著者は技術的なステップを支援してくれたNandini NallappanとSharon Yeoに感謝したいと思います。この研究は、Lee Kong Chian School of Medicine、Nanyang Technological UniversityからのKGCへのスタートアップグラント、シンガポール保健省のNational Medical Research Council（NMRC）からLT（NMRC / CSA / 045/2012）およびNMRCの助成金により、KGCおよびLT（NHIC-12D-1409007）に国立衛生イノベーションセンターによって管理されている。

この研究で使用されたすべての眼球試料は、SingHealth Centralized Institutional Review BoardとSingapore Nanyang Technological University Institutional Review Boardによって承認されたシンガポール国立眼センターのドライアイクリニックから収集されました。 注：被験者は、ICを実施する前に、炎症の程度および涙の機能障害の重篤度を評価するために臨床試験を受けた。臨床試験には、非侵襲的涙液分泌時間（NI-TBUT） 14および結膜の赤み（hyperemia） 15,16が含まれ、診断装置、Schirmerの試験17 、標準的患者の眼乾燥（SPEED）質問18 、および角膜染色19 。 ICによる眼球試料の採取<ol><li>臨床状態の決定後、麻酔上眼球結膜と下眼円蓋に1〜2滴の局所麻酔薬、塩酸プロパラカインを適用することにより、参加者の眼を刺激する。麻酔薬の刺すような感覚が消えるまで4〜5分待ちます。 </li><li> 2つの印象細胞学装置を用いて、鼻および眼球結膜結膜から試料を採取する。 注記：2つのインプレッションサンプルの収集に1つのデバイスが使用されます。ここでは、4つの印象膜の収集のために2つの装置を使用した。 <ol><li>印象細胞学装置を結膜上に接線方向に配置する。プッシュボタンを静かに押し、2〜3秒間押し続けます。 注記：デバイスにはメンブレンが付属しています。ボタンを押すと自動的に圧力が解放されます。圧力を解放して装置を取り外すのに数秒しかかかりません。 </li></ol></li><li> 1mLの培養培地（ロズウェルパークメモリアルインスティチューション培地（RPMI）+ 10％ウシ胎仔血清（FBS）+ 1％ペニシリン - ストレプトマイシン（Pen Strep））をメスにより投与した。 </li><li> 10μLのピペットチップで約1分間連続掻爬することにより、デバイスの膜から細胞を分離する。 注記：膜の表面が不均一になると削り取りが完了します。各膜からの細胞数は可変である（100〜500細胞/膜）。収集の2〜3時間以内に試料を処理する。 </li></ol> 2.フローサイトメトリーによる細胞の免疫表現型解析<ol><li>培地を除去するために、室温で5分間400xgで細胞を遠心分離する。フローサイトメトリー染色バッファー（リン酸緩衝食塩水（PBS）+ 0.05％ウシ血清アルブミン（BSA））50μLで細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> CD4アロフィコシアニン-H7（APC-H7）（SK3）、CCR7フィコエリトリン（PE）-A、CD45RO PE-シアニン7（PE- Cy7）-A、および生存/死細胞マーカー7-ADD）を室温で20〜30分間、ダーク。製造元のプロトコールに従って、ストックから抗体を直接使用する。 注：抗体濃度は、CD3-BV510 2.5μL、CD4-APC-H7、CD45RO-PE-Cy7、7-AAD 1.25μLおよびCCR7-PE 10μLを使用してください。末梢血単核細胞（PBMC）を使用して、異なる濃度の抗体を滴定する。滴定には、メーカーのプロトコールに記載されている抗体濃度を使用し、推奨濃度の1/2を使用する。抗体の最小濃度を使用して、他の蛍光色素チャネルへのこぼれを避ける。上記の抗体濃度では、明確なシグナルが観察された。この補償は、当初、Williams et al 。試験のために、PBMCをここで使用した同じセットの抗体と共にインキュベートし、単一および複数の抗体染色を比較することによって補正した。 </li><li>インキュベーション後、ペリチューブに染色バッファー1 mLを添加し、よく混合し、450 xgで5分間室温で遠心分離する。 200μLの染色バッファーに細胞を再懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリー機でサンプルを分析する。 <ol><li>データを取得する前に、サイトメーターセットアップおよびトラッキング（CS＆T）ビーズでフローサイトメーターチャネル電圧を較正して、メーカーの指示に従って異なる日にデータ収集を標準化します。 <ol><li>フローサイトメトリーデータ収集ソフトウェアを開き、 &quot;Set up＆QC&quot;ボタンをクリックし、正しいCS＆Tビーズロット番号を選択し、ビーズをロードして、 &quot;Start&quot;ボタンをクリックします。 </li></ol></li><li>サンプルを装置にロードする前に、チューブを静かにタップして細胞を再懸濁します。データ収集ソフトウェアを開き、[プレビュー]をクリックします。閾値率が安定したら、「取得」をクリックします。サンプルがなくなると、サンプルレベルを監視し、「停止」をクリックします。 注：1サンプルにつき10,000のイベントを取得します。 </li&gt; <li> 10,000イベントを取得した後、ワークシートにSSC-AおよびFSC-Aドットプロットを生成します。 <ol><li> 「ポリゴンゲート」ボタンをクリックし、FSC-A値&gt; 5 x 10 4のすべてのイベントにゲート（これはP1）を描き、デブリを除外します。 &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開き、 &quot;P1&quot;を選択します。 P1ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、CD3-BV510に変更します。 「ポリゴンゲート」を描き、CD3 +の母集団を選択し、それを「P2」と命名します。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 P2ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、7-AADに変更します。 7-AAD母集団のための「ポリゴンゲート」を描き、「P3」を選択します。ここでのP3はCD3 +生きている細胞。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 x軸のCD3-BV510をクリックし、P3ドットプロットのy軸のCD4-APCH7をクリックします。四角形の上辺と下辺にそれぞれ「P4」と「P5」を選択します。 P4は生CD3 + CD4 +であり、P5は生CD3 + CD4 - T細胞である。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 x軸上のCD45RO PE-Cy7をクリックし、P4とP5の両方のプロットのy軸上のCCR7-PEをクリックします。このドットプロットで「クアッドゲート」を描く。 注：ここでは、左上、右上、右下、左下の四分円はナイーブな中央メモリ（T CM ）、e（T EM ）、最終分化したエフェクターメモリー（T EMRA ）T細胞である。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

