoque de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Para a concentração de anticorpos, use 2,5 μL de CD3-BV510, 1,25 μL de CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD e 10 μL de CCR7-PE. Use células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) para avaliar as diferentes concentrações de anticorpos. Para a titulação, tome a concentração de anticorpos mencionada no protocolo do fabricante e use metade e um quarto da concentração recomendada. Use a concentração mínima de anticorpos para evitar o derramamento em outros canais de fluoroquromo. Foram observados sinais claros com as mencionadas concentrações de anticorpos. A compensação foi realizada testando PBMC inicialmente de acordo com o protocolo mencionado em Williams et al . 20 Para o teste, as PBMCs foram incubadas com o mesmo conjunto de anticorpos usados ​​aqui e compensados ​​pela comparação de manchas de anticorpos únicos e múltiplos. </li><li> Após a incubação periOd, adicione 1 mL de tampão de coloração ao tubo, misture bem e centrifugue a 450 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspender células em 200 μL de tampão de coloração. </li><li> Execute amostras em uma máquina de citometria de fluxo. <ol><li> Antes de adquirir os dados, calibre as tensões do canal do citometro de fluxo com os conjuntos de configuração e rastreamento (CS &amp; T) do citómetro para normalizar a aquisição de dados em dias diferentes de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Abra o software de coleta de dados de citometria de fluxo, clique no botão &quot;Configurar e QC&quot;, escolha o número correto do lote de notas CS &amp; T, carregue as contas e clique no botão &quot;Iniciar&quot;. </li></ol></li><li> Ressuspenda as células com um toque suave no tubo antes de colocar as amostras na máquina. Abra o software de coleta de dados e clique em &quot;Visualizar&quot;. Quando a taxa de limiar é estável, clique em &quot;Adquirir&quot;. Monitorize o nível da amostra e clique em &quot;Parar&quot; quando as amostras estiverem esgotadas. NOTA: Adquira 10.000 eventos por amostra. </lI&gt; <li> Depois de adquirir 10.000 eventos, gere um traço de pontos SSC-A e FSC-A na planilha. <ol><li> Clique no botão &quot;Polygon Gate&quot; e desenhe um gate (este é P1) em todos os eventos com um valor FSC-A&gt; 5 x 10 4 para excluir detritos. Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse no ponto, escolha &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot; e, em seguida, escolha &quot;P1&quot;. Clique no FSC-A no eixo x do gráfico de ponto P1, altere-o para CD3-BV510. Desenhe um &#39;&#39; Portão de polígono &#39;&#39; para escolher a população de CD3 + e nomeie-o &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no FSC-A no eixo x do gráfico de pontos P2 e altere-o para 7-AAD. Desenhe um &#39;&#39; Portão de polígono &#39;&#39; para 7-AAD - população e escolha &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 aqui é CD3 +Células vivas. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no CD3-BV510 no eixo x e CD4-APCH7 no eixo y do gráfico de pontos P3. Desenhe retângulo Gates nos lados superior e inferior do quadrante e escolha &#39;&#39; P4 &#39;&#39; e &#39;&#39; P5 &#39;&#39;, respectivamente. P4 é CD3 + CD4 + ao vivo e P5 são células CD4 + CD4 CD ao vivo. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no CD45RO PE-Cy7 no eixo dos x e no CCR7-PE no eixo y das parcelas P4 e P5. Desenhe &#39;&#39; Quad Gate &#39;&#39; neste gráfico de pontos. NOTA: o lado superior esquerdo, o lado superior direito, o lado inferior direito e os quadrantes inferiores do lado esquerdo aqui são ingênuos, memória central (T CM ), eMemória de ffector (T EM ), células T de efetores diferenciadas (T EMRA ), respectivamente. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Esta é uma técnica fácil, rápida e menos invasiva que pode ser usada nas clínicas ambulatoriais para o perfil imune relativamente rápido, em contraste com as técnicas convencionais, como raspagem, esfregão, pipetagem ou papel filtrante absorvente 1 , 2 . Uma variante desta técnica já está sendo usada em configurações de pesquisa 22 . A aplicação futura da metodologia proposta é para a estratificação do paciente em ensaios clínicos com doenças oculares, especialmente aqueles que requerem imunofenotipagem. Um grande desafio com esta técnica é o número relativamente pequeno de células imunes recuperadas após a coleta e raspagem de impressões. O número total de células T CD3 + recuperadas de quatro impressões por indivíduo variou de ~ 500 a 1000 células. As amostras oculares foram lavadas antes da análise de citometria de fluxo por um número mínimo de vezes para evitar uma perda adicional de célulasS. Os passos críticos e os desafios que permanecem dentro do protocolo são a coleta eficiente de amostras oculares e a raspagem adequada da membrana para atingir números celulares mais elevados. No entanto, é improvável que esta limitação se incline em direção a qualquer fenótipo imune específico. A solução de problemas realizada aqui para maximizar o rendimento das células foi reduzir o número de etapas de lavagem após e antes da incubação de anticorpos. Existem outras limitações para o uso de IC. Em pacientes com superfície ocular gravemente queratinizada ou fibrosa, como na síndrome de Steven Johnson, o rendimento celular pode ser ainda menor que no presente estudo. A proporção de células imunes pode mudar se as amostras forem armazenadas em vez de analisadas no mesmo dia. É difícil prever se determinados tipos de células são mais resistentes ao armazenamento do que outros. Estudos anteriores relataram níveis elevados de expressão de HLA-DR nas células epiteliais conjuntivais 23 , por isso seria interPara avaliar a correlação entre HLA-DR e níveis de células imunes específicas. As células imunes também podem estar associadas ao nível de expressão das quimiocinas. Essas questões devem ser abordadas em estudos futuros.