これは、スクレイピング、拭き取り、ピペッティングまたは吸収性濾紙1,2のような従来の技術とは対照的に、比較的迅速な免疫プロファイリングのために外来診療所で使用することができる、簡単で迅速かつ侵襲性の低い技術である。この技術の変種はすでに研究セッティング22で使用されています。提案された方法論の将来の適用は、眼疾患、特に免疫表現型検査を必要とする臨床試験における患者層別化である。 この技術の主な課題は、印象採取および掻爬後に回収される比較的少ない免疫細胞である。個体当たり4回のインプレッションから回収されたCD3 + T細胞の総数は、約500〜1,000個の細胞から変動した。眼球試料をフローサイトメトリー分析の前に最小限の回数洗浄して、さらなる細胞喪失を回避したs。プロトコール内に残る重要なステップおよび課題は、より高い細胞数を達成するために、眼球サンプルの効率的な収集および膜の適切な掻爬である。それにもかかわらず、この制限は特定の免疫表現型に偏っているとは考えにくい。細胞の収率を最大にするためにここで行われたトラブルシューティングは、抗体のインキュベーションの前後の洗浄工程の数を減らすことであった。 ICの使用には他の制限があります。スティーブンジョンソン症候群のような重度の角質化または線維化した眼球表面を有する患者では、細胞収量は本研究のそれよりも少なくてもよい。免疫細胞の割合は、試料が同じ日に分析される代わりに保存される場合に変化し得る。ある種の細胞型が他の細胞型よりも貯蔵に耐性があるかどうかを予測することは困難である。以前の研究では、結膜上皮細胞におけるHLA-DR発現レベルの上昇が報告されているため、HLA-DRと特異的免疫細胞のレベルとの間の相関を評価するために評価した。免疫細胞はまた、ケモカインの発現レベルと関連し得る。これらの問題は今後の研究で取り上げられるべきである。