A citologia de impressão (IC) foi realizada pela primeira vez em 1977 por Thatcher et al . 1 . Eles usaram um disco de impressão plástica para coletar células conjuntivais de pacientes em vez de outras técnicas disponíveis naquela época, como raspagem, esfregaço ou pipetagem 1 . A técnica atual de IC usa um papel de filtro absorvente 2 para imprimir a conjuntiva bulbar e palpebral e coletar a camada mais superficial de células conjuntivais. Essas células, tendo alcançado seu estágio final de diferenciação, são continuamente lançadas em lágrimas 3 . Três grandes populações de células são encontradas em espécimes de IC: células epiteliais 4 , células de cálice 3 , 5 e tecido linfóide associado à mucosa, por exemplo, células T efectoras associadas ao epitélio ou células dendríticas 6 . Células de superfície ocular em IC samAs células podem ser analisadas por microscopia, imunocomposição e reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) 7 . A citometria de fluxo foi recentemente usada para analisar células imunes coletadas por raspagem da membrana IC 8 . Curiosamente, IC 6 , 9 tem sido usado para avaliar muitas doenças da superfície ocular, incluindo sicca de ceratoconjuntivite, deficiência de vitamina A, penfigóto cicatricial, doença atópica, ceratoconjuntivite limbica superior, ceratoconjuntivite vernal e metaplasia escamosa epitelial. O IC também tem sido utilizado para avaliar o impacto do uso de lentes de contato, a detecção de micróbios de superfície ocular e o teste de eficácia terapêutica e tolerância de intervenções terapêuticas em estudos longitudinais 10 , 11 , 12 . O dispositivo médico (EyePrim) é suportado por um tipo de poliA membrana de ethersulfona (PES) de 0,2 μm, que foi previamente validada para a técnica de citologia de impressão ocular com citometria de fluxo (fluxo de OSIC) e abre oportunidades para usar amostras longitudinais para monitorar a progressão da doença e a resposta ao tratamento ( por exemplo , a detalhada Análise de leucócitos intraepiteliais definidos como marcadores de doença putativos para fibrose conjuntival progressiva em penfigóide de mucosas) 13 . Os primeiros pesquisadores usaram filtros de PES autoclavados que exigiam impressão manual. Como resultado, o rendimento era variável e dependente do usuário. A vantagem deste dispositivo médico é a facilidade de uso, a pressão padronizada (Pa ou N / m 2 ), e permite a repetibilidade, reprodutibilidade e recuperação celular constante. Esta técnica é útil em uma clínica ambulatorial porque não é cirúrgica, fácil de executar e rápida. Este é um dispositivo médico Classe I (estéril) de acordo com a diretiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Exige apenasS anestesia tópica durante o procedimento, o que garante a manutenção da integridade da superfície ocular. Após IC, as células podem ser processadas imediatamente para citometria de fluxo. Além disso, é possível que técnicos e enfermeiros que não sejam oftalmologistas sejam treinados para provar a superfície ocular. Apesar da melhoria do IC sobre outras técnicas, ainda existem vários desafios. Por exemplo, pode haver variação devido à área da amostragem e diferenças regionais na conjuntiva bulbar dependendo da posição do IC. Outra fonte de variação é devido à aplicação de diferentes quantidades de pressão durante IC. Outras questões metodológicas envolvem a padronização do processamento celular: envolvem duração e método de fixação e as condições de armazenamento possível, o que pode afetar a estabilidade do material amostrado. O objetivo geral desta técnica é desenvolver um método de isolamento das amostras de impressão ocular queT é fácil de usar, não invasivo e pode ser aplicado à caracterização imunológica das amostras clínicas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysis software</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

Tradicionalmente, a citologia de superfície ocular é estudada com técnicas como tecnologia de espátula e tecnologia de escova. O problema com estas técnicas é que eles podem induzir lesões traumáticas na superfície do olho, que podem progredir para cicatrizes, deformidades das pálpebras, deficiência de células estaminais e, em alguns casos, causar grande desconforto ao sujeito. Para evitar esses problemas clínicos, a citologia de impressão (IC) foi desenvolvida para diagnosticar doença ocular seca e posterior neoplasia, doença atópica, ceratoconjuntivite vernal e ceratoconjuntivite sicca. Normalmente, os clínicos cortaram manualmente os papéis de filtro em formas necessárias e aplicam-nas na superfície ocular. Aqui, descrevemos como realizar IC usando um dispositivo médico comercialmente disponível. Esta técnica é explicada aqui seguida pela imunofenotipagem por citometria de fluxo. Esta técnica requer menos manuseio manual e causa menor prejuízo para a superfície ocular.