印象細胞学（IC）は1977年にThatcher et al 。彼らは、スクラップ、拭き取り、またはピペッティングなど、その時に利用可能な他の技術の代わりに、患者から結膜細胞を収集するためにプラスチック印象ディスクを使用した1 。 ICの現在の技術は、吸収性濾紙2を用いて球膜および眼瞼結膜を刻印し、結膜細胞の最も表面の層を集める。分化の最終段階に達したこれらの細胞は、連続して涙を流す3 。上皮細胞4 、杯細胞3,5 、および粘膜関連リンパ組織（上皮関連エフェクターT細胞または樹状細胞6）の 3つの主要な細胞集団がIC標本に見出される。 ICSAMにおける眼球表面細胞プレートは、顕微鏡検査、免疫ブロッティングおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 7によって分析することができる。最近、ICメンブレン8を擦って集めた免疫細胞の解析にフローサイトメトリーが使用されています。興味深いことに、IC 6,9は、乾性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、瘢痕性食細胞性アポトーシス、アトピー性疾患、上肢角結膜炎、春季角結膜炎および上皮性扁平上皮化生を含む多くの眼表面疾患の評価に使用されている。 ICはまた、コンタクトレンズの装着、眼球表面の微生物の検出、および縦走試験10,11,12における治療的介入の治療有効性および耐性の試験の影響を評価するために使用されている。 医療機器（EyePrim）は、ポリフローサイトメトリー（OSIC-フロー）による眼の印象細胞学の技術について以前に検証されており、縦走サンプリングを使用して疾患の進行および処置に対する応答（ 例えば 、詳細粘膜膜類天疱瘡における進行性結膜線維症の推定上の疾患マーカーとして定義される上皮内白血球の分析） 13 。初期の研究者は、手動印象を必要とするオートクレーブされたPESフィルターを使用した。その結果、利回りは変動し、ユーザーに依存していました。この医療用具の利点は、使いやすさ、標準化圧力（PaまたはN / m 2 ）であり、再現性、再現性および一貫した細胞回復を可能にする。この技術は外科手術ではなく、容易に実施でき、迅速であるため、外来診療所で有用である。これは、指令93/42 / CEE、CE 0499（SNCH）に従ったクラスI（無菌）医療機器です。必要なのは眼球表面の完全性の維持を確実にする処置中の局所麻酔である。 ICに続いて、細胞をフローサイトメトリーのために直ちに処理することができる。さらに、非眼科技術者および看護師が眼表面をサンプリングするように訓練されることが可能である。 他の技術に対するICの改善にもかかわらず、いくつかの課題が残っている。例えば、ICの位置に応じて、サンプリング領域および眼球結膜における地域差に起因する変動が存在し得る。変動の別の原因は、IC中に異なる量の圧力を印加することによるものである。その他の方法論的問題には、細胞処理の標準化が含まれる：これらには、持続期間および固定方法、およびサンプリングされた材料の安定性に影響を与える可能性のある貯蔵条件が含まれる。 この技術の全体的な目標は、眼の印象サンプルの分離方法を開発することである。tは使いやすく、非侵襲性であり、臨床サンプルの免疫学的特徴付けに適用することができる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysis software</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

伝統的に、眼表面細胞学は、スパチュラ技術およびブラシ技術などの技術を用いて研究されている。これらの技術の問題点は、眼の表面に外傷性の病変を誘発し、瘢痕化、眼瞼変形、角膜幹細胞欠損症に進行し、場合によっては被験者に大きな不快感を引き起こす可能性があることである。これらの臨床上の問題を回避するために、乾性眼疾患およびその後の新形成、アトピー性疾患、春季角結膜炎および乾性角結膜炎を診断するための印象細胞学（IC）が開発された。典型的には、臨床医は手動で濾紙を必要な形状に切断し、これらを眼の表面に適用する。ここでは、市販の医療機器を使用してICを実行する方法について説明します。この技術は、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析の後に続いて説明される。この技法は、手作業の取り扱いが少なくて済み、眼表面の損傷をより少なくする。

この臨床装置によるICにより、眼表面を損なわずに眼球表面免疫細胞を単離することができた。 図1は、ICの実行方法を示しています。サンプルが収集された眼の異なる部位がマークされる。 図2は、10人の健常対照から収集したフローサイトメトリーの代表的な結果を示す。ゲーティングには、生細胞と死細胞を区別するためにSSCと7-AADを使用します。 7-AAD -細胞は生細胞として同定される。これらの生細胞は、CD3 +およびCD4 +マーカーによってさらに特徴付けられる。さらに、CD4 +およびCD4 -集団は、それぞれ、CCR7およびCD45ROマーカーを有するNaive、T EM 、T CMおよびT EMRAとしてさらに特徴付けられた。 CD3 + T細胞の中では、エフェクターメモリーT細胞がヒトの眼の表面で優勢である。以前のeではまた、CD8 +記憶細胞は、健常個体20の結膜上皮T細胞の主要な集団であることも示されている20 。 図3は、研究された10人の健常対照において、CD4 +およびCD8 +エフェクターメモリーT細胞（T EMおよびT EMRA ）がヒト眼表面の主要なサブセットであることを示す。図に記載された各集団は、マーカー表現型および名前（Naive、T CM 、T EM 、T EMRA ）で通知される 。赤い数字は人口の割合を示します。この図のデータは、平均±SEM <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> 図1：インプレッションサイトロジーデバイスによる眼球表面からのICサンプルの収集。側球から試料を採取したar領域を含む。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> 図2：フローサイトメトリーを用いたドットプロットグラフ。ライブ7-AAD -細胞を選択した。 CD3 +細胞を最初にゲーティングし、次いでこの集団をCD4 +およびCD4 -サブセットにゲートした。ナイーブ（CCR7 + CD45RO - ）、中央記憶（CCR7 + CD45RO + ）およびエフェクター記憶（CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ）サブセットの割合は、CCR7およびCD45ROマーカーの助けを借りて決定された。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> F図3：健康なヒト眼球表面のCD4 +およびCD8 + T細胞における免疫細胞サブタイプ。健康なヒトコントロールにおける結膜のCD4 +およびCD8 +ナイーブ、セントラルメモリー（T CM ）、およびエフェクターメモリー（T EMおよびT EMRA ）サブセットの分布 ;各データ点は、別個の平均±SEMを示す。母集団の割合は、各母集団の名前の下に赤色で表示されます。 CD4 + T EMRA集団は、前述の散布図に含まれていないため（Bose ら 21から改変されている）、集団の総百分率は98％である。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K ビュー.  Nanyang Technological University. 露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。 

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

免疫・感染学

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

生物工学

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

蓋ワイパーエリアの印象細胞診

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

医学

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

マウスにおける結膜経月の分離と同定

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular surface gland network. Meibomian glands (MG) secrete lipids that create a covering layer that prevents the evaporation of the aqueous part of the tear film. Neutrophils and extracellular DNA traps populate MG and the ocular surface in a mouse model of allergic eye disease. Aggregated neutrophil extracellular traps (aggNETs) formulate a mesh-like matrix composed of extracellular chromatin that occludes MG outlets and conditions MG dysfunction. Here, a method for inducing ocular surface inflammation and MG dysfunction is presented. The procedures for collecting organs related to the ocular surface, such as the cornea, conjunctiva, and eyelids, are described in detail. Using established techniques for processing each organ, the major morphological and histopathological features of MG dysfunction are also shown. Ocular exudates offer the opportunity to assess the inflammatory state of the ocular surface. These procedures enable the investigation of topical and systemic anti-inflammatory interventions at the preclinical level.

Ocular surface inflammation harms the ocular surface tissues and compromises vital functions of the eye. The present protocol describes a method to induce ocular inflammation and collect compromised tissues in a mouse model of Meibomian gland dysfunction (MGD).

眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

ヒト辺縁ニッチ細胞を分離、培養、および同定するためのプロトコール

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

著者スポットライト:広範なLNC研究をサポートするためのLimbal Niche Cell(LNC)の単離と特性評価の標準化(英語) 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

生物学

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

イン・ビトロ 結膜杯細胞の性差を研究する方法

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

要約

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表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

蓋ワイパーエリアの印象細胞診

マウスにおける結膜経月の分離と同定

眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

イン・ビトロ結膜杯細胞の性差を研究する方法

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

要約

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表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

蓋ワイパーエリアの印象細胞診

マウスにおける結膜経月の分離と同定

眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離

イン・ビトロ 結膜杯細胞の性差を研究する方法

イン・ビトロ結膜杯細胞の性差を研究する方法