IC por este dispositivo clínico nos permitiu isolar células imunes superficiais oculares, mantendo a superfície ocular intacta. A Figura 1 descreve como o IC foi realizado. Os diferentes locais do olho de onde as amostras foram coletadas são marcados. A Figura 2 mostra o resultado representativo da citometria de fluxo coletada de 10 controles saudáveis. Para o bloqueio, use SSC e 7-AAD para distinguir entre células vivas e células mortas. As células 7-AAD são identificadas como células vivas. Essas células vivas são ainda caracterizadas por marcadores CD3 + e CD4 + . Além disso, as populações CD4 + e CD4 foram ainda mais caracterizadas como Naïve, T EM , T CM e T EMRA com os marcadores CCR7 e CD45RO. Entre as células T CD3 +, as células T de memória efector predominam na superfície ocular humana. No anterior eXperimentos, também foi demonstrado que as células de memória CD8 + são as principais populações nas células T epiteliais conjuntivais entre os indivíduos saudáveis 20 . A Figura 3 mostra que as células T de memória efetora CD4 + e CD8 + (T EM e T EMRA ) são o subconjunto principal na superfície ocular humana em 10 controles saudáveis ​​estudados. Cada população mencionada na figura é notificada com seu marcador fenotípico e nomes (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Os números em vermelho indicam a porcentagem da população. Os dados nesta figura são representados como média ± SEM <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figura 1: Recolha de amostras de IC da superfície ocular pelo dispositivo de citologia de impressão. As amostras foram coletadas da lâmpada temporalComo é mostrado. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figura 2: Dot Plot Graph usando Citometria de Fluxo. As células Live 7-AAD foram selecionadas. As células CD3 + foram primeiro fechadas e, em seguida, esta população foi fechada em subconjuntos CD4 + e CD4. As proporções de subconjuntos naïve (CCR7 + CD45RO - ), memória central (CCR7 + CD45RO + ) e efector memory (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) foram determinadas com a ajuda dos marcadores CCR7 e CD45RO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FFigura 3: Sub-tipos de células imunes em células T CD4 + e CD8 + de Superfície Ocular Humana Saudável. Distribuição de subconjuntos conjuntivais CD4 + e CD8 + naïve, memória central (T CM ) e efetor (T EM e T EMRA ) em controles humanos saudáveis; Cada ponto de dados representa uma média individual separada ± SEM mostrada. A porcentagem da população é marcada como vermelha abaixo do nome de cada uma das populações. A porcentagem total da população é de 98%, porque a população de CD4 + T EMRA não foi incluída no diagrama de dispersão mencionado (modificado de Bose et al., 21 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K visualizações.  Nanyang Technological University.  A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva. 

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bioengenharia

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

A citologia de impressão da Área Wiper a tampa

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

Medicina

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular surface gland network. Meibomian glands (MG) secrete lipids that create a covering layer that prevents the evaporation of the aqueous part of the tear film. Neutrophils and extracellular DNA traps populate MG and the ocular surface in a mouse model of allergic eye disease. Aggregated neutrophil extracellular traps (aggNETs) formulate a mesh-like matrix composed of extracellular chromatin that occludes MG outlets and conditions MG dysfunction. Here, a method for inducing ocular surface inflammation and MG dysfunction is presented. The procedures for collecting organs related to the ocular surface, such as the cornea, conjunctiva, and eyelids, are described in detail. Using established techniques for processing each organ, the major morphological and histopathological features of MG dysfunction are also shown. Ocular exudates offer the opportunity to assess the inflammatory state of the ocular surface. These procedures enable the investigation of topical and systemic anti-inflammatory interventions at the preclinical level.

Ocular surface inflammation harms the ocular surface tissues and compromises vital functions of the eye. The present protocol describes a method to induce ocular inflammation and collect compromised tissues in a mouse model of Meibomian gland dysfunction (MGD).

Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

Um protocolo para isolar, cultivar e identificar células de nicho límbico humano

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

Autor em destaque: Padronizando o isolamento e a caracterização de células de nicho límbico (LNC) para apoiar a pesquisa generalizada de LNC 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Biologia

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Resumo

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Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

A citologia de impressão da Área Wiper a tampa

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